1
1
,,Toxicita & genotoxicita na prokaryotických mikroorganismech",,Toxicita & genotoxicita na prokaryotických mikroorganismech"
2010 Přednášející: Pavel Čupr
Ekotoxikologické biotestyEkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty
,,Možná, že se vám pane
doktore zdá, že tady nikdo
není.
Ale já ji tuším, tu bestii
bakteriální!"
Kresba  Pavel Kantorek
2
2
3
Správné nasazení testů toxicity
NBEZPEČNOST
Klasifikace
nebezpečných
látek
Chemické
analýzy
Black
box
$
Testy toxicity
Fenol kadmium BaP
.........
4
TEST TOXICITY:
experimentální design
BIOTA
(bakterie)
+
KONTAMINANT
vzorek z ŽP
(40 %)
- Testy jsou prováděny v adekvátní ředící řadě!
- Biologický materiál jen ve stejné kvalitě,
- Standardní podmínky testu.
- co nejméně ředit vzorek (80 %) ­ "falešná nezávadnost"
? EFEKT ?
+ LOEC,
NOEC, EC50, IC50,..
3
5
Provedení testu na bakteriích
Testovací kultura
(uchovávání, kultivace)
Vzorek
(odběr, úprava, ředění)
Reakční systém
(optimální podmínky)
Vybraný
parametr
Kvantifikace
(vizuální, instrumentální)
Odpověď
Hodnocení
6
Provedení testu na bakteriích
Testovaný vzorek Inkubace Odpověď
Hodnocení
Negativní kontrola Inkubace Odpověď
Blank Inkubace Odpověď
Negativní kontrola: vzorek nahrazen rozpouštědlem
Blank: není testovací kultura
Pozitivní kontrola
4
7
vztah "dávka - účinek"
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Intenzita stresu - dávka (koncentrace)
účinek(%)
Převzato z metodického návodu Guidelines for E.R.A. (U.S. EPA 1998).
- Všechny testy toxicity i genotoxicity by měly být aplikovány v experimentech typu ,,dávkaodpověď".
Vzhledem k velmi obdobnému tvaru těchto funkčních závislostí pro téměř všechny
navrhované biologické systémy lze vymezit obecné principy hodnocení výstupů.
- Kvantifikované parametry získané z křivek ,,dávka-odpověď" doplněné relevantními mírami
variability jsou vstupem do procesu posuzování rizika.
8
ECHA BIOCIDE Monitor
Impregnace
kultura Bacillus species
indikátorové barvivo
(terzoliového typu)
živné médium
Kontakt se vzorkem
Voda (extrakt) Sediment, pda, odpad
Bílá Ržová (tečkovaná) Červená
Toxický Mírn toxický Netoxický
10 s kontakt se vzorkem
18 - 24 hodin inkubace (dle typu použité bakterie) 35-37 oC
5
9
ECHA BIOCIDE Monitor
ECHA Biocide Monitor II.
Organismus Bakterie ­ rodu Bacillus (G+).
Princip Test je založen na použití malého absorpčního papírku, který je
impregnován testovacím organismem a indikátorovým barvivem
bakteriálního růstu (tetrazoliová sůl). Barvivo se redukuje v závislosti
na koncentraci dehydrogenáz, které produkují přítomné bakterie.
Vyvinutá barva se interpretuje podle přiložené stupnice: toxický vzorek
- bílá, růžová nebo tečkovaná - jako mírně toxický, červená - netoxický,
(Dutka a Gorrie 1989).
Trvání testu Kontakt systému se vzorkem 10 sekund + 18-24 hodinová kultivace až
do vytvoření barvy na proužku s kontrolním vzorkem.
Teplota 35 ­ 37 o
C.
10
GIT ­ růstově inhibiční test (EN ISO 10712, ČSN 75 7730 )
Turbidimetrický test ­ EN ISO 10712, ČSN 75 7730
Organismus Pseudomonas putida (případně fluorescens) G-.
Princip Principem tohoto testu je kultivace bakteriálního inokula v tekuté živné
půdě se vzorkem. Se zvyšující se rychlostí růstu vzniká intenzivnější
zákal. Průběh testu se sleduje měřením tohoto zákalu turbidimetricky
(Dutka et Kwan, 1982).
