1 Ekotoxikologické biotesty Půdní biotesty RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. 2 Půdní biotesty Testy s půdními organismy Matrice je půda (solid phase) Cíl: chránit půdu a půdní biotu před účinky chemických látek a dalšími stresory Proč? Půda je nepostradatelná složka přírody, základna pro růst rostlin, zásobárna živin, počátek a konec potravních řetězců a cyklů prvků, filtrační a dekontaminační zóna 3 Proč ekotoxikologické testy ? CHEMICKCHEMICKÉÉ ANALÝZY samotnANALÝZY samotnéé NEDOKNEDOKÁÁŽŽOUOU postihnout repostihnout reáálnlnéé riziko proriziko pro žživivéé organismy:organismy: 1)1) rereáálnlnáá expozice se liexpozice se lišíší podlepodle biodostupnostibiodostupnosti toxickýchtoxických prvkprvkůů a la láátek v dantek v danéé situaci,situaci, 2)2) jde vjde vžždy ody o smsměěs toxikants toxikantůů, kter, kteráá ppůůsobsobíí jinak nejinak nežž jednotlivjednotlivéé toxikantytoxikanty zvzvášášťť 3)3) NegativnNegativníí vlivy matricevlivy matrice samotnsamotnéé bez ohledu na obsahbez ohledu na obsah toxikanttoxikantůů nana žživivéé organismyorganismy čči interakce vlivu matrice si interakce vlivu matrice s efekty toxikantefekty toxikantůů 4)4) spektrum analytických metod (tedy i limitnspektrum analytických metod (tedy i limitníích hodnot) jech hodnot) je omezenomezenéé a ve vzorku mohou být pa ve vzorku mohou být přříítomnytomny neanalyzovanneanalyzovanéé významnvýznamněě toxicktoxickéé lláátky.tky. 4 Proč testy kontaktní (půdní) ? Účinky na půdní organismy exponované v pevné matrici nelze zcela extrapolovat z testů akvatických Do hry vstupuje významně osud kontaminantu v půdním prostředí, vliv na reálnou biodostupnost pro půdní organismy Nezanedbatelné vlivy samotné matrice (např. nevhodné fyz.- chem. vlastnosti, kombinace s toxicitou) 5 Důsledky expozice v pevné matrici Pevné matrice jsou dosti heterogenní Obsahuje vždy všechny tři fáze PEVNOU, KAPALNOU (pórová voda) a PLYN (vzduch) Přítomnost pevné fáze zejména má významný vliv na OSUD a CHOVÁNÍ chemické látky V závislosti na vlastnostech látky, vlastnostech půdy a čase dojde k DISTRIBUCI látky v půdě, případně vzniku SPECIÍ Stěžejním procesem je SORPCE a důsledkem je klíčový faktor půdních testů (eko)toxicity ­ BIODOSTUPNOST To vše má fatální důsledky pro výslednou toxicitu a riziko Důsledkem je i ztížená extrapolace mezi půdami, z akvatických testů na půdní a z laboratorních testů na reálnou situaci 6 Schéma expozice v půdním prostředí Vstup POLUTANTU ORGANISMUSORGANISMUS Polutant v organismu Metabolismus, eliminace, efekty POLUTANT v půdě prostorově distribuován a v různých formách OSUD a chování v půdě je funkce: vlastnosti půdy vlastnosti látky EXPOZICE je funkce: osudu polutantu v půdě + vlastností organismu (morfologie, fyziologie, ekologie ...) BIODOSTUPNOST BIODOSTUPNOST 7 Které vlastnosti matrice jsou kritické Obsah organické hmoty ­ OM, TOC Obsah jílovitých částic ( < 10 m) Kationtová výměnná kapacita pH Vlhkost Struktura půdy Čas 8 Využití půdních biotestů v ochraně půd 9 Využití půdních biotestů při ochraně půd Zakotvení v legislativě = PROČ mají půdní biotesty své místo na slunci Do teď zejména při hodnocení nebezpečnosti chemických látek a pesticidních přípravků Silný nárůst zájmu o využití biotestů při hodnocení komplexních směsí jako jsou odpady, kal ČOV, sedimenty, komposty, hnojiva apod. Velký potenciál biotestů při hodnocení kvality půd např. před a po remediaci, při inventůře kontaminovaných ploch apod. 10 Legislativa vs půdní biotesty - ČR 1) CHEMICKÉ LÁTKY Zákon č. 356/2003 Sb., O chemických látkách a chemických přípravcích a jeho prováděcí vyhláška č. 222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí (ve znění ve znění vyhlášky č. 389/2005 Sb.) Jako povinné ekotoxikologické testy jsou uvedeny (včetně metodiky): akutní test se žížalou E. fetida testy efektů na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci dusíku a uhlíku test efektů na aerobní a anaerobní transformace v půdě Jde v podstatě o přeložené metodiky OECD testů 11 Legislativa vs půdní biotesty - ČR 2) PESTICIDY Zákon č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a jeho prováděcí vyhláška č. 329/2004 Sb., o přípravcích a dalších prostředcích na ochranu rostlin Příloha 1: Seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku Příloha 2: seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné látky S půdními biotesty souvisí požadavek na zhodnocení vlivů na: necílové suchozemské členovce (dle metodiky SETAC/ESCORT) žížaly (akutní, reprodukce a pokud potřeba i polní test) mikroorganismy (dle metodiky SETAC) Vyhláška č. 327/2004 Sb., ochrana včel, zvěře, vodních organismů před přípravky na ochranu rostlin Definuje skupinu prospěšných, necílových členovců = beneficial, non-target arthropods Definuje skupinu půdních organismů Neobsahuje doporučení konkrétních testů 12 Legislativa vs půdní biotesty - ČR 3) ODPADY, HNOJIVA A DALŠÍ ... Zákon 185/2001 Sb., o odpadech a jeho prováděcí vyhláška č. 376/2001 Sb., o hodnocení nebezpečných vlastností odpadů (stejně jako EU pod kódem H14 je zde ekotoxicita) Definuje hodnocení účinků na vyšší rostliny Test inhibice růstu kořene hořčice bílé výluhem odpadu (Metodika v Metodickém pokynu MŽP ke stanovení ekotoxicity odpadů - Zpravodaj MŽP 12/1998) Kontaktní testování odpadů bylo dosud opomíjeno, ač má pro pevné odpady nesrovnatelně vyšší vypovídací schopnost, zejména v případě kalů, sedimentů, stavebních odpadů apod. Hnojiva ­ pouze obecně definováno, že nesmí mít negativní vliv Vyhláška č. 257/2009 Sb., O používání sedimentů na zemědělské půdě: chvostoskok, roupice, rostlina a mikroorganismy 13 Legislativa vs půdní biotesty - EU Council Directive 2001/59/EC adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances