Hodnocení toxických vlastností:
Vyhodnocení ekotoxikologických
testů
Teorie zdravotní
kondice ve vztahu k expozici toxickou látkou
Hodnocení ekotoxikologických dat
- Úplnost dat
- Správnost dat
• Spolehlivost: jak dobře je studie provedena, jak jsou interpretovány výsledky?
Jsou aplikovány a dodrženy standardní metodiky?
• Relevance: je použitý test vhodný? Jsou výsledné parametry stanoveny za relevantních podmínek?
• Interpretace dat: nezbytné využití expertních znalostí
•Např. pokud je trvání testu odlišné, sledované parametry různé (NOEC -EC50)....
Faktory ovlivňující toxicitu
•Původ organismů
• Aklimatizace
• Abiotické faktory
- Foto-indukovaná toxicita -pH
- Tvrdost -Teplota
- Obsah kyslíku
- Organické látky
• Fyziologický stav •Věk •Pohlaví
Odpověď na stres: prahová, bezprahová a hormeze
•Prahová - žádná biologická odpověď při nízké dávce, pak se odpověď projeví se vzrůstající dávkou
• Bezprahová - bez biologické odpovědi pouze na nulové koncentraci
•Hormeze - počáteční biologická odpověď na toxikant je pozitivní, při vzrůstu koncentrace se stává negativní (příp. naopak?)
Prahová odpověď
Bezprahová odpověď
Hormeze
Increasing concentration of sllclochemicals------->
Hodnocení ekotoxikologických účinků - prahová odpověď
Hodnocení vztahu dávka-odpověď:
ke stanovení „predicted no effect concentration" (PNEC)
= předpokládaná koncentrace nezpůsobující žádný účinek
• Identifikace nebezpečnosti: identifikace škodlivých účinků
Hodnocení ekotoxikologických účinků
• PNEC: PEC < PNEC: zajišťuje komplexní ochranu prostředí
• PEC = predicted environmental concentration = očekávaná environmentální koncentrace
• Výpočet PNEC:
násobení NOEC nebo EC50 přepočtovým faktorem (faktorem nejistoty) za využití statistických extrapolačních technik
•Přepočtové faktory jsou používány k zohlednění nejistot
• Nejistoty:
- intra- a inter-laboratorní variabilita v toxikologických datech
- intra- a inter-druhové rozdíly (biologická variabilita)
- extrapolace z krátkodobých na dlouhodobé
testy
- extrapolace z laboratorních dat na situaci v prostředí (synergistické, aditivní a antagonistické účinky...)
Hodnocení ekotoxikologických účinků
Akvatické prostředí:
Základní data: akutní toxicita pro ryby akutní toxicita pro bezobratlé
test inhibice růstu na řasách Assessment factors to derive a PNEC aquatic	Faktory nejistoty = bezpečnostní faktory
	Assessment factor
At least one short-term L(E)C50 from each of three trophic levels of the base-set (fish, Daphnia and algae)	1000
One long-term NOEC (either fish or Daphnia)	100
Two long-term NOECs from species representing two trophic levels (fish and/or Daphnia and/or algae)	50
Long-term NOECs from at least three species (normally fish, Daphnia and algae) representing three trophic levels	10 (
Field data or model ecosystems	Reviewed on a case by case basis
Species sensitivity distribution (SSD method)	5-1, to be fully justified on a casa by case basis
Species Sensitivity Distribution
(SSD)
Acute LC50 values of Carbaryl for 34 aquatic invertebrate species. The fitted log-normal SSD has a mean of 3.497 and a standard deviation of 2.063. "
100%
60%
2o% io% o%
I
-ä "5
■JI
.2 n
o 40°
S.