18 hodinové bakteriální inokulum se naředí na požadovanou hustotu a
nasazuje se do testovaných vzorků a kontroly ve zkumavkách. Po 16
hodinové kultivaci v termostatu se měří absorbance při 560 nm a
vypočte se % inhibice mikrobiálního růstu ve srovnání s kontrolou.
(Alternativní  je 650 nm, která je optimální pro Pseudomonas
fluorescens) (Dočkal et Soldán, 1988).
Reakční směs (V) 100 ml dle ČSN, případně nižší.
Předkultivace 18 hodin.
Trvání testu 16 1 hodin (6).
Teplota 23 1 o
C.
Třepání Urychluje průběh testu (není podmínkou).
Pozitivní kontrola 3, 5 ­ dichlorfenol.
Aseptická práce Velmi limitující pouze při zakládání testu a při uchovávání kultury.
Doporučení Finančně velmi výhodný test. Vhodný k testování odpadů ­ toxických
vzorků bez vysokého zákalu a zabarvení.
6
11
Miniaturizace testů
12
Miniaturizace testů
7
13
Miniaturizace testů
14
Miniaturizace testů
SPECT RA Rainbow Thermo; Serial num ber: ; Firmware: V2.03; XREAD PLUS Version: V 2.00
User com ment:
M easurem ent m ode: Absorbance
M easurem ent filter: 610
Raw data
<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,0670 0,0650 0,0650 0,0680 0,0670 0,0680 0,0720 0,0750 0,0710 0,0670 0,0680 0,0590
B 0,0550 0,0560 0,1870 0,1650 0,1940 0,1470 0,1150 0,0670 0,0640 0,0800 0,0710 0,0610
C 0,0620 0,0520 0,1680 0,1670 0,1700 0,1500 0,1280 0,0660 0,0620 0,0710 0,0800 0,0600
D 0,0630 0,0560 0,1570 0,1910 0,1680 0,1530 0,1250 0,0670 0,0680 0,0830 0,0760 0,0570
E 0,0620 0,0570 0,2100 0,0880 0,0650 0,0660 0,0750 0,0720 0,0650 0,0780 0,0680 0,0650
F 0,0710 0,0560 0,2150 0,0910 0,0820 0,0700 0,0680 0,0670 0,0650 0,0740 0,0650 0,0540
G 0,0730 0,0550 0,2050 0,0810 0,0720 0,0690 0,0750 0,0680 0,0670 0,0750 0,0790 0,0610
H 0,0780 0,0750 0,0780 0,0640 0,0780 0,0620 0,0670 0,0730 0,0730 0,0690 0,0690 0,0610
Závislost inhibice růstu Pseudomonas putida na
přítomné koncentraci - 3,5-dichlorfenol
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
koncentrace dichlorfenolu
inhibicebakteriálního
růstu
Měřené hodnoty v
uživatelském rozhraní EXCEL
8
15
Postup
16
Vyhodnocení testů
Testovaný vzorek Inkubace Odpověď
Hodnocení
Negativní kontrola Inkubace Odpověď
Blank Inkubace Odpověď
Aktivita (t1h) - Aktivita (t0h) v.s. negativní kontrola
% inhibice (jako sledovaný efekt) = [(At1-At0) / (Akt1-Akt0)] * 100
Negativní kontrola: vzorek nahrazen rozpouštědlem
Blank: není testovací kultura
Pozitivní kontrola
9
17
ScreeningovScreeningovéé testy toxicitytesty toxicity -- aplikace testaplikace testůů nana
prokaryotickýchprokaryotických mikroorganismechmikroorganismech
18
MICROTOX
10
19
MICROTOX
Microtox
Organismus Vibrio fischeri (G-)
Princip Jsou to testy na mořské luminiscenční bakterii
Vibrio fischeri (ISO 11348 1998). Po proběhlé
expozici je měřeným paramentrem inhibice
bioluminiscence. Kinetika inhibice je nejčastěji
sledována v následujících expozičních intervalech:
5, 15 a 30 minut s použitím jemné ředící řady vzorku
1:1.