Příloha V obsahuje metody včetně ekotoxikologických biotestů s žížalami a půdními mikroorganismy dle směrnic OECD Council Regulation (EEC) 793/93 on the evaluation and control of the risks of existing substances Regulation (EC) 1907/2006 of the European Parliament and of the Council concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) Technical Guidance Document on Risk Assessment. Part II: Environmental Risk Assessment. European Chemical Bureau, Luxembourg (2003) = TGD 14 Legislativa vs půdní biotesty - EU COUNCIL DIRECTIVE 91/414/EEC of 15 July 1991 concerning the placing of plant protection products on the market Příloha 1 - seznam účinných látek hodnocených na evropské úrovni, které byly seznány, že rizika jsou přijatelná a není třeba je dále hodnotit na národní úrovni Příloha 2 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné látky Příloha 3 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku Příloha 61 - podle čeho a jak se hodnotí na základě EC2 a SETAC3 metodik. Povinnými testovacími druhy necílových členovců jsou Typhlodromus pyri (dravý roztoč), Aphidius rhapalosiphi (lumčík), Chrysoperla carnea (zlatoočka), Coccinela septempunctata (slunéčko), Aleochara bilineata, Poecilus cupreus (střevlík), Orius laevigatus (klopuška), Hypoaspis aculeifer 1. Guidance document on Terrestrial Ecotoxicology in the context of Directive 91/414/EEC (SANCO/10329/2002) 2. Council Directive 97/57/EC of 22 September 1997 establishing Annex VI to Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market 3. Guidance Document on Regulatory Testing and Risk Assessment Procedures for Plant Protection Products with Non-Target Arthropods. From the ESCORT 2 Workshop (European Standard Characteristics of Non-Target Arthropod Regulatory Testing). Ed: MP Candolfi, KL Barrett, PJ Campbell, R Forster, N Grandy, M-C Huet, G Lewis, PA Oomen, R Schmuck, H Vogt. SETAC-Europe 15 Legislativa vs půdní biotesty - EU Směrnice 91/689/EEC o nebezpečném odpadu a seznamu odpadů (rozhodnutí 2000/532/EC) Rozhodující je 14 kriterií, která jsou odvozena z legislativy o nebezpečných látkách. Kritérium H14 značí ,,ekotoxické vlastnosti" - odpady, které představují nebo mohou představovat akutní nebo pozdní nebezpečí pro jednu nebo více složek životního prostředí. Zatím není definován odkaz k žádné metodě a ani v seznamu odpadů nejsou ekotoxické vlastnosti blíže specifikovány pro rozhodnutí, zda se jedná či nejedná o nebezpečný odpad. Příloha III direktivy 91/689/EEC pouze uvádí, že testovací metody by měly korespondovat s metodami legislativy pro chemické látky a dalšími doporučeními OECD. Standard EN 14735 definuje přípravu a nakládání se vzorky odpadů pro ekotoxikologické testy. V příloze B je obsažen i seznam použitelných ekotoxikologických testů. Z půdních jsou zde roupice, žížaly, chvostoskoci a rostliny 16 Cíle: zhodnotit standard EN 14735 vyhodnotit aplikovatelnost baterie testů Výstupy: Kniha, report a zejména příprava nového EN standardu: WI 292050: Characterisation of waste ­ Guidance on the use of ecotoxicity tests applied to waste 13 zemí 59 laboratoří 5 základních testů 9 přídavných testů půl tuny odpadů (3 vzorky) EU ringtest 2006-2007 17 EU - Základní sada testů 18 EU - Rozšířená sada testů 19 Příprava nové legislativy v ČR Aktivity CeHO MZP0002071102 - Výzkum pro hospodaření s odpady v rámci ochrany životního prostředí a udržitelného rozvoje Porovnání 18 testů na 18 odpadech Vybraná sada testů: Test toxicity na perloočkách: ČSN EN ISO 6341 Test toxicity na řasách: ČSN EN ISO 8692 Test zhášení bioluminiscence baktérií: ČSN EN ISO 11348-1-3 Test reprodukční toxicity na chvostoskocích: ISO 11267 Test reprodukční toxicity na roupicích: ISO 16387 Test inhibice růstu kořenů suchozemských rostlin: ISO 11269-1 ISO 11269-1 (1993) ISO 16387 (2004) ISO 11267 (1999) 20 Dostupné standardní postupy půdních biotestů 21 Půdní potravní síť vs dostupné biotesty Earthworms, Enchytraeids 22 Standardy půdních biotestů - OECD Predatory Mite Reproduction Test in Soil (Hypoaspis (Geolaelaps) Aculeifer) 2009 Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies (Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae)) 2009 Drafts Bioaccumulation test with Eisenia fetida 2009 Collembola reproduction test with Folsomia candida and F. fimetaria 2009 227 Terrestrial Plant Test: Vegetitive Vigour Test (19th July 2006) 222 Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) (13th April 2004) 220 Enchytraeid Reproduction Test (13th April 2004) 217 Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test (21st January 2000) 216 Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test (21st January 2000) 208 Terrestrial Plants, Growth Test (19th July 2006) 207 Earthworm, Acute Toxicity Tests (4th April 1984) Accepted standards 23 Standardy půdních biotestů - ISO Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 2: Determination of effects on reproduction1998ISO 11268-2 Sampling of soil invertebrates ­ Part 1 ­ 6 (earthworms, microarthropods, enchytraeids, nematodes, macrofauna, design of field studies) 2006 - 2010 ISO 23611 (1-6) Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials2003ISO 15799 Soil quality -- Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -- Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida) ISO/DIS 17512- 2 Avoidance test for testing the quality of soils and effects of chemicals on behaviour - Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei) 2008ISO 17512-1 Chronic toxicity in higher plants2005ISO 22030 Soil quality -- Assessment of genotoxic effects on higher plants -- Micronucleus test on ViciaISO/AWI 29200 Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants 2005ISO 