1
Přednášející: Pavel Čupr
Ekotoxikologické biotestyEkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty
TESTY GENOTOXICITY A MUTAGENITYTESTY GENOTOXICITY A MUTAGENITY
ČČáástst
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
GENOTOXICITAGENOTOXICITA
toxicita pro genom
genotoxické faktory jsou schopny interagovat s DNA za vzniku
reverzibilních i ireverzibilních změn
poškození genomu může následně vést k mutagenezi,
karcinogenezi, indukci fágů, buněčné smrti, chromozomálním
aberacím a dalším neméně závažným důsledkům
2
Společenstvo
Ekosystém
Individuum
Nespecifická
toxicita
Subletální účinekLetální účinek
Specifická
toxicita
Genotoxicita
Karcinogenita
-nepolární narkóza
-polární narkóza
-blokování respiračního řetězce
(respiratory blocator)
-inhibitor AchE
-membránové iritanty
-poškození CNS
Reprodukční
toxicita
Teratogenita
Neurotoxicita
Endokrinní
toxicita
Populace
Parametry
populace
Strukturní a
funkční diverzita
Homeostáze a
homeorhéza
Vitalita/mortalita Růst/inhibice
ÚČINEK
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
MUTACEMUTACE
za mutaci je považována jakákoliv změna v genetické informaci
buněk, která není výsledkem rekombinace či segregace při dělení
buněk, a je přenášena do dalších generací buněk či jedinců.
proces vzniku mutací je označován jako mutageneze.
mutace lze kategorizovat dle různých aspektů (viz dále).
3
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
MUTAGENEZE
několikafázový proces.
genotoxická látka s mutagenními účinky po vstupu do organismu
a na základě své toxikokinetiky proniká v původní či změněné
podobě do buňky (fáze 1).
následně dochází k interakci s DNA v genomu, jejichž podstatou
je kovalentní vazba na molekulu DNA, interkalace mezi řetězce
dvojšroubovice, interakce s mitotickými strukturami (fáze 2).
mutace, tedy změna v genotypu, která není letální, může v určitém
časovém horizontu vést k transkripci a realizaci změněné
informace, která se následně promítá v podobě mutantního
fenotypu (fáze 3).
procesu mutageneze nemusí být dokončen v případě, že daný
genotoxický zásah je pro danou buňky letální či mutace byla včas
opravena.
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
GENOTOXICKGENOTOXICKÉÉ FAKTORYFAKTORY
Fyzikální faktory
Chemické faktory
Přírodní
faktory
Antropogenní
faktory
4
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
AKTIVACE PROGENOTOXINAKTIVACE PROGENOTOXINŮŮ I.I.
ppřříímméé mutagenymutageny ­­ skupina lskupina láátek, jetek, ježž vykazuje svvykazuje svéé genotoxickgenotoxickéé úúččinkyinky
ve stve stáávajvajííccíím stavu dm stavu dííky pky přříítomnosti silntomnosti silněě elektrofilnelektrofilníí skupiny.skupiny.
nepnepřříímméé mutagenymutageny ­­ lláátky, jetky, ježž za normza normáálnlníích podmch podmíínek nevykazujnek nevykazujíí
genotoxickgenotoxickéé úúččinky, ale v pinky, ale v přříípadpaděě enzymatickenzymatickéé ppřřememěěny zny zíískskáávajvajíí
vhodnou molekulvhodnou molekuláárnrníí strukturu, kterstrukturu, kteráá umoumožňžňujeuje úúččinnou interakci sinnou interakci s
DNA.DNA.