20-.-Í
List of tested endangered species
0%
	
	/f
	
	
0.I
1. Apache trout
2. Greenback cutthroat trout
3. Shortnose sturgeon
4. Fountain darter
5. Greenthroat darter
6. Bonytail chub
7. Lahontan cutthroat trout
8. Colorado pikeminnow
9. Gila topminnow
10. Spotfin chub
11. Razorback sucker
12. Cape Fear shiner
13. Boreal toad
C. dubia WQC
10 100 1000
Carbaryl concentration (|jg / L)
1 0000
P.promejas Colorado pikeminnow
ela
4*
13
Razorback sucker
910
D. magna
Bony Tail
12
Chub
o.i
i
io ioo
Carbaryl, ug/L
iooo
ioooo iooooo
Křivka dávka - odpověď: základní nástroj pro hodnocení toxických vlastností látek
Křivky dávka-odpověď jsou založeny na normálním rozložení biologických
proměnných
Populační odpověď na toxické látky je zpravidla skloněná nalevo
Koncept individuální tolerance: základ modelu vztahu dávky-odpovědi
• individuální účinná dávka (IED) -minimální dávka vedoucí ke smrti jedince
• geneticky určená pro každého jedince
ConcerMraliOrt
Křivka dávka-odpověď
• Graf ukazující biologickou odpověď, např. enzymu, proteinu, populace či společenstva na rozmezí koncentrací polutantu
•Křivka mortality - obvykle zobrazována jako závislost kumulativní mortality na vzrůstající koncentraci
Experimentální design pro testy
toxicity
Pokud nemáme podkladová data - pro úsporu materiálu při hledání lineární části odpovědi -> doporučen dvoustupňový proces
Krok 1 - Skríningový test
Exponovat 5-10 organismů 10x koncentrační řadě po 24-96 h Cílem určit rozmezí kde se nachází 50 % letální koncentrace (LC50)
o o
\0
©
# mrtvých žádný
žádný
[X] mg/L
několik
0 0 30%
všichni
100%
všichni
100%
Koncen. 10-3
10-2
10-1
100
101
Krok 2 - Definitivní test
Zpředchozích výsledků - stanovit rozmezí testu
dolní = 10-2 = 0.01 mg/L horní = 100 = 1.0 mg/L
• Provést test s využitím logaritmického měřítka koncentrací, protože organismy zpravidla odpovídají logaritmicky na toxikanty
• Obvykle použít alespoň 5 koncentrací + kontrola
- Kontrola-ověřuje toxicitu pozadí, ředící vody, media, zdravotní stav organismů, vliv stresu testovacího prostředí
(testovací nádoby, osvětlení, teplota, atd.)
- Validita testu!! např.úhyn >10% kontrolních organismů -> neplatný test!
Příklad uspořádání definitivního testu
Pokus. zásah	Ředění	Koncentrace (mg/L)
1	10-2	0.01
2	10-1.5	0.032
3	10-1	0.1
4	10-0.5	0.32
5	100	1.0
Kontrola		0.0
Design testu toxicity
Kontrola       6 mg/L
25 mg/L        50 mg/L 100 mg/L
Exponováno 20 jedinců/koncentraci
Odpověď po 24 hodinách, jedinců
0
0
1
13
17
Odpověď po 96 hodinách, jedinců
0
0
9
15
20
Výsledek testu
Koncentrace	Kontrola	6 mg/L	12 mg/L	25 mg/L	50 mg/L	100 mg/L
Účinek 24 h	0%	0%	5%	30%	65%	85%
Účinek 96 h	0%	0%	20%	35%	75%	100%
Ideální křivka dávka - odpověď
Ideální křivka dávka - odpověď
Logaritmické měřítko Křivka - sigmoidní tvar
Hodnocení ekotoxikologických účinků
• Sledované parametry testů toxicity
krátkodobé studie:
• LC50 (letální koncentrace)
• EC50 (účinná koncentrace)
dlouhodobé studie :
• NOEC (no observed effect concentration)
• LOEC (lowest observed effect concentration)
• EC10 (10 % effects concentration)
• ECx ( x % effects concentration)
• MATC (maximal acceptable toxicant concentration)
Parametry které mohou být vypočítány
z křivky dávka-odpověď
LD50 - účinná dávka, která způsobí 50% mortalitu testovacích organismů
LC50 - 50% letální koncentrace - účinná koncentrace, která způsobí 50% mortalitu testovacích organismů
EC50 - účinná koncentrace, která způsobí účinek (snížená reprodukce, růst atd.) u 50% testovacích organismů, či která způsobí 50 % maximálního účinku, 50% odpověď v testovací populaci (mg/L, ml/L...)
IC
r50 - inhibiční koncentrace, která sníží normální odpověď o 50%
Další zahrnující jinou percentuální změnu (10%, 20%, atd.) EC05, EC20, EC90, ... Rozmezí EC20 - EC80
Letální účinky \
Stanovované parametry
NOEC: No Observed Effect Concentration. Nejvyšší testovaná koncentrace látky, která nezpůsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou
LOEC: Lowest Observed Effect Concentration. Nejnižší testovaná koncentrace látky, která způsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou. Nejbližší vyšší koncentrace než NOEC.
NOEL: No Observed Effect Level. Nejvyšší testovaná dávka látky, která nezpůsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou
NOAEL: No Observed Adverse Effect Level. Nejvyšší testovaná dávka látky, která nezpůsobila negativní účinek. Je pozorován účinek, ale není považován za nebezpečný.