11269-2 Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 1: Method for the measurement of inhibition of root growth 1993ISO 11269-1 Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda) ISO/FDIS 10872 Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) - Determination of the effects on growth by soil contamination2006ISO 15952 Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) - Determination of acute toxicity2005ISO 20963 Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival2004ISO 16387 Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants1999ISO 11267 Effects of pollutants on earthworms - Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations1999ISO 11268-3 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate 1993ISO 11268-1 Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxicological characterization of soils and soil materials2008ISO 17616 24 Standardy půdních biotestů - ISO Determination of soil microbial diversity - Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis ISO/DTS 29843-1 Determination of dehydrogenase activity in soils - Part 2: Method using iodotetrazolium chloride (INT)2005ISO 23753-2 Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates2010ISO/TS 22939 Method to directly extract DNA from soil samplesISO/CD 11063 Effects of pollutants on mycorrhizal fungi -- Spore germination test2009ISO/TS 10832 Determination of dehydrogenase activity in soils - Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC)2005ISO 23753-1 Determination of soil microbial diversity - Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the "simple PLFA extraction method" ISO/DTS 29843-2 Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation2004ISO 15685 Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves2002ISO 17155 Laboratory methods for determination of microbial soil respiration2002ISO 16072 Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method1997ISO 14240-2 Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method1997ISO 14240-1 Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes 1997ISO 14238 25 Standardy půdních biotestů ­ US EPA 850.6200 Earthworm subchronic toxicity test 850.5100 Soil microbial community toxicity test 850.4800 Plant uptake and translocation test 850.4600 Rhizobium-legume toxicity 850.4300 Terrestrial plants field study, Tier III 850.4250 Vegetative vigor, Tier II 850.4230 Early seedling growth toxicity test 850.4225 Seedling emergence, Tier II 850.4200 Seed germination/root elongation toxicity test 850.4150 Terrestrial plant toxicity, Tier I (vegetative vigor) 850.4100 Terrestrial plant toxicity, Tier I (seedling emergence) 850.4000 Background-Nontarget plant testing 850.2450 Terrestrial (soil-core) microcosm test 26 Přirození nepřátelé škůdců z řad členovců, kteří jsou standardizováni ve směrnicích IOBC, BART, EPPO (SamsePetersen, 1990) Opius+ Dacnusa, DiglyphusLeaf miner parasitoids As for vegetablesAphid parasitoids Aphidoletes sp. As for cereals (except syrphids)Aphid-specific predators Encarsia formosa°Whitefly parasitoids Phytoseiulus persimilis°Predatory mitesGlasshouses Orius sp.* Anthocoris spp.+Polyphagous predators As for vegetablesLepidopteran parasitoids As for cerealsAphid-specific predators Amblyseius potentillae+ Typhlodromus pyri+*Predatory mitesOrchards Trichogramma cacoeciae+° Lepidopteran parasitoids Diaeretiella rapae+ Aphidius spp.+Aphid parasitoids As for cerealsPolyphagous predatorsVegetables Aphidius spp.+*Aphid parasitoids Eupeodes corollae+ Episyrphus balteatus Coccinella septempunctata+Aphid-specific predators Chrysoperla carnea+ Lycosid spiders+ Linyphiid spiders+ Aleochara bilineata+ Tachyporus hypnorum Bembidion lampros+ Pterostichus cupreus+*Polyphagous predatorsCereals Examples1 Type of natural enemiesCrop 27 Organizace spojené s půdními testy OECD = Organization for Economic Cooperation Development ISO = International Standardization Organization US EPA = US Environmental Protection Agency SETAC = Society for Environmental Toxicology and Chemistry IOBC = International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants EPPO = European and Mediterranean Plant Protection Organization ASTM = American Society of Testing and Materials ANSI = American National Standards Institute CEN = European Commitee for Standardization AFNOR = Association Francaise de Normalisation EEC = European Economic Community WHO = World Health Organisation BBA = Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft OPPTS = The Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (EPA) BART = Beneficial Arthropod Regulatory Testing 28 Výběr testů do procesů hodnocení rizik Optimální vlastnosti půdního testu jsou: standardizovatelnost, opakovatelnost, variabilita praktická proveditelnost, cena, rychlost citlivost vypovídací hodnota, použitelnost pro ochranu ŽP ekologická relevance (samozřejmě platí vlastně i pro všechny další biotesty) 29 Příklad: sada testů z Vyhlášky 257/2009 Sb. Před testy s roupicemi a vyššími rostlinami jsou reprezentativní vzorek sedimentu i reprezentativní vzorek referenční půdy (půda, na kterou má být sediment použit) vysušeny při laboratorní teplotě, zhomogenizovány a přesáty přes síto 2 či 4 mm. Pro testy inhibice nitrifikace je referenční půdou nekontaminovaná půda splňující požadavky ISO 15685 (2004) a jak sediment tak referenční půda jsou vzorkovány, zpracovány a skladovány v souladu s ISO 10381-6 (2009): v přirozené vlhkosti, přes 2 mm síto, uchování v 4 °C maximálně dva týdny. Před testováním se hodnocený sediment smíchá s půdou v objemovém poměru 1:3, který vychází z maximálního povoleného poměru výšky použitého sedimentu a orničního profilu v vyhlášce. ISO 16387 (2004)ISO 16387 (2004) ISO 