Testy toxicity sedimentů K.Hilscherová Sedimenty - velmi různorodé složení - polotuhá matrice - pevná fáze (částice) a pórová voda • v podstatě akvatický ekvivalent půdy - heterogenní prostředí - směs jílu, písku, minerálů, huminových látek, odumřelých organismů a antropogenních polutantů - akumulace a inaktivace polutantů (např. AVS - kovy, Corg - PAHs) • primární úložiště biotického i abiotického materiálu (včetně polutantů) v akvatickém prostředí • akumulace polutantů v sedimentech může způsobit: 1. Změny ve struktuře bentických společenstev 2. Zvýšené zatížení organismů polutanty 3. Toxicitu Klasifikace sedimentů 1. Obsah organického uhlíku - ovlivňuje sorpci neutrálních organických látek -> zvýšené Kow = zvýšená sorpce 2. Distribuce zrnitostních frakcí - větší částice mají tendenci sorbovat méně polutantů 3. Obsah a typ jílu 4. Kationtová výměnná kapacita (KVK) - ovlivňuje sorpci kationtů 1. pH - ovlivňuje speciaci kovů, sorpci Další fyzikálně chemické parametry - DO, salinita, amoniak Transport a resuspendace sedimentů Proudy, povodně, vítr, vlny Způsobují pohyby sedimentů v závislosti na jejich velikosti Pórová voda Voda mezi částicemi sedimentů Nepolární pollutanty -> sedimenty -> pórová voda -> vodní sloupec Primární zdroj expozice polutantu pro organismy žijící v sedimentu Sedimenty mohou vázat polutanty, pak být překryty další vrstvou sedimentů -> redukce biodostupnosti Odběry vzorků sedimentů - tyčové vzorkovače (vertikální profil, historie sedimentace) - pasivní vzorkovače - sedimentové pasti (plaveniny) - drapákové vzorkovače (směsné vzorky) - SPMDs - odběr určitých typů polutantu (zejm. pórová voda) © Narušení fyzikálně chemických parametrů sedimentů Manipulace se vzorky • Uskladnění: změny toxicity vzorků v závislosti na teplotě (chlazení (4°C) vs. mražení (<-20°C)), době uskladnění a stupni kontaminace sedimentů • Úpravy vzorků: 1.) úpravy pH (6-9) -vliv na toxicitu a biodostupnost kovů (Zn, Ni, Pb, Cu, Cd), amoniaku a sirovodíku 2.) lyofilizace vs. zmražení 3.) amoniak- odstranění amoniaku ze vzorku probubláváním nebo přidáním zeolitu 4.) homogenizace 5.) kovy - odstranění kovů přidáním EDTA nebo sulfidů 6.) výluhy (vodné/organické) vs. SPTs - změny toxicity eluátů v závislosti na volbě rozpouštědla (voda, methanol, DCM) vs. toxicita biodostupné frakce kontaminantů 7.) pórová voda vs. SPTs Testy se sedimenty • Organismy v sedimentu vystaveni látkám zachyceným v pevné i kapalné složce matrice • Pro bentické organismy - biodostupnost chemických stresom v sedimentech. • Sediment = potenciální dlouhodobý zásobník/zdroj kontaminantu uvolněných do vody • Může být nezbytné remediovat kontaminované lokality bagrováním nebo odstraněním sedimentů • odstranění sedimentu, jeho transport a uložení mohou být velmi nákladné; studie toxicity umožní identifikovat nebezpečně kontaminované lokality - kde je třeba odstranění, kde možno ponechat bez významného rizika. • Zejména EPA a ASTM metodiky Jak hodnotit toxicitu sedimentů? Toxicita pórové vody/výluhů (několik iso / oecd norem) : 100 g d.w./L vody, 24h pomalé třepáni, filtrace, test V. fisheri (30 min), řasy, bezobratlí - D. magna f 2 dny) Doporučeny nejméně 2 různé druhy (např. Hyalella, Chironomus, Daphnia, ...) a dva různé sledované parametry (např. růst, přežití, reprodukce...) Skríningové testy toxicity/genotoxicity Bakteriálni modely Testy s výluhy sedimentů: • Vibrio fischerii (Microtox) - 0,5 h • Escherichia coli (Toxichromotest) - 2 h Kontaktní verze testu • Flash test s Vibrio fischerii - kinetický test - stanovení inhibičního účinku vzorků na světelnou emisi Vibrio fisheri • srovnatelné se statickou zkouškou s luminiscenčními bakteriemi podle ČSN EN ISO 11348 • Flash verze - eliminace vlivu zákalu a zbarvení vzorku, umožňuje provedení testu se suspenzí vzorku bez přípravy vodného výluhu. Je mezistupněm ke kontaktním zkouškám ekotoxicity Testy genotoxicity s výluhy: • SOS chromotest • umuC test • GFPtestatd. 