Letáli
LOEC
Odhad EC50
Všechny testy toxicity se snaží určit hladinu toxikantu, která způsobí nebo nezpůsobí
žádný účinek
MATC
• Maximum Allowable Toxicant Concentration
• maximální povolitelná koncentrace toxikantu
- geometrický průměr NOEC a LOEC
- často nazývaná "chronická hodnota"
Testované koncentrace
Kvalita výsledků je určena správným výběrem testovaných koncentrací
EC0 EC100
-;-
vzrůstající log koncentrací
• Testované koncentrace by měly pokrývat rozmezí od koncentrací nevykazujících žádný účinek až po 100 % letální koncentraci
•Dobře vybraná koncentrační řada pro stanovení EC50/LC50 má jednu
koncentraci blízko EC50, a nejméně dvě koncentrace s částečným účinkem pod a nad EC50 - rozložených symetricky.
• Koncentrační řada by měla být v geometrickém měřítku. Ředící krok (koeficient) obvykle 2 až 10
•Příklady koncentračních řad:
-1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 látky s mírným sklonem odpovědi (některé pesticidy); koeficient ředění 10. -1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 ; příkřejší odpověď, koeficient 2.
•Dobře vybraná koncentrační řada pro stanovení LOEC/NOEC má několik koncentrací v oblasti nízkých odpovědí, nad a pod očekávanou LOEC a relativně nižší ředící koeficient (< 2)
Stanovované parametry
NOEC
• No Observed Effect Concentration
= nejvyšší koncentrace, která ještě nevyvolává účinek statisticky významně odlišný od kontroly
• Odpověď populace v testovaných koncentracích je porovnávána s kontrolou
• Hledáme nejvyšší koncentraci, která nezpůsobuje toxickou odpověď
Příklad určení NOEC
Porovnáváme 3 testované koncentrace s kontrolou
\ Přežívající dafnie v kontrole	20	20	20	20	20
P^ v      v r           my r Přežívající dafnie v koncentraci	19	20	20	20	20
5 mg/L					
P^ v      v r           my r Přežívající dafnie v koncentraci	19	20	20	19	19
10 mg/L					
P^ v      v r           my r Přežívající dafnie v koncentraci	18	19	19	19	19
20 m/L					
Stanovení NOEC
• Studentův t-test • ANOVA (Analýza rozptylu)
Dunnettůvtest Williamsůvtest • LSD test
Studentův t-test
1 Control		5 mg/L
Average value	20	19,8
Variance	0	0,2
No of observations	5	5
Difference	4	
t stat	1	
P(T<=t) (1) S	0,18695	N
t krit (1) f	2,131846	)
P(T<=t) (2) ^	0,373901	
t krit (2)	2,776451	
1 Control 1 10 mg/L		
Average value	20	19,4
Variance	0	1 0,3
No of observations	5	5
Difference	4	I
t stat	2,44949	I
P(T<=t) (1) X	0,035242	\ 1
t krit (1) (	2,131846	;
P(T<=t) (2) \	0,070484	
t krit (2)	2,776451	
1 Control 1 20 mg/L		
Stř. hodnota	20	18,8
Rozptyl	0	0,2
Pozorování	5	5
Rozdíl	4	
t stat	6	
P(T<=t) (1) /	0,001941	\
t krit (1) í	2,131846	)
P(T<=t) (2) \	0,003883	
t krit (2)	2,776451	
Výsledek analýzy rozptylu
X
C
1 3 10
Koncentrace (mg/L)
30 100
Nevýhody stanovených parametrů
• Jejich hodnota je silně závislá na designu experimentu a na:
-Počtu opakování
-Počtu testovaných koncentrací
- Proceduře výběru koncentrací -Přirozené variabilitě systému
- Použitých statistických metodách
Výpočet EC50
• Interpolační metody
- Dvou dávková metoda
- Probitová analýza
- Logitová analýza
- Lineární regrese
- Nelineární regrese
Křivka dávka - odpověď
Interval spolehlivosti EC50
Dvou dávková metoda
log(EC50) = x50 = x1 + ——— (x2 - x1)
P2 - Pl
• Nejjednodušší metoda odhadu
• Pokud je EC50 zhruba známá
• Jedna koncentrace v intervalu (20;
50)
80)
Letální účinek