11267 (1999)ISO 11267 (1999)1126911269--1 (1993)1 (1993) ISO 15685 (2004)ISO 15685 (2004) 30 Ekologická relevance testů testované druhy by měly reprezentovat relevantní funkční skupinu test má respektovat ekologii organismu sledované odpovědi by měly být ekologicky relevantní a indikovat stav a funkci organismu (přežití, růst, reprodukce, přijímání potravy a mobilita) při sledování reprodukce by měla expozice pokrývat většinu životního cyklu abiotické a biotické faktory by měly v testu být podobné jako v habitatu expoziční cesty by měly napodobovat reálné expozice biodostupnost kontaminantu by měly být podobná jako v reálu koncentrace by měly být environmentálně reálné (u půdy obecně pro všechny látky lze jako maximum dát 1 g/kg půdy) 31 Ekologická relevance organismů hrají klíčovou roli ve fungování půdního ekosystému vyskytují se v řadě ekosystémů ve vyšší abundanci lehce použitelné v polních i laboratorních podmínkách dostávají se do kontaktu s polutanty jsou dostatečně citlivé na stres Problém ekotoxikologie obecně: v testech použiji organismy A (z celé řady důvodů), ale cílové organismy v systému jsou B jaký je vztah výsledků pro A a B ? Příklad: Eisenia fetida ­ nejznámější půdní test 32 Druhy žížal Eisenia fetida ­ žije v kompostu !! Dendrobaena octaedra Aporrectodea caliginosa Lumbricus rubellus Lumbricus terrestris 33 Základní koncepce půdních biotestů 34 Koncepce půdních biotestů Stresor Odpověď A B C A B C +/- +/A B C Frekvence Frekvence - + Frekvence Frekvence - + A B C Frekvence Frekvence A B C - + A B C 35 Půdní biotesty - koncepce Jde o prospektivní přístup k HODNOCENÍ EKOLOGICKÝCH RIZIK CÍL: Určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je bezpečná K tomu slouží soubor půdních ekotoxikologických testů a následně metodika hodnocení ekologických rizik Dose Response 36 Půdní biotesty - koncepce 1. Testuje se chemická látka koncentrační řada, např. 1, 10, 100, 1000 mg Cd / kgsuché půdy 2. Testuje se materiál typu kontaminovaná půda, sediment, kal ČOV apod. koncentrační řada vzniká ,,ředěním" s referenční půdou, např. 10, 20, 40, 80, 100 % kalu s čistou půdou Dose Response 37 Proč testy kontaktní ? testy výluhtesty výluhůů nelze simulovat toxicitu pevných vzorknelze simulovat toxicitu pevných vzorkůů výluh 1:10 kontrolnkontrolníí ppůůdada odpadodpad smsmííchcháánníí vv rrůůznýchzných pompoměěrechrech PROPROČČ ?? rereáálnlnáá BIODOSTUPNOSTBIODOSTUPNOST integrovintegrováánn EFEKT MATRICEEFEKT MATRICE pHoptimum Reprodukceroupic 38 Testování toxicity tuhé matrice 39 Biotesty jako nástroj hodnocení kvality tuhé matrice Existují ISO normy určující výběr testů ISO 15799 (2003): Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials ISO 17616 (2008): Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxicological characterization of soils and soil materials 40 Biotesty jako nástroj hodnocení kvality tuhé matrice Retention function ­ Biotests with eluates Ecotoxic contents Genotoxic contents Habitat function - Biotests with solids Luminescent bacteria test Algal inhibition test Site inherent test organisms Added test organisms Respiration test Nitrification test Bacteria contact test Earthworm avoidance test Plant test Earthworm test Collembolan test Umu-test 41 Expoziční systémy Chemikálie smíchána s půdou Artificiální půda (OECD, ISO) Reálná půda (LUFA 2.2 či jakákoliv jiná) Aplikace na povrch těla Injekce Aplikace na přijímanou potravu ...... 42 Expoziční cesty v pevném vzorku Ingesce a orální vstup potrava a půdní částice - organismy konzumují minerální a organickou hmotu - významná expoziční cesta pro sorbované chemikálie; kontaminanty se mohou bioobohacovat - např. v houbách, které konzumují chvostoskoci; významná cesta pro členovce Dermální vstup z půdy, z půdního roztoku - zejména organismy vrtající v půdě (žížaly a roupice), které mají tenkou kutikulu a jsou v kontaktu s půdou a pórovou vodou; lze modelovat výsledky i z testů v akvatickém prostředí při doplnění modelu distribuce látky mezi půdní roztok a sorpci na částice = tzv. Equilibrium partitioning theory (EqP) Dýcháním nejsou téměř žádná data 43 Artificiální půda 10% Suchá a jemně namletá rašelina 20% Kaolinitový jíl obsahující minimálně 30% kolinitu 70% Křemenný písek jemný obsahující minimálně 50% zrn o velikosti 0,05 ­ 0,2 mm 0,3 ­ 1% Uhličitanu vápenatého, který je přidán tak, aby výsledné pH bylo 6 0,5 44 Artificiální vs reálná půda: 45 Složení artificiální půdy je předmětem výzkumu 46 LUFA standardní půdy (http://lufa-speyer.de/) Landwirtschaftliche Untersuchungs und Forschungsanstalt Speyer přírodní půdy je potřeba před testy ošetřit: defaunace, úprava vlastností Cena: 4 EUR za 1 kg + doprava LUFA 2.1 LUFA 2.2 LUFA 2.3 LUFA 5M LUFA 6S organic carbon (%) 0.81 0.21 2.16 0.40 0.98 0.05 1.29 0.20 1.75 0.11 particles < 0.02 mm (%) 8.2 0.9 13.9 1.1 22.7 1.1 25.3 1.8 65.1 2.7 pH (0.01M CaCl2) 5.1 0.4 5.4 0.1 6.4 0.6 7.2 0.1 7.2 0.1 cation exchange capacity (meq/100g) 4 1 10 1 8 2 15 3 22 6 water holding capacity (g/100g) 33.2 1 48.2 5 34.4 2 42.1 4 40.7 5 weight per volume (g/1000ml) 1404 46 1197 60 1291 30 1212 56 1264 90 <0.002 3.0 0.9 6.4 0.9 9.4 0.9 10.8 1.3 42.1 1.8 0.002 - 0.006 2.2 0.7 3.5 0.7 4.2 0.8 5.4 0.3 10.8 0.7 0.006 - 0.02 2.9 0.7 3.8 0.7 9.1 0.5 9.1 0.5 12.1 1.3 0.02 - 0.063 5.3 1.8 5.4 1.2 18.6 2.3 19.5 1.3 14.1 2.5 0.063 - 0.2 27.0 3.1 35.4 2.3 29.3 3.4 38.9 1.0 8.7 0.9 0.2 - 0.63 57.2 4.3 44.8 2.7 26.9 0.7 14.9 1.0 9.0 0.3 0.63 - 2.0 2.4 0.6 0.7 0.1 2.5 0.8 1.4 0.1 3.2 0.7 soil type sand (S) loamy sand (lS) loamy sand (lS) silty sand (uS) clayey loam (tL) <0.002 3.0 0.9 6.4 0.9 9.4 0.9 10.8 1.3 42.1 1.8 0.002 - 0.05 8.8 1.8 12.2 0.6 29.8 3.0 27.5 2.2 36.0 2.3 0.05 - 2.0 88.2 1.2 81.4 1.2 60.8 2.6 61.7 3.2 