Vzorky by měly být před měřením upravovány: pH,
salinita (2 %). Je-li hodnota pH v rozmezí od 6 - 8,5,
není nutné pH upravovat (BioOrbit 1996).
Při úpravě pH je nutné citlivě připravit roztok HCl či NaOH o takové
koncentraci, která optimálně upraví pH roztoku co nejmenším objemem
­ tím lze zabránit nežádoucímu naředění vzorku. Celý test probíhá při
teplotě 15 o
C. Test má také variantu "solid phase".
Reakční směs (V) 1 ml. Poměr vzorek:inokulum je 500:500 l, případně i 800:200 l.
Předkultivace 10 ­ 15 minutová resuscitace lyofilizované bakterie (15 o
C).
Trvání testu 5, 10, 15, 20, 30 minut. Sleduje se jen jeden endpoint, nebo kinetická
odpověď bakterie v několika zvolených intervalech.
Teplota 15 o
C.
pH Optimum 6 ­ 8,5 pH.
Třepání Ne.
Pozitivní kontrola ZnSO4.
Aseptická práce Není nutná.
20
MICROTOX
FMNH2 + RCHO FMN + RCOOH + H2O + 0,1 h
O2
-Celkový kvantový výtěžek bioluminiscence, tj. počet kvant vyzářených na
jednu molekulu spotřebovaného substrátu, činí asi 0,1.
-Bioluminiscenční systém je vlastně boční větví elektronů ve flavoproteinové
části aerobního respiračního řetězce.
- Mezi oběma větvemi toku elektronů existuje soutěživý vztah.
Přitom afinita luciferázového systému ke kyslíku je větší než
systému respiračního, takže při nedostatku kyslíku klesá
rychlost respirace, a to až na 10 % maximální rychlosti, aniž je
dotčena intenzita luminiscence.
-Emise světla je silně
exergonický proces.
11
21
MICROTOX
ČSN EN ISO 11348-(1)
Název normy:
Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků
vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na
luminiscenčních bakteriích) - Část 1: Metoda s čerstvě
připravenými bakteriemi,
Třídící znak: 757734
Vydána: leden 2000
22
Mutatox
Mutatox
Organismus Využívání bakterie Vibrio fischeri - ,,dark mutant" - za normálních
podmínek neluminuje (G-).
Princip Jedná se o mutanta, u kterého je emise světla způsobena až reverzní
mutací za přítomnosti mutagenních látek. (Ulitzur et al. 1980).
Lyofilizované bakterie jsou rehydratovány a exponovány toxickou
látkou. Po 16-24 hodinách se měří emise světla luminometrem. Test je
prováděn s i bez enzymové aktivace S9. Použití +S9 je popsáno v práci
Johnson 1992,
aplikace bez -S9 v článku Kwan et al. 1990.
Reakční směs (V) 500 l.
Předkultivace 30 minut v 37 o
C vodní lázni.
Trvání testu 16 ­ 24 h.
Citlivost Dodání S9 směsi má tendenci zvýšit detekční limit a snížit jednotnost
výsledků, což může být vysvětleno nestandardními podmínkami pro
metabolizaci (bakterie vyžaduje jen 15 o
C, zatímco S9 směs byla
vyvinuta pro Ames test při 37o
C). S výsledky Mutatoxu také může
interferovat cytotoxicita (stejný případ i u Ames testu). Zde se však
může provést jako kontrola populačně růstový test založený na buněčné
hustotě. (Willemsen et al. 1995).
Byla potvrzena vysoká 93 % shoda s Ames testem (Legault et al. 1994).
Mutatox byl schopen z 82% správně odlišit (ne)karcinogenní látky ve
srovnání s Ames testem, který měl tuto schopnost nižší (73%).
Teplota 23 1 o
C.
Třepání Ne.
Pozitivní kontrola 2-AA, 2-AF, BaP..
Aseptická práce Ano.
Doporučení Test je doporučen provádět v kombinaci s Microtox testem, který mu
musí předcházet (Hauser et al. 1997).
12
23
ATP ­ TOX system
- ATP-TOX system využívá měření aktivity buněčné ATP jako indikátoru růstové inhibice.