5 Nástroje pro hodnocení • Základní požadavky - Měření zakalených (barevných) materiálů - Schopnost rozlišení TOXICKÝ - NETOXICKÝ - Rychlost • Bakteriální bioluminiscenční testy toxicity - Klasické - Microtox®, BioTox™, LUMISTox aj. - Alternativní - modifikace klasických testů (např. BioTox™ Flash tesť) * Lappalainen, J. etal. (1999): Chemosphere, 38(5), pp. 1069-1083. Microtox • Vibrio fischeru - Mořská bakterie schopná bioluminiscenece FMNH: - RCHO + O: -> FM> + RCOOH + H2Q h 04 hv Design: - Akutní - mikrodestička - Endpoint: inhibice bioluminiscence - Luminometr -1 = 0, 15, 30 minut - Testování vodného výluhu • Vibrio fischeru - testováni zakalených a barevných vzorků, bez potřeby referenčního materiálu design: - akutní - inhibice bioluminscence - mikrodestička - luminometr s dispensorem - nutné vzorek protřepat (během měření) - krátká doba měření - Hodnota píku Smax (0-2s) v porovnání s pikem S30s (po 30s měření) INH -- i h test Cas 1- 5305 KF S_ Akutní testy toxicity I. • Pórová voda • Eluát ze sedimentu • 48-96 h expozice • Příprava eluátu: 24h třepáni, 100 g sedimentu/1 L vody • Druhy: Daphnia magna, Daphnia pulex, Ceriodaphnia dubia, střevle potoční (Pimephales Promel as), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) • Sledované parametry: přežívání, imobilizace Akutní testy toxicity II. Kontaktní testy - Celý sediment 96h - 10 dní expozice Druhy: různonožec {Hyalella azteca), jepice (Hexagenia limbata), pakomár (C. teritants/riparius) 10-denní test s Hyalella azteca a Chironomus tentans Sledované parametry: přežívání Chronické testy toxicity I. • Pórová voda • Eluát ze sedimentu • 7-35 dní expozice • Druhy: Ceriodaphnia dubia, střevle potoční (Pimephales Promelas), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) • Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst, reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu, přežívání mladých Chronické testy toxicity II. • Kontaktní testy - Celý sediment • Zpravidla 28 dní expozice • Druhy: různonožec (Hyalella azteca), pakomár (C. tentants/riparius) • Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst, reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu, přežívání mladých • 28- a 42-denní testy s H. azteca • Sub-chronické a celoživotní testy s Chironomus tentans • 10-denní krátkodobý chronický test s larvami obojživelníků ASTM E 1706 (2005) Standard Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates korýš Hyalella azteca ( H. azteca) pakomár Chironomus tentans 10 denní test, 300-mL kádinky, 100 mL sedimentu, 175 mL vody, organismy krmeny Parametry: přežívání, růst Další testy sedimentů: Chironomus riparius, Daphnia magna and Ceriodaphnia dubia, Hexagenia spp.. Chronický test s Tubifex tubifex (28 dní) - přežívání, růst, reprodukce Chronický test s H. azteca Diporeia spp. Chironomus dilutus - přežívání, růst, vylétávání, reprodukce Ekotoxikologické biotesty se sedimenty - přehled EPA Te^t Mediu m Species i'_ o minou Name F res