21.9 1.6 soil type sand loamy sand sandy loam sandy loam clay Particle size (mm) distribution according to German DIN (in %): Particle size (mm) distribution according to USDA (in %) 47 European reference soil set (IRMM-443-EUROSOILS) 48 Dávkování látek do půdy cílem je HOMOGENITA expozice testovanou látkou ve vodě rozpustné pro přídavek využita destilovaná voda, kterou současně adjustujeme potřebné ovlhčení půdy, přičemž by jejich koncentrace v přidávané vodě neměla přesahovat 50% saturační koncentrace nerozpustné ve vodě 1. suspendovány ve vodním roztoku pomocí nosiče, který není toxický, je rozpustný ve vodě (aceton, etanol, arabská guma) a je volatilní 2. rozpuštěny v organickém rozpouštědle, které není toxické a rychle se odpaří V předchozích případech lze aplikovat: 1. do malého množství (1-10%) jemného křemenného písku; po odpaření rozpouštědla je tato směs přidána do půdy a promíchána 2. přímo do vzorku půdy (suchý či vlhký) s následným odparem a promícháním Ve všech případech je nutno zařadit kontrolu na nosič respektive na rozpouštědlo nerozpustné ve vodě ani ve vhodném rozpouštědle lze smíchat přímo s křemenným pískem (2,5g písku na 20g půdy) 49 Testovací design obecně Mladí ale dospělí jedinci (většinou 10) jsou exponováni chemikálii (či kontaminované zemině) smíchané s artificiální půdou v nádobkách ze skla či inertního materiálu (+ potrava) Předběžný test - hledáme rozmezí používaných koncentrací (ředící faktor 10; 0,1 - 1000 mg/kg); mortalita hlavní endpoint hodnocený po krátké době (např. 2 týdnech) Finální test - výstupem je funkce závislosti účinků na koncentraci testované substance (jemnější škála; nejlépe s faktorem 2); hodnoceny přežití dospělců (mortalita - akutní test) a počty juvenilů (reprodukce - reprodukční test) NOEC design ­ méně koncentrací, ale více opakování ­ např. 5 koncentrací po 5 opakováních a kontrolní varianta (bez chemické látky, na rozpouštědlo apod.) EC/LC design ­ více koncentrací, méně opakování ­ regresní metody 50 Půdní biotesty s mikroorganismy 51 Testy s půdními mikroorganismy Soil sampling Storage Pre-incubation (7 days) START Substance application Negative control Positive control 7th day 14th day 21st day 28th day Microbial parameters 10 g per replicate aerobic conditions 60% WHC; 22°C; dark 1010 g per replicateg per replicate aerobic conditionsaerobic conditions 60% WHC; 2260% WHC; 22°°CC;; darkdark OECD 217 (2000) Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test ISO 14238 (1997) Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes OECD 216 (2000) Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test 52 Požadavky na půdu přirozená půda, která je vybrána tak, aby byla citlivá vůči kontaminaci a splňovala tzv. "nejhorší scénář", tj. maximální expozici mikroorganismů polutantu v této půdě: více než 70% písku pH 5,5 - 7,0 Corg 0,5 - 1,5% Cbio/Corg více než 1% (dostatečné oživení) kationtová výměnná kapacita vyšší než 70 mmol/kg v historicky známé době nekontaminovaná (adaptace společenstva) Alternativy: vzhledem k možnosti přítomnosti resistentních mikroorganismů v reálném společenstvu existují postupy, kdy je do sterilizované přirozené půdy inokulována specifická kultura mikroorganismů (Pseudomonas putida, Bacillus cereus) plynulý přechod k "solid phase testům (SPT)" toxicity s prokaryoty 53 Endpointy v mikrobiálním testu Standarně pouze mineralizace dusíku a uhlíku jako produkci CO2 a sumy minerálních forem dusíku (NH4+, NO2-, NO3-) Lze ale stanovit i další parametry: Mikrobiální biomasu Substrátem indukovanou respiraci Enzymatické aktivity Kinetiku mineralizace C a N Amonifikaci, nitrifikaci Diverzitu Výstupy: NOEC, LOEC, LC50, EC50, IC50 ... 54 Stanovení mikrobiální biomasy Fumigačně-extrakční metoda Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method1997ISO 14240-2 55 Bazální a potenciální respirace Bazální respirace Potenciální respirace Laboratory methods for determination of microbial soil respiration2002ISO 16072 Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method1997ISO 14240-1 56 Hodnocení mineralizace dusíku Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes 1997ISO 14238 57 Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy ­ SIR kinetika A) Testování kontaminovaných půd B) Testování chemikálií Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves2002ISO 17155 58 Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy ­ Oxidace amoniaku Jde o míru nitrifikace = první krok nitrifikace SNA = short term nitrification assay PAO = potential ammonium oxidation půda inkubována v roztoku síranu amonného chlorečnan sodný inhibuje oxidaci dusitanu po 6 hod stanovení NO2Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation 2004ISO 15685 59 Půdní biotesty s bezobratlými 60 Žížaly v ekotoxikologii žížaly jsou asi nevíce a nejdéle ekotoxikologicky užívaný představitel půdní fauny Výhody a důvody: celý vývojový cyklus probíhá v půdě - typický geobiont zkonzumují velká množství půdy (vysoká expozice potravou a akumulace kontaminantů) mají velmi úzký fyzikální kontakt s půdou (expozice pokožkou) mají výrazné bioakumulační a biokoncantrační charaktery (jejich analýzou posuzujeme vliv delšího časového období) = patří mezi tzv. makrokoncentrátory vysoký a významný podíl na tvorbě půdy, dekompozičních procesech, půdní úrodnosti klíčové postavení v přenosu polutantů v potravních řetězcích výskyt téměř ve všech půdách ve vysokých počtech i váhách osvědčené, zavedené v laboratorních testech (nenáročný chov) snadno se identifikují v reálných vzorcích (díky velikosti) 61 V různých testech různé endpointy Mortalita Reprodukce Změny váhy Behaviorální změny Malformace Fyziologické změny Snížení imunity Aktivity enzymů Biochemické markery Genotoxicita .... 