progenotoxická
látka
E aktivovaný
genotoxin
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
AKTIVACE PROGENOTOXINAKTIVACE PROGENOTOXINŮŮ
Nejčastějí využívaným provedením metabolické aktivace je příprava
mikrosomální frakce (S9 frakce):
jaterní mikrosomální frakce z potkanů či myší
mikrosomální frakce z plic, ledvin či mozku potkanů a myší
jaterní mikrosomální frakce lidských jater
jaterní mikrosomální frakce z ryb
rostlinná mikrosomální frakce
5
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
PPŘŘEHLED NEJPOUEHLED NEJPOUŽŽÍÍVANVANĚĚJJŠÍŠÍCH TESTCH TESTŮŮ
GENOTOXICITY A MUTAGENITYGENOTOXICITY A MUTAGENITY
VYHODNOCOVVYHODNOCOVÁÁNNÍÍ, INTERPRETACE A, INTERPRETACE A
EXTRAPOLACE VÝSLEDKEXTRAPOLACE VÝSLEDKŮŮ TESTTESTŮŮ
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
DETEKDETEKČČNNÍÍ SYSTSYSTÉÉMY GENOTOXICKÝCHMY GENOTOXICKÝCH ÚÚČČINKINKŮŮ
Bakterie
Živočichové
Rostliny
Houby
Detekční
systémy
* Interpretace
* Extrapolace
* Jednoduchost
* Rychlost
* Náklady
6
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
PRINCIP BAKTERIPRINCIP BAKTERIÁÁLNLNÍÍCH TESTCH TESTŮŮ GENOTOXICITYGENOTOXICITY
Tři principiálně odlišné modely pro detekci genotoxických faktorů:
model 1: DNA léze vede ke změně smyslu informace
V důsledku indukce reverzní mutace dochází k obnovení určité
vlastnosti buněk testovacího kmene, která je následně sledována.
model 2: DNA léze indukuje SOS odpověď zahrnující SOS
mutagenezi
V důsledku indukce poškození DNA je spuštěn systém SOS
odpovědi, která je determinována skupinou SOS genů, jejichž
aktivace je následně sledována na základě přepisu vhodného
reportérového genu (specifický fúzní gen SOS gen::reportérový gen).
model 3: DNA léze vede ke smrti buňky
Důsledkem poškození DNA u kmenů buněk, které nejsou schopné
opravovat vzniklá poškození, je buněčná smrt.
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
PPŘŘEHLED BAKTERIEHLED BAKTERIÁÁLNLNÍÍCH TESTCH TESTŮŮ GENOTOXICITYGENOTOXICITY
model 1:
model 2:
* Amesův test ­ vznik histidin-prototrofních CFU (Ames et al., 1975)
* Ara-test ­ vznik L-arabinóza-rezistentních CFU (Englesberg et al., 1962)
* Ampicilínový test ­ vznik ampicilín-rezistentních CFU (Lee et al., 1994)
* Reverzní test na E. coli ­ vznik tryptofan-rezistentních CFU (Bridges, 1972)
* Mutatox ­ obnovení bioluminiscence buněk (Johnson, 1992)
* GFP test ­ obnovená schopnost produkce GFP (Cariello et al., 1998)
* SOS chromotest ­ indukce přepisu sulA::lac-Z (Quillardet et al., 1982)
* UmuC test ­ indukce přepise umuC::lac-Z (Oda et al., 1985)
* SulA test ­ indukce přepisu sulA::lac-Z (El Mzibri, 1996)
* RecA test ­ indukce přepisu recA::luxCDABE (Min et al., 1999)
* Vitotox ­ indukce přepisu recN::luxCDABE (Van der Lelie et al., 1997)
* Lux-fluoro test ­ indukce přepisu recA::luxCDABE (Baumstark-Khan et al.,
2001)
model 3: ˇ Reparační test ­ pokles počtu CFU v důsledku poškození DNA (Green, 1977)
7
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
AMESAMESŮŮV TEST I.V TEST I.
Specifikace
jednoduchý screeningový nástroj, který je nejčastěji používán a
jako jediný všeobecně doporučován národními normami
Princip
test je založen na indukci reverzních mutacích v histidinovém
lokusu v buňkách geneticky modifikovaného kmene Salmonella
typhimurium
reverzní mutace je spojena s přeměnou histidin-auxotrofních
buněk (His-) na histidin-prototrofní (His+)
histidin-prototrofní buňky jsou následně schopné růst v médiu bez
přítomnosti aminokyseliny histidinu
obnova růstu a metabolické aktivity je signálem genotoxických
účinků testovaného vzorku
Amesův test
Bruce Ames (nar. 1928)
8
Amesův test
* Umožňuje studium reverzních mutací u histidin ­ deficientních kmenů
bakterie Salmonella typhimurium. Tyto auxotrofní mutanty přežívají pouze
na médiu obsahujícím histidin.