- Adenosin trifosfát je velmi důležitá, vysoce energetická sloučenina, kterou syntetizují živé organismy
v buňkách pro ukládání lehce přenosné energie. Ta je využívána v buňkách v místě aktuální
potřeby. Pokud buňka začne z jakýchkoliv důvodů snižovat intenzitu metabolismu, lze citlivě
pozorovat snížení tvorby ATP (aniž by došlo k úplnému odumření buňky).
- Základní test pro měření ATP je založen na měření světelné luminiscence, která následuje po reakci
luciferinu s ATP za přítomnosti luciferázy a hořečnatých iontů. Tento systém může být využit pro
měření jakékoliv bakterie nebo řasy, která rychle roste v laboratorních podmínkách:
luciferáza
- luciferin + ATP + O2 --------------> oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + světlo (~562 nm)
Mg2+
- 18-24 hodinová buněčná kultura se naředí na potřebnou hustotu a přidá se k jednotlivým
koncentracím testovaného vzorku. Zkumavky se inkubují na rotační třepačce po dobu 5 hodin a po
té se měří celkové množství vyprodukované ATP pomocí luciferin-luciferázové aktivity (dodává se
luciferin-luciferázový roztok do testované směsi) na luminometru. Vzorek může inhibovat schopnost
přidané luciferázy měřit produkci ATP, proto je třeba ještě ověřit, zda tento jev nenastal. Celý
postup měření je stejný jako u ATP, ale místo bakteriální kultury se používá sterilní médium
stejného obsahu, jako je v bakteriálním inokulu. Testování vzorků, které způsobují vyšší inhibici
luciferázové aktivity, by mělo být zopakováno s podrobnějším ředěním.
24
ATP ­ TOX system
= ,,rozbití" buněčné stěny a uvolnění buněčného obsahu
včetně ATP
extrakční činidla: TCA, H2SO4, detergent - benzethonium
chlorid, DMSO...
možná inhibice luciferázy extrakčním činidlem ---> nutné
ředění (TCA) nebo neutralizace (benzethonium chlorid,
H2SO4)
Extrakce ATPExtrakce ATP
13
25
ATP ­ TOX system
StanovenStanoveníí ATPATP
ČAS
A
B
C
ATP StandardATP Reagent
LUMINISCENCE
26
ATP ­ TOX system
ATP-TOX systém
Organismus Libovolná kultura.
Princip ATP-TOX system využívá měření aktivity buněčné ATP jako indikátoru
růstové inhibice.
Základní test pro měření ATP je založen na měření světelné
luminiscence, která následuje po reakci luciferinu s ATP za přítomnosti
luciferázy a hořečnatých iontů. Tento systém může být využit pro měření
jakékoliv bakterie nebo řasy, která rychle roste v laboratorních
podmínkách (Dutka 1988). Zkumavky se inkubují na rotační třepačce po
dobu 5 hodin a po té se měří celkové množství vyprodukované ATP
pomocí luciferin-luciferázové aktivity (dodává se luciferin-luciferázový
roztok do testované směsi) na luminometru.
Vzorek může inhibovat schopnost přidané luciferázy měřit produkci
ATP, proto je třeba ještě ověřit, zda tento jev nenastal..
Reakční směs (V) 1 ml. (200 ul roztoku enzymu + 800 ul vzorku)
Předkultivace Závisí na typu kultivovaných buněk (18-24)
Trvání testu Po proběhlé expozici se provede rozrušení stěn buněk (činidlem ­ TCA,
trichloroctová kyselina, sono ­ ultrazvuk). Tím dojde k uvolnění ATP do
roztoku, ze kterého se odebírá 800 ul vzorku do reakční směsi.
Teplota Závislá na vybrané kultuře.
Třepání Doporučené.
Pozitivní kontrola Chemické látky musí být vybírány s ohledem na možnou inaktivaci
enzymu (viz princip).
Aseptická práce Ano
14
27
ATP ­ TOX system
Automatický BIOSENZOR
28
Organismus
(bakterie, řasa, korýš)
Kontaminant
Sorbovaný
podíl
Přirozená vazba
organismů
na pevné částice
Kontakt organismu s
kontaminantem
Částice
Rozpuštěný
podíl
Ka
Testy toxicity se vzorky pevné fáze
15
29
Expozice bakterie probíhá přímo ve vzorku pevného skupenství.