62 Eisenia fetida Výhody Standardní druh Snadná kultivace velkých počtů Krátký životní cyklus 63 Chov žížal Nevýhoda těchto jinak perfektních testů: nároky na prostor, čas boxy 50×50×15 cm s těsnícími víky médium 1:1 směs kravího či koňského hnoje a rašeliny pH cca 7 nekontaminovaná amoniakem či močí pokud vše jde dobře za 6 týdnů až 1000 žížal (na 20 kg směsi): týdně 2-5 kokonů s cca 4 juvenily na kokon v optimálních podmínkách je dospělá za 2-3 měsíce kulturu lze také získat ve vermikompostovacích firmách Synchronizace kultury: začne se s kokony, za 3-4 týdny se vylíhnou, za 7-8 týdnů dospějí (20°C) 64 E. fetida akutní test v půdě dospělci E.f. jsou chovány 14 dní v artificiální půdě obsahující kontaminant (500 g půdy) před finálním testem provádíme test hledající rozmezí koncentrací kontaminace se udává v mg/kg; doporučené koncentrace jsou 0.1, 1, 10, 100, 1000 dávkování (rozpustné × nerozpustné × pevné ... klasika) vyšší koncentrace než 1000 mg/kg nejsou environmentálně relevantní a nemá smysl je testovat na 1 koncentraci 1 nádoba v předběžném testu a 4 nádoby ve finálním testu nádoba má 10 jedinců (dospělci: clitellum, váha 300 - 600mg, věk 2-12 měsíců, rozdíly ve věku by neměly být vetší než 4 týdny) kontinuální osvětlení (400-800lx) zabezpečuje setrvání jedinců celou dobu v půdě mortalita a váha po 7 a 14 dnech (nereagují na jemný mechanický stimul) se převede na LC50 doporučuje se užití referenční látky - chloracetamid (LC50 mezi 20 a 80mg/kg) kontrola - mortalita méně než 10% a úbytek váhy menší než 20% Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate 1993ISO 11268-1 65 E. fetida reprodukční test v nádobách 1-2L s povrchem 200cm2, vrstvička asi 5-6cm (500- 600g) AS potrava 0,5g hnoje na jedince a na týden do nádoby 10 dospělců 1 týden předinkubace; předběžný test; finální test 20°C; 16:8 400-800lx; krmení 5g sušeného hnoje týdně po cca 4 týdnech mortalita, zvážení, spočítají se kokony + juvenilové; oddělají se dospělci kokony se inkubují další čtyři týdny - extrakce juvenilů ručním tříděním výsledky jsou váha dospělců a počet juvenilů na dospělce KONTROLA musí mít cca 30 juvenilů/dospělce; koeficient variance pro reprodukci <30% a mortalita dospělců po 4 týdnech by neměla být větší než 10% REFERENČNÍ LÁTKA je doporučován carbendazim; má mít statisticky významný efekt v koncentraci 1-5 mg/kg Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 2: Determination of effects on reproduction 1998ISO 11268-2 66 Příprava půd Měření WHC půd Ovlhčená AS rozvážená do testovacích nádob Výběr 10 reprezentativních adultů z chovu a jejich omytí dH20 Zvážení jedincůPřídavek 10 adultů do nádoby na test Eisenia fetida reprodukční test - začátek 67 Prohlídka nádob (známky aktivity) Zhodnocení mortalityZvážení žížal Nádoby během testu v kontrolované místnosti E. fetida test ­ po 28 dnech 68 Po cca 20 min juvenilové na povrchu Vodní lázeň s narůstající teplotou 40C až 60C Přesátí půdy Sbírání a počítání PočítáníRuční třídění kokonů E. fetida ­ po 8 týdnech 69 70 Příklad hodnocení pesticidů 71 Earthworm Avoidance Test Guideline: ISO/DIS 17512 (draft) Species: E. fetida / E. andrei Substrate: LUFA St. 2.2 standard soil Duration: 1 - 2 days Parameter: Behaviour of the worms Test vessels: Dual chamber 72 Testy s roupicemi Relevance: Modelový organismus půdních destruentů Roupice zastávají podobné funkce jako žížaly a v některých systémech je nahrazují Realistická expozice ­ obývají horní vrstvičku půdy Praktické výhody testů při srovnání s prostorovými, časovými a finančními náklady testů na žížalách: 4-6 týdnů oproti 8 týdnům 20g půdy oproti 1/2 kg Malé ale dobře manipulovatelné Malý a snadný chov (není potřeba hnůj) 73 Enchytraeus albidus vs crypticus E. albidus: 15 ­ 40 mm E. crypticus je mnohem menší (5 - 10 mm) praktické problémy - potřeba barvení ALE dá se bez problémů kultivovat ve velkém na agaru vzhledem ke kratší generační době ho získáme velké počty v krátké době (E.a. 33 dnů × E.c. 8 dnů) 74 Chovy roupic V půdě (E. albidus, E. crypticus) či na agaru (E. crypticus) Substrát může být artificiální půda, přírodní půda, či zahradní zemina, či směs např. 1:1 Substrát musí být defaunizován (opakované zmražení a roztání), nesmí obsahovat polutanty a mít vhodné vlastnosti (zejména pH) a přesátý přes 2 mm Krmení ­ autoklávované mleté ovesné vločky V chovu musí být přístup vzduchu a optimální vlhkost Indikátory nevhodného substrátu: roupice pohybující se pouze po povrchu, či snažící se uniknout z nádoby, nevyskytující se juvenilní jedinci apod. Cyklus (18 °C): kokon obsahuje průměrně 5 - 15 vajíček; po 1-3 týdnech se vylíhnou juvenilní jedinci, kteří dospívají cca po 3 až 6 týdnech 2 x týdně kontrola vlhkosti a krmení 75 Chovy roupic 76 Test na reprodukci roupic ­ 1. část Je možno provádět se dvěma druhy E. albidus a E. crypticus Inertní nádobky a v každé 20g půdy pro E.a. a 10 g pro E.c. Podmínky testu: optimální teplota (max 20 °C), vlhkost (40 - 60% WHC), osvětlení (perioda 16:8, 400-800 lux) 10 dospělých jedinců (opasek s tečkami vajíček) do každé nádobky Každý týden s vyjímkou prvního týdne po odstranění dospělců je přidávána potrava (cca 1,2 mg ovesných vloček na g půdy). Mortalita ­ po 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se spočítají dospělci a odstraní se z půdy Pozorování morfologických změn lze provádět na petriho miskách: Jedinci jsou asi 12 hodin necháni na miskách v chladu, čímž dojde k vyčištění trávící soustavy. Jedinec je přemístěn do kapky vody na podložní sklíčko Pozorování začíná na 100× zvětšení a detailní studium externích a interních struktur provádíme při 400× zvětšení. 