* Působením mutagenu dojde u některých buněk k reverzní mutaci, která
způsobí ,,opravu" genu pro syntézu histidinu. Bakterie s touto mutací tak
znovu získají schopnost tvorby histidinu a přežívají i na médiu, které
histidin neobsahuje.
Bakterie
HisNa
normálním
médiu umírá
Médium
s histidinem
Normální
médium
Bakterie
His+Reverzní mutace
Mutagen
Amesův test
Testovanálátka
Prokázanýmutagen
0
Negativní
kontrola
Pozitivní
kontrola
Miska s
testovanou
látkou
GENOTOXICITA
PROKÁZÁNA
Proč lze i na negativní
kontrole (tj. na misce bez
jakéhokoliv mutagenu)
pozorovat nárůst
bakterií?
SPONTÁNNÍ
REVERTANTI
Interpretujte výsledek
testu? Lze tímto
výsledkem potvrdit
genotoxicitu látky?
Vysvětlete, jaký význam
má pozitivní kontrola (tj.
aplikace známého
mutagenu).
SLOUŽÍ KE KONTROLE
PRŮBĚHU TESTU A PRO
SROVNÁNÍ
?
?
?
9
Výsledek Amesova testu
Amesův test ­ automatické
odečtení výsledků
10
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ Testy genotoxicity a mutagenityTesty genotoxicity a mutagenity ­ přednáška
AMESAMESŮŮV TESTV TEST
Fluktuační verze Amesova testu ­ MutachromoplateTM (EPBI)
Vyhodnocení: počet pozitivních jamek (žluté) X negativní kontrola.
(statistické vyhodnocení ­ Poissonova distribuce).
Případně počítáme mutagenní aktivitu (M.A.).
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ Testy genotoxicity a mutagenityTesty genotoxicity a mutagenity ­ přednáška
MUTATOX I.MUTATOX I.
Specifikace
krátkodobý, velmi citlivý screeningový test založený opět na
indukce reverzních mutacích (model 1.)
Princip
test je opět založen na indukci reverzních mutací v důsledku
iniciace substitucí, translokace, inhibice syntézy DNA nebo
tvorby DNA aduktů genotoxickými látkami v luxCDABE
operonu geneticky modifikované bakterie Photobacterium
phosphoreum (Vibrio fischeri) M 169, která není schopná
luminovat (dark cells)
test probíhá v tekutém médiu !! v kyvetách, či mikrodestičkách
v důsledku reverzní mutace je obnovena schopnost luminiscence
buněk a na základě její kvantifikace je odhadován genotoxický
potenciál testovaného vzorku
11
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ Testy genotoxicity a mutagenityTesty genotoxicity a mutagenity ­ přednáška
recA lexA >20 cílových genů
DNA
reparace a
jiné
SOS funkce
ON
aktivovaný
RecA
signál
+++
C.
OFF
recA lexA >20 cílových
genů
slabá
exprese
A.
pokles úrovně
aktivovaného RecA
reparovaná DNA
D.
pokles úrovně
signálu
akumulace
LexA represoru
DNA
poškození
indukující
signál
aktivace RecA
proteinu
rozštěpení
LecA represoru
B.
Model SOS regulačního systému
testy modelu 2.
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ Testy genotoxicity a mutagenityTesty genotoxicity a mutagenity ­ přednáška
SOS CHROMOTEST I.SOS CHROMOTEST I.
Specifikace
jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením založený na stejném principu jako umuC test
Princip
podstatou SOS chromotestu je indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození DNA genotoxickou látkou
ze skupiny SOS genů (din genů) je tentokrát využíváno propojení
sulA genu s reportérovým lac-Z genem
cílenou genovou manipulací byl do kmene Escherichia coli PQ
37 vložen specifický fúzní gen sulA::lac-Z
jako kontrola toxicity vzorku je kontinuálně bakterií syntetizována alkalická
fosfatáza, jejíž pokles aktivity signalizuje inhibici buněk
12
Genotoxicity - mutagenicity test (SOS repairs)
MUTAGENIC compounds
Spectrofotometric
-galactozidases
A
reporter gene systems
OFF
recA lexA >20 target
genes
low