Její metabolický stav je hodnocen pomocí měření aktivity dehydrogenáz. Suspenze buněk B.
cerea spektrofotometricky ověřené koncentrace je přidána do suspenze vody a pevného
vzorku.
Po inkubaci (2h, 70 rpm, 25° C) je do suspenze přidán resazurin (oxido-redukční barvivo
indikující aktivitu bakteriální dehydrogenázy) ve fosforečnanovém pufru. Po 15 min. je směs
zcentrifugována a reakce přerušena filtrací supernatantu přes membránový filtr (velikost
pórů 0,2 mm). Zredukovaný resazurin mění barvu, je tudíž možné míru jeho přeměny
spektrofotometricky kvantifikovat.
DehydrogenDehydrogenááznzníí aktivitaaktivita
Navážka sedimentu
Fosf. pufr + živiny
Inokulum
PP
PP
inkubace (2h, 70 rpm, 25 °C)
+ resazurin
Přesně
definovaná
koncentrace
30
DehydrogenDehydrogenááznzníí aktivitaaktivita
ONa
O
O
N
O ONaO
N
O
Resazurin
max = 601,2nm
modrofialová
barva
Resorufin
max = 571,4nm
růžová barva
16
31
Test na aktivitu dehydrogenáz
Test na aktivitu dehydrogenáz
Organismus Bacillus cereus, G+, (CCM 2010).
Princip Jedná se o test, ve kterém je aplikována sbírková kultura bakterie
Bacillus cereus přímo do vzorku pevného skupenství a její poškození se
sleduje pomocí spektrofotometrického měření změn v množství
specifickoho substrátu resazurinu (601nm), jehož redukce je úměrná
změnám v aktivitě dehydrogenáz sledované buněk.
Alternativou odečtu výsledků je spektrofotometrická detekce
vznikajícího resorufinu (571nm). (Rönnpagel et al. 1995).
Reakční směs (V) 6 ml.
Předkultivace 18 hodin při kontinuálním třepání (220 rpm) při teplotě 21 o
C,
(OD601=0,4).
Trvání testu 4 hodiny.
Teplota 21 o
C.
Třepání Kontinuální třepání 70 rpm.
Aseptická práce Pouze při práci se zásobní kulturou.
Výhody Bezextrakční test matrice pevného skupenství. Tato metoda testuje
účinky i těch kontaminantů, které jsou vázané na povrch pevných
částeček půd a sedimentů.
Výhodou je jeho metodická ,,benevolentnost" k přítomnosti kyslíku a
dobrá rozpustnost resorufinu ve vodě a tím jeho jednoduchá
extrahovatelnost.
32
Toxi - ChromotestTM
The activity of the induced (by cocktail containing a specific
inducer of ß-galactosidase) enzyme is detected by the hydrolysis
of a chromogenic substrate
It is sensitive to a wide spectrum of toxic substances such as
heavy metals, and organic and inorganic pollutants, and may be
used to detect the presence of toxicants in water and
soil/sediment extracts
If the sample is not toxic, a distinctive blue (or yellow) colour
quickly develops
17
33
Toxi - ChromotestTM
Přehled v praxi nejčastěji používaných substrátů pro
stanovení beta-galaktozidázy:
- ONPG BEZBARVÁ - ŽLUTÁ
-CPRG NAŽLOUTLÁ - ČERVENÁ
Chlorophenol red-beta-D-galactopyranoside,
monosodium salt
-X-GAL ŽLUTÁ - MODRÁ
-5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactopyranoside,
crystals
34
Toxi - ChromotestTM
Toxi-Chromotest, Toxi-ChromoPad
Organismus Escherichia coli , gramnegativní (G-), K12 OR85.
Princip Princip obou testů je založen na schopnosti toxikantů inhibovat de novo
syntézu -galaktozidázy v kmeni Escherichia coli, mutantu citlivému
především k pesticidům, mykotoxinům a těžkým kovům (Kilroy et Gray
1995). Toxi-Chromotest je mikrodestičkový test, který slouží k testování
kapalných vzorků a roztoků chemických látek. Při ToxiChromoPad
variantě test probíhá ve zkumavkách. Vzorky se pak aplikují na filtrační
papíry se substrátovou impregnací (test pro sedimenty, půdy).