77 Test na reprodukci roupic ­ 2. část Po odstranění adultů se inkubuje pouze půda s kokony (bez potravy) Po dalších 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se hodnotí reprodukce - fekundita, pro extrakci juvenilních jedinců Metoda mokré extrakce (fixace etanolem a barvení 1% bengalskou červení po 12 hodinách) Kontrola v testu (bez aplikace chemikálie i nosiče) má vykazovat následující parametry: mortalita dospělců méně než 20% na konci testu rozmnožení nejméně 25 juvenilních jedinců na 10 dospělců (pro E.c. je zo 300 až 500) koeficient variance pro počet juvenilů méně než 50% Pozitivní kontrola - referenční látka - carbendazim (1,20,8mg/kg by mělo vyvolat EC50) 78 Postup testu s E. albidus ISO 16387 (2004): Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival OECD test 220 (2004): Enchytraeid Reproduction Test 79 Timetable 80 Avoidance test s E. albidus 24 hodin 1 2 3 8,4 cm 4 5 10 dospělců 10 opakování 2 x 10 g půdy Hledání živých roupic v obou polovinách odpad artificiální půda Např. testování odpadů 81 Bioakumulační test s máloštětinatci 82 Testy s chvostoskoky ekotoxikologicky dlouho využívané organismy - první test na filtračním papíře byl již v roce 1956 s DDT Výhody: dobře prostudovaná skupina půdních bezobratlých ekologická relevance široce rozšířené, abundantní v půdách lehce vzorkovatelní lze je chovat v laboratoři relativně rychlý životní cyklus s vysokou reprodukcí nejčastěji užívaným druhem je Folsomia candida omnivor (řasy, bakterie, prvoci, detritus) lehká kultura partenogenetická povaha neposkytuje příliš ekologicky relevantní obrázek i další druhy: Folsomia fimetaria, Isotoma viridis, Onychiurus armatus, O. quadricellatus, Orchesella cincta, Tullbergia granulata 83 Postup testu s F. candida Kultivace na petriho miskách či jiných nádobách, kde je na dně štuková sádra (pH 6,4) a aktivní uhlí (pH 6-7) smíchané v poměru 8 až 10 ku 1, 100g směsi + 60-100g vody = dostatečná vlhkost; uhlí pohlcuje exkrety tmavé pozadí umožňuje pozorování 20-22°C; 70-80% rel. vlhkost vzduchu; 400-800lx potravou jsou kvasnice párkrát týdně po 8 týdnech je nutné přemístit do nové misky (tím se spouští ovipozice) Synchronizace shluk vajíček se přemístí do nové nádoby; po 48h. odstranit zbylá vajíčka a krmí se juvenilové nebo čerstvě vylíhlí jedinci se dají do nové nádoby a po nakladení vajíček se odstraní dospělci manipulace pomocí exhaustoru dechového či automatického 84 Folsomia candida 85 Test s F. candida 30g AS + na počátku 2mg sušených kvasnic + 10 jedinců F.c. (10-12 dní staré) a těsně zavřít nádobky po 28 dnech (případně po době, než se vylíhnou potomci z vajíček nakladených dospělci) se sleduje přežití a potomstvo (F1) flotační metoda na konci pokusu endpointy jsou reprodukce (produkce vajíček), růst, změny v chování, přežití REFERENČNÍ LÁTKA: Betanal plus (160g/L Phenmedipham) či E605 forte (507,5g/L Parathion) efekt na reprodukci 100-200mg první látky a 0,1-0,18mg druhé VALIDITA TESTU: v kontrole ne více než 20% mortalita a minimum 100 juvenilů na jednu testovací nádobu 86 Folsomia candida ISO 11267 (1999). Soil Quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants OECD (2009): Collembolan Reproduction Test. Proposal of the new guideline 87 Testy s hlísticemi Hlístice jsou de facto vodní organismy ­ žijí v pórové vodě Nesnadná extrapolace na reálné podmínky Velmi rychlé testy ­ krátký životní cyklus Hlístice jsou nejpočetnější půdní bezobratlí Existují varianty s půdou jako matricí Caenorhabditis elegans, Panagrellus redivivus, Plectus acuminatis 88 Caenorhabditis elegans chov a test ASTM: E2172-01 Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity Tests with the Nematode Caenorhabditis elegans C. elegans se chová na agarových plotnách s nárůstem E. coli Nutné jsou aseptické techniky a opatrné zacházení Několik medií ­ NGM Nematode Growth Medium, LB ­ agar, K ­ roztok apod. Po 1-2 měsících se přesazuje na nové plotny Při nedostatku potravy se vyvinout tzv. Dauerovy larvy 89 C. Elegans test Protože testovací organismy by měly být stejné věkové a váhové kategorie, použije se synchronizovaná kultura nematod: ošetření kultury roztokem chlornanu a hydroxidu sodného (SAVO) - vajíčka rezistentní, dospělce usmrtí; pak cca 3-4 dny staré hlístice připraví se varianty půd ve větších objemech; poté na petriho miskách ( 3,5) menší navážky + testovací organismy (10 jedinců) po 24h. pokusu (20°C ve tmě) se provede speciální extrakce (Ludox - koloidní suspenze) + centrifugace; nematoda jsou na povrchu supernatantu - přemístíme je na petriho misku s médiem a počítají se mrtví jedinci (bez pohybu při dráždění); spočítá se LC50 kontrola pro validitu měření by měla mít 80% výtěžnost nematod z půdy a v kontrole 90% přežívání pokud je test delší než 24h. musíme zajistit potravu - inokulum E.coli 90 Postup Kontaminovanou půdu lze připravit předem Nutný je kvalitní mikroskop Tento test je méně ekologicky relevantní než ostatní půdní testy: - hodně vodné fáze - krátké trvání = rychlý screeningový test 91 Helix aspersa test juvenilní H. aspersa (3-5 týdnů staří jedinci; 10,3g; 15,51mm schránka; ze synchronní kultury) po estivaci = 1-20 týdnů v dřevěných krabičkách v suchu; pár dní před testem postřik vodou, krmení pak je 5 jedinců exponováno 28dní testovacímu substrátu (AS či přírodní čistá půda) obsahujícímu testovanou látku nebo kontaminované půdě; v boxech s 1cm vrstvou cca 140g půdy po sedmi dnech se přendávají do nového substrátu 20°C, 16:8 fotoperioda 50-100lx během testu se přidává potrava (např. Helixal) v misce na dno testovací nádoby každých 7 dní se jako parametr růstu měří hmotnost a velikost schránky a sleduje se mortalita referenční látka je Cd: pro hmotnost by EC50 mělo být mez 350- 650mg/kg a pro schránku mezi 500-800mg/kg VALIDITA: menší mortalita než 10%; koeficient