Iittíi ter bentliic Chira nom us dílu t us Cliiionomid. midge larvae Chiranomus ripaiiiis Chiionomid, midge larvae Hyalella azieca Amphipcd. <,cud Lurfíbricuhfs variegatuz Oligochaete, "worm" Gamma ms pu lex Amphipc d Hexag&ma limbata Epkenieroptera. mayfly Tu b f Je x tub j f ex Oligochaete Dipor&ía íp Amphipod. Great Lake7. Marine Benthic AfŤtencafŤiysis. bahia MyUd liirioip Ampelisca abdita Amphipcd (Atlantic) Eohaiistoiius ezhiwňis Amphipod (Pacific) Leptocheiyuz phimulosus Amphipcd (Atlantic) Rkepoxy-nřus abromaz Amphipod (Pacific) Of -a n did iet • ell a jap orlica Amphipc d www.epa.gov Ekotoxikologické biotesty se sedimenty - přehled EPA PsaffliheckJmis miliaiis Shore urchin Meycenaria meyceHaria Hard ^hell c lam Mulinia lateralis DvĽaif vurf c lain Microtox (Vibrio fisch erii) 3r.c:e:ia IresliTiater Pelagic Ceyiodaphnia dubia Cladocerau. water flea Daphma. magna Cladocerau. water flea Daphma pulex Cladocerau. water flea Pitnephales pro tnelas Fňh. fathead minnow Salvelin uz fo) i tíhu liz Fish, brook trout O}\coyhyflc~y\uz wykiss. Fish, rainbow trout Marine Pelagic Atkeiinops offínis Fivlx topsinelt Qprinodon vanegatus Fiľ^h. sheep-shead minnow Memdia bsľvUň\a. r Fish, silvervide www.epa.gov Testy toxicity sedimentů ASTM Table 3.6. Some freshwater sediment toxicity tests (ASTM E1383, 1993) Species: 1. Ajuphipod {Hyatelta. azteca} 2. Midges: Chiranamus tem&ns, Chiranomus riparius 3. Oaphftia magna and Ceriad.aph.nia dubia 4. Mayflies {ttexagenici spp.) Endpoints: 1. Number of young; survival, growth & development; reproductive capacity 2. Larval survival and growth, adult emergence 3. Survival and reproduction 4. Mortality, growth, burrowing behaviour, moulting frequency Duration: lO—30 days for tests 1 and 2; 2—7 days for test 3; 7—21 days for test 4 Temperature <ŮC>: 20-25 for test 1; 20-23 for test 2; 25 for test 3; 17-22 for test A Conditions: Static for all tests; flow-through for tests 1 and 2; recirculating for test 4 Level of effort: Medium for all tests Testy toxicity sedimentů ASTM Table 3-7. 1993) Some marine and esturine sediment toxicity tests (ASTM El 383, Species: 1. Amphipods 2. Fish, crustaceans, zooplanctons, or bivalves 3. Infaunal amphipods, burrowing polycheates, mollusks, crustaceans, or fish. ^daterial; Endpoints: 1.. "Whole sediment 2. Dredged material (elutriate} 3. Dredged material (whole sediment} 1. řvlortality, emergence, renurial 2. Mortality 3. Survival Duration: lO days for tests 1 and 3; 2 days for zooplancton and fish larvae in test 2 and 4 days for bivalves and crustaceans in test 2 Temperature C°C}: 20-25 for test 1; 20—23 for test 2; 25 for test 3; 17—22 for test 4 Co n d i t i o n s: Static for all tests; flow-through for tests 1 and 2; recirculating for test 4 Testy toxicity sedimentů Spíše chroničtější expozice - viz. Chronické testy - pakomáři, mlži, korýši, kroužkovci - Hyallela, Lumbriculus Tubifex tubifex - Nitěnka obecná kmen: KROUŽKOVCI třída: opaskovci podtřída: máloštětinatci • Součást makrozoobentosu • Relevantní organismus pro sediment • Inhibice pohybu a letální koncentrace Akutní test Účel: Test je určen k hodnocení akutní toxicity látek na nitenky. Nitenky patří mezi nejčastěji a nejdéle používané testovací organismy. Princip: Test spočívá ve sledování chování a přežívání nitěnek v odstupňovaných koncentracích látky ve srovnání s kontrolou v ředící vodě. Expozice je 48 h. Možno i prolongovaný 10-14 denní test Hodnocené parametry: přežívání, aktivita, bioakumulace Testy s larvami pakomárů rodu Chironomus • OECD 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment • OECD 219 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Water • USEPA 2000 Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans Chironomus (pak( riparius Meig. omár) Midi* Midge (CkirpnQHut* ten fans} T ľ. Est Cíp* Sediment Toxicity Testing Charakteristika modelového druhu • rod Chironomus - řád dvoukřídí (Diptera) = hmyz s proměnou dokonalou • vajíčko-larva(4 instary)-kukla-imago • dominantní konzumenti 1. řádu v rámci sladkovodních akvatických \ v, ekosystém ů J^_ ^ ™te • značná abundance • kosmopolitní rozšíření • larvy - všežravci - živí se řasami, rozsivkami, detritem 10-denní test s larvami pakomárů rodu Chironomus Nasazovány larvy ve stadiu 2-3 instaru (cca 10 d staré) 10 jedinců/kádinku 100 ml sedimentu/175 ml vody Teplota 20±2°C Pravidelné krmení, vzduchování Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy Sledováno pH, kyslík, vodivost Po 10 dnech hodnoceno přežívání a růst Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans Nasazovány larvy mladší jak 24 h Podobné 12 jedinců/kádinku uspořádání jako 100 ml sedimentu/175 ml vody v10-denním Teplota 20 ± 2°C Pravidelné krmení, vzduchování Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy Sledováno pH, kyslík, vodivost Doba expozice 50-60 d (ukončeno 7 dní po posledním vylétnutí) Hodnocené parametry: 20-denní přežívání a váha (růst), vylétávání samiček a samečků - poměr pohlaví, doba vylétávání, počet nakladených vajíček, přežívání dospělců Celoživotní test - dle OECD #218/219 provádí se v 600ml kádinkách sediment artificiální nebo přírodní voda - studniční, povrchová, provozní, uměle připravená sediment: voda 1:4 20 ±2°C, 500 - 1000 lux, 16L : 8D kontaminace: sedimentu vody nad sedimentem koncentrační řada: aspoň 5 koncentrací f<2 kvalita vody - pH 6-9, rozpuštěný kyslík -aspoň 60% ASV, změřit tvrdost a amoniak vzdušnění - Pasteurovou pipetou (jemně) A. nylonová síťka B. plastový kryt C. kádinka bez zobáčku D. otvory na výměnu vody E. sediment Celoživotní test - dle OECD #218/219 • 1-4 dny staré larvy vysazujeme do sedimentu • 20 jedinců/kádinka • počet opakování: 3 - ECx; 4 - NOEC, LOEC • krmení- tetrafinR, 0,25-0,5 mg/larva/den • délka trvání - 28d (C.riparius) Celoživotní test - dle OECD #218/219 Cílové parametry: • procento líhnutí dospělou: "„ ER\ procento líhnutí dospělců (emergence ratio) na. počet jedinců vysazených do kádinky ne. počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu) Přijatelnost testu: ER kontroly >0,7 • střední čas vývoje: čas od vysazení do líhnutí • střední rychlost vývoje: x: střední rychlost vývoje v kádince /': index intervalu mezi pozorováními m: počet všech intervalů mezi pozorováními ff. počet vylíhnutých jedinců během daného intervalu ne. počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu) x;. rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu / den;, den pozorování (od začátku) /,: délka intervalu mezi pozorováními (obvykle 1 den) ECx Regresní analýza NOEC, LOEC ANOVA Závislost citlivosti na pohlaví Chi-square Procento vylíhnutých jedinců Cochran-Armitage test, Fisher's exact test, Mantel-Haentzal test s Bonferroni-Holm úpravou p-hodnot, ANOVA (+arsin transformace) 1 xi =--------------------- denf —IJ2 Endokrinní disrupce (ED) = narušení hormonální rovnováhy organismů s potenciálními negativními následky pro celkovou