EC0 EC100
---
vzrůstající log koncentrací
• Druhá koncentrace v intervalu (50;
• Interval (20; 80) je zhruba lineární pro účinek vs. log koncentrací
Analýza křivky dávka-odpověď
PROBITOVÁ TRANSFORMACE
• Založeno na hypotéze že resistence k toxikantůmje normálně rozložena
• Použít probitovou transformaci pro usnadnění analýzy
• Založeno na směrodatných odchylkách, takže každý probit je spojen s procenty odpovědi
•Průměrná odpověď je definována jako probit = 5, všechny probity jsou pozitivní -> snažší vizualizace
• Je možno využít probitovou analýzu k výpočtu LC50 protože probitová transformace zlinearizuje (narovná) kumulativní distribuční křivku
Probitová analýza
• Odpověď organismů na toxické látky = normální distribuce
• Není možné měřit přímo normální rozložení, neboť účinek je kumulativní - zobrazení grafu kumulativní distribuce
Normální rozložení
Kumulativní distribuce
Dávka
Log Dávka
Probitová analýza
Lineární regrese: závislost účinku na log koncentraci
100
75
50
25
0
0
i
0,5
1,5
2
2,5
3
1
log c
Převedení křivky dávka-odpověď na přímku
(lineární odpověď)
•   Problematické hodnotit křivku
•Převedení křivky dávka-odpověď na přímku by hodnocení usnadnilo
O
5°
Kumulativní distribuce
Transformováno na Probit
00
Přímka (snadnější analýza)
Log Dávka
Log Dose
%	probit	%	probit	%	probit	%	probit	%	probit	%	probit
0,2	2,122	10,0	3,718	30,0	4,476	50,0	5,000	70,0	5,524	90,0	6,282
0,4	2,348	11,0	3,773	31,0	4,504	51,0	5,025	71,0	5,553	91,0	6,341
0,6	2,488	12,0	3,825	32,0	4,532	52,0	5,050	72,0	5,583	92,0	6,405
0,8	2,591	13,0	3,874	33,0	4,560	53,0	5,075	73,0	5,613	93,0	6,476
1,0	2,574	14,0	3,920	34,0	4,588	54,0	5,100	74,0	5,643	94,0	6,5S5
1,2	2,743	15,0	3,964	35,0	4,615	55,0	5,126	75,0	5,674	95,0	6,645
1,4	2,803	16,0	4,006	36,0	4,642	56,0	5,151	76,0	5,706	95,5	6,695
1,6	2,856	17,0	4,046	37,0	4,668	57,0	5,176	77,0	5,739	96,0	6,751
1,8	2,903	18,0	4,085	38,0	4,695	58,0	5,202	78,0	5,772	96,5	6,812
2,0	2,946	19,0	4,122	39,0	4,722	59,0	5,228	79,0	5,806	97,0	6,881
2,5	3,040	20,0	4,158	40,0	4,747	60,0	5,253	80,0	5,842	97.5	6,966
3,0	3,123	21,0	4,194	41,0	4,772	61,0	5,278	81,0	5,878	98,0	7,054
3,5	3,188	22,0	4,228	42,0	4,798	62,0	5,305	82,0	5,915	98,2	7,096
4,0	3,249	23,0	4,261	43,0	4,824	63,0	5,332	83,0	5,954	98,4	7,144
4,5	3,305	24,0	4,294	44,0	4,849	64,0	5,358	84,0	5,994	98.6	7,197
5,0	3,355	25,0	4,326	45,0	4,874	65,0	5,385	85,0	6,036	98.8	7,257
6,0	3,445	26,0	4,357	46,0	4,900	66,0	5,412	86,0	6,080	99,0	7,326
7,0	3,524	27,0	4,387	47,0	4,925	67,0	5,440	87,0	6,126	99,2	7,409
8,0	3,595	28,0	4,417	48,0	4,950	68,0	5,468	88,0	6,175	99,4	7,512
9,0	3,659	29,0	4,447	49,0	4,975	69,0	5,496	89,0	6,227	99,6	7,652
										99,8	7,878
Vztah mezi normálním rozložením a směrodatnými odchylkami
34.13%
-2 -1 0 1 2
Směrodatná odchylka
Je složitější pracovat se směrodatnými odchylkami (34.13, 13.6, atd) -
převedení SMODCH na probity
34.13%
3 4 5 6 7
Probity
Příklad probitové analýzy
Koncentrace (mg/L)	Mortalita	%
Kontrola	0/10	0
0.3	0/10	0
1	0/10	0
3	1/10	10
10	4/10	40
30	9/10	90
100	10/10	100
Prohlédnout data -> zřejmé, že LC50 by měla být mezi 10 a 30 mg/L Graf -> fit line by eye (cca stejný počet nad a pod křivkou)
Výsledkem testu log normální distribuce (sigmoidní křivka)
Transformace dat : Krok 1 změnit osu "koncentrací" na logaritmické
měřítko
Transformace dat: Krok 2