variance pro růst < 40%; cca 4× zvětšení hmotnosti; cca 1,5× zvětšení ulity 92 H. aspersa ­ náročný chov 93 Chov a test 94 Testy s roztoči vhodné testovací organismy, zastávají řadu potravních typů ­ herbivoři, fungivoři, detrivoři a carnivoři Hypoaspis aculeifer (gamasida) ­ predátor lovící roupice, chvostoskoky, roztoče; cca 0,8mm; sexuální rozmnožování ekologická úloha spočívá v biokontrole škůdců rostlin (hlístic, larev hmyzu, roztočů) a patří mezi prospěšné členovce testovací systém zahrnuje vztah predátor ­ oběť vysoká citlivost 95 Kultura roztoče lze chovat v plastových nádobkách na sádře ve 20°C při 12:12h fotoperiodě krmí se Folsomií fimetaria jednou týdně pro vyprodukování vajíček se umístí na nový substrát 150 samiček a 20 samečků; je potřeba udělat jehlou malé dírky do sádry za cca 10 dní jsou juvenilové, kteří se krmí juvenilními Folsomiemi Hypoaspis aculeifer test 96 H. Aculeifer test 10 samiček a 5 samečků H.a. a 100 F.c. či F.f. se přidá do 60g půdy AS či LUFA (kontrola + kontaminované varianty) po třech týdnech se sleduje přežití, růst a reprodukce na začátku a po 14 dnech se přidají kvasnice jako potrava pro chvostoskoky testovací nádobky obsahují naspod síťku pro pozdější extrakci v McFaydenově vysocegradientovém extraktoru referenční látka může být dimethoát Validita: reprodukce roztočů cca 20 juvenilů na misku a přežití samiček více než 90% 97 Testy s prospěšnými členovci existuje pojem "užiteční členovci", spojen s ochranou před účinkem pesticidů na necílové organismy, například na pavouky, hmyz a roztoče které jsou přímo prospěšné, neboť v ekosystémech fungují proti škůdcům (predátoři a parazité škůdců) existuje skupina IOBC (International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants) - připravila cca 30 testů v 3 stupňovém schématu hodnocení rizik (vychází z testů BBA a spolupracuje s BART) cca 6 testů na blanokřídlých 4 testy na broucích 2 testy na dvoukřídlých jeden na síťokřídlých jeden na plošticích 3 na roztočích jeden na pavoucích jeden na patogenní houbě Poecilus cupreus Philonthus cognatus Linyphiidae Lithobius mutabilis 98 Půdní biotesty s vyššími rostlinami 99 Testy s vyššími rostlinami velké množství ­ obtížná přehlednost dřívější testy zaměřené na klíčivost semen a elongaci kořene jsou označovány jako poměrně necitlivé a málo relevantní pro ekologii pro relevantnější interopretace byly vyvinuty testy vícegenerační s možností studia subletálních účinků Nejpoužívanější endpointy 1. Klíčivost semen (půdní roztok) - nerelevantní 2. Elongace kořene (půdní roztok či půda) 3. Růst sazenic 4. Produkce biomasy 5. Životní cyklus (změny hmotnosti, počet květů, semen ..) 6. Enzymatický test 7. Fyziologické testy (fotosyntéza, respirace) 100 semena jsou exponovány v substrátu (křemenný písek), půdě toxické látce či přímo v kontaminované půdě z terénu a po 5 dnech se sleduje klíčivost direct test relativně necitlivý: semeno má bariéry pro vstup látky a energeticky je soběstačné, látka ho nemůže stresovat postupy se v detailech liší, někdy bývá přímo spojen (US EPA) se sledováním délky kořene jindy se ale vliv na délku kořene sleduje jako nepřímá expozice v roztoku Test inhibice růstu kořene Sinapsis alba 72 hodin jsou semena vystavena roztoku látky (+kontrola) 20°C; 5ml roztoku na petriho misku; 30 semen na misku; tma stanoví se délka kořene a počet vyklíčených semen hypokotyl délka kořene Testy klíčivosti a elongace kořene 101 Test růstu kořene ISO 11269-1(1993): Soil quality -Determination of the effects of pollutants on soil flora ­ Part1: Method for the measurement of inhibition of root growth rozšířená se salátem Lactuca sativa PRINCIP: Měří se délka kořenů předklíčeného salátu v kontrole a zkoušeném vzorku po 5 dnech inkubace. Ekotoxicita vzorku je stanovena jako statisticky významný rozdíl v délce kořenů zkoušeného vzorku ve srovnání s kontrolou, popř. se stanoví hodnota EC50 z koncentrační (ředící) řady. 102 Podmínky zkoušky * Teplota: 24°C 2°C * pH: 6,0 ­ 8,0 * doba expozice: 120h 2h * množství vzorku: 200 až 300 g vlhkého vzorku na zkušební nádobu * počet zkoušených semen ­ 15 předklíčených semen v jedné zkušební nádobě * počet paralelních stanovení: 3 až 5 * ostatní podmínky - bez osvětlení 103 Postup - detaily Předklíčení semen - na vrstvě filtračního papíru zvlhčené demineralizovanou vodou po dobu 36h až 48h, při laboratorní teplotě bez regulace osvětlení. Pro zkoušku se vybírají naklíčená semena s kořínkem, který je kratší než 2 mm. 104 Postup - detaily * Do nádoby se naváží 200 až 300 g zkoušeného vzorku nebo kontroly se známou sušinou, zvlhčeného na hodnotu 70% 5 % WHC * pravoúhlá síť např. 5 x 3 bodů * do jamek asi 1 cm hlubokých se pinzetou rovnoměrně rozmístí po 15 naklíčených semenech kořínkem směrem dolu * semena se k zemině přitlačí, zeminou se nezakrývají a takto připravené nádoby uzavřené víčkem se umístí do termostatu s teplotou 24°C 2 °C bez přístupu světla * po 5 dnech se salát šetrně oddělí od vzorku a změří se a zaznamenává délka kořenů ve zkoušeném vzorku a v kontrole s přesností na 1 mm 105 Postup salát setý 106 Vyšší rostliny ISO 22030 (2005): Chronic toxicity in higher plants 107 Využití při registraci pesticidů 108 Půdní ekotoxikologie vs biotesty Není soubor půdních ekotoxikologických biotestů Pomáhá POROZUMĚT složitým vztahům mezi chemickými látkami, půdou a půdními organismy látka půda biota 109 Půdní ekotoxikologie vs biotesty Chceme určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je bezpečná Chceme určit, jaké efekty a proč mají chemické látky a jejich směsi v půdách určitých vlastností v určitých podmínkách a jaké to bude mít důsledky a proč. Funkční biotesty pro proveditelné hodnocení rizik Porozumění komplexní problematice