homeostázu, reprodukční, vývojové a behaviorálních funkce Projevy u bezobratlých: Narušení reprodukce, rodivosti (fekundita) Poruchy růstu, sexuálního dozrávání (maturace) Narušení sexuálního dimorfismu, Intersex, Imposex další procesy řízené hormony: pigmentace, regenerace končetin, diapauza Sagi et al. (2003) - Cherax quadricarinatus Rudolphi (1999) - Samastacus spiniformis Suzuki (1999) - Armadillidium vulgare Jungmann et - Gammarus al. (2004) fossarum Barkietal. (2003) SUBLETALNI TOXICITA U VODNÍCH MĚKKÝŠŮ - vodní měkkýši využíváni jako testovací organismy pro vyhodnocení účinků endokrinních disruptoru ve vodním prostředí Test sedimentů s písečníkem novozélandským Potamopyrgus antipodarum - vhodný a efektivní nástroj pro testování přírodních sedimentů a čistých látek - finančně atraktivní varianta oproti chemickým analýzám sedimentů Parametry ^jPotamopyrgus sediment testu" trvání 4 týdny (popř. 8 týdnů) nádoba objem 1 I médium 800 ml vody expozice statická, 50 g sedimentu odběry 20 jedinců po 4 (8) týdnech mortalita; zmeny v morfologii pohl. organu; parametry „ . u - - u -u r* V* r počet embryí, pomer embryí bez ulity a s ulitou + nízké nároky na kultivace - nedostatečná velikost pro biochemické analýzy Příprava Typy sedimentů o přírodní o artificiální listová hrabanka + křemitý písek o spajkovaný artificiální sediment vyhodnocení efektů čistých látek (1) spajkování artificiálního sedimentu. (2) po odpaření solventuje přidáno medium (3) ustavení rovnováhy mezi sedimentem vodou, po 4 dnech přidáni šneci. Médium - voda s přídavkem NaHC03, CaC03 - 16°C, 700±100|jS/cm L:D16:8 Komerční rasové Expozice, vyhodnocení Parametry: mortalita a počet plně vyvinutých a nezralých embryí (Xeno)estrogenní účinek ethinylestradiol, bisfenol A, octylfenol, nonylfenol Xenoandrogenní účinek tributylcín, trifenylcín Biomonitoring dnových sedimentů (Nisa, Odra) Kontaktní Testy Toxicity - ovlivňující faktory Faktory mimo kontaminace • zrnitost sedimentů • obsah a typ jílu • obsah a charakter organického uhlíku • struktura a vlastnosti huminových látek/organického materiálu •pH • obsah kyslíku • toxicita amoniaku /sulfidů • aktuální stav testovací populace • výživa Změny toxicity sedimentů díky vzorkování a experimentálnímu postupu - promíchání více kontaminovaných sedimentů s tenkou vrstvou na rozhraní vody-sedimentů - oxidace a precipitace redukovaných kovů díky provzdušňování požadovanému v testu toxicity Testy bioakumulace • Kontaktní testy - celý sediment • 28-56 dní expozice • ln-situ a/nebo Ex-situ testy pro zhodnocení příjmu kontaminantů organismy • Používány zejména na lokalitách kontaminovaných bioakumulativními látkami (PAHs, PCBs, rtuť, PCDDs/PCDFs, ...) • Výsledky porovnávány s referenčními lokalitami a/nebo povolenými limity • Druhy: různonožec (Hyalella azteca), máloštětinatci (Lumbriculus variegatus, nitěnka obecná) Integrated assessment of aquatic ecosystems Determination of macrozoobenthos saprobic index functional feeding groups life form index evenness & diversity subject: water Test subject: sediment native & concentrated surface water whole sediment, sediment pore water, - elutriate and organic - extracts Chemical analyses organical analyses limnochemical parameters heavy metals In situ testy • Klecování - měkkýši, ryby, další bezobratlí, • Mortalita, zdravotní stav, příp. reprodukce a specifické biomarkery v exponovaných organismech • Subletální biomarkery, histologie THE SEDIMENT QUALITY "QUADRAD"