Lyofilizované bakterie jsou oživeny směsí živného média a specifického
induktoru pro fenotypovou produkci enzymu. Jsou následně smíchány s
testovaným vzorkem, který může inhibovat obnovovací proces a syntézu
-galaktozidázy. Směs je u Toxi-Chromotestu nanášena do
serologických destiček a množství enzymu je stanoveno
semikvantitativně kolorimetrickou reakcí nebo může být kvantifikováno
na čtecím zařízení pro destičky (Reinhartz et al. 1987). V případě
ToxuChromoPadu jsou výsledky hodnoceny jen srovnáním vytvořené
kontrolní barvy na filtračním papíře s variantou vzorku (EBPI, 1995),
(Kwan 1993, Kwan 1995, Rao et al., 1991).
Citlivost Kwan et Dutka 1990 srovnávali tyto testy s Microtox
testem.
Především u vzorků sedimentů jsou tyto testy méně citlivé, než Microtox.
Naopak u mykotoxinů a pesticidů byl ToxiChromotest citlivější (Kilroy
et Gray 1995).
Reakční směs (V) U Toxi-ChromoPadu je reakční směs 500 l, u klasické mikrodestičkové
verze Toxi-chromotestu 250 l.
Předkultivace Dostatečná doba resuscitace 10 minut.
Aseptická práce Aseptická práce je nutná při jakékoliv manipulaci se zásobní kulturou.
Trvání testu 2 hodiny.
Teplota 37 o
C
18
35
ToxichromoToxichromo--PadPad 
Ukázka KITu na stanovení toxicity v pevné matrici Ukázka KITu na stanovení toxicity v kapalné matrici
ToxichromoToxichromo--testtest 
http://www.ebpi-kits.com/
36
Toxi - ChromoPad
Control
3,13 %
6,25 %
12,5 %
25 %
50 %
0,5g of samples
Toxi - ChromoPadTM
19
37
MetPad, MetPlate, FluoroMetPlate, MetSoil
Enzymová inhibice syntézy B-galaktozidázy
MetPad MetPlate
35oC, 90 min., rehydratace lyofilizované kultury
- specifita na těžké kovy X velmi slabá reakce na znečištění organickými polutanty
- test provádět vždy v kombinaci s jiným testem,
- FluoroMetPlate - fluorogenní substrát (nejcitlivijší z celé skupiny,
38
MetPlate
Organismus Escherichia coli (G-).
Princip těchto testů je obdobný jako u Toxi-Chromotestu. Bakteriální
odpovědí na toxický vzorek je měřená indukovaná syntéza enzymu  galaktozidázy
mutantního kmene E. coli (Bitton et al. 1992, Kong et al.
1995). Intenzita syntézy enzymu je závislá na metabolismu buněk.
Reakční směs (V) 1 ml (100 l inokula + 900 l vzorku)
Trvání testu 1 hodinu.
Teplota 35 o
C.
MetPlate
20
39
Testy vzorků pevné fáze
TREND:
40
Testy vzorků pevné fáze
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Koncentrace vzorku (mg.ml
-1
)
Inhibice(%)
Vodný výluh
Solid-phase test
Organický extrakt
21
41
Testy vzorků pevné fáze ­ DOPORUČENÍ DO BUDOUCNA
42
Hodnocení bakteriálních testů
Výhody
nízká finanční a časová
náročnost
citlivost
uchovávání a příprava
testovacích organismů
miniaturizované provedení
instrumentální metody
Nevýhody
jednobuněčný organismus
testování extraktů
vliv zákalu vzorků
pouze akutní účinky
laboratorní podmínky
omezená extrapolace
výsledků
22
43
Trendy ve vývoji bakteriálních testů
standardizace metod
miniaturizace provedení
moderní instrumentální analytické metody
SPT testy (testování účinků biodostupné frakce)
biosensory
44
Aspekt trofické úrovně
testovaného organismu
Dle cíle hodnocení
a dle typu vzorku
Minimální výběr:
- bakterie
- řasy
- bezobratlí
Zařazení do baterie testů