Převést % odpovědi na lineární formu - např. probit nebo logit - využití probit- nebo logit-linearizované křivky dávka - odpověď
Lineární regrese - probit vs. Log koncentrace
Výsledné přímky nejsou příliš
rozdílné
'*Logit
Log koncentrace
Parametry toxicity odvozeny z křivek dávka-odpověď
Probit
-1 sd    mean   +1 sd    +2 sd log (concentration)
Odhad LC/EC z přímky lineární regrese Y = a + bX
• Y - transformovaný logit/probit, •X - log C,
• b - sklon regresní přímky,
• a - intercept regresní přímky vypočítat log(LC50) vypočítat LC50=10log(LC50)
Využití LC50
1. Aplikační faktor
-LC50 x n =_= povolená dávka
-   Dobrá pokud nemáme lepší informaci (chronické testy)
2. Zhodnocení rizika -> nižší LC50 = toxičtější
3. Vede k chronickému testování
•LC50 z akutního testu neposkytuje ekologicky relevantní výsledek -> potřeba testování na více ekosystémové úrovni
•    Probit je kompromis mezi proveditelností, náklady a možností získat dostatečná data pro rozhodnutí o environmentální toxicitě látky
Srovnání dvou toxikantů
Látka s odpovědí, kterou zobrazuje červená křivka je toxičtější než ta se žlutou křivkou
Testy toxicity mohou být využity ke zhodnocení rozdílů v toxicitě dvou látek (pozor při interpretaci!)
Sklon křivky dávka - odpověď
Důležitý pro odhad trendu toxicity.
Toxikant s mírným sklonem může být nebezpečný na nízkých koncentracích i když EC50 je vysoká.
dafnie ryb y artemie
Log koncentrace
Modely vztahu čas-odpověď
Hormeze
počáteční biologická odpověď na nižších koncentracích toxikantu vykazuje opačný trend než při vzrůstu koncentrací
• Vztah mezi expozicí kontaminantu a odpovědí organismu může být komplikovanější než se dříve věřilo
• Vysoké a nízké dávky kontaminantu mohou mít na organismus rozdílný vliv (hormeze neznamená, že účinky nízkých dávek jsou prospěšné, jenom to že jsou odlišné!!)
• Zapracování konceptu hormeze do ekotoxikologie a hodnocení ekologických rizik je v současnosti limitováno nedostatečnou znalostí mechanismu hormeze
V! CD
i/i
Ol
o
o
o o
Response I mprqvsd í u netto n    DysÍLmcti on
š
CD O
ČD Ö Q)
03
CD N CD
Responsa
H   Dysfunction      Improved lünction ^-
Teoretická křivka hormeze III
Maximum S;im*li:ion
Doře
2,4-D (ppmj Benzene (LN dilnlicn)
Calabrese and Baldwin (2003)
V   AO -
z 20 ^
CELdrniurr and Aquatic Dl?int (H. verriyllarttj Nrrals Hsdurtass Activity
i -■001
Q.1        1 10
Cadmium |uMj
40 90
	
	iW ■
\	140 ■
	
V.	
	10U ■
	an -
=	
>-	tifl. -
1	i* ■
I	50 ■
	S ■
Copperz-ti Hydra Reprrjduclion
B 10 C'rpp&f (ug/L)
i-;
if.
3»
I1-I1:
1 » 3 *
**	(1)
	
Araenrle -Erd Hgn-irt ^photylO UNA S>rtr.hOsr$	
0.1        OS 1 1
SOdum areenrfc (X10-& Hr
II 100-
J 50
"    cAUP flwil / A / femi \		(p)
Pjelinoic Ac c end ^*		_   * He*
FI^L Granges* C*|t§		
		***
1*10-10     1X10-9 1X10-8
Rsurric. acid (Ml
ixio-e
Calabrese and Baldwin (2003)
Regulační souvislosti
• Obecně používán prahový model pro ne-karcinogeny, a lineární bezprahový model pro karcinogeny (včetně radiace; EPA, FDA, a NRc).
•Přechod na model hormeze by pravděpodobně zmírnil některé limity pro polutanty ve vzduchu, vodě, potravinách a půdě.
• To by mohlo vést ke zmírnění nákladů na dodržování environmentálních limitů a na remediační projekty.
• Tato změna ale není moc pravděpodobná, i když s ukazuje, že mnoho toxikantů vykazuje prahové nebo hormezní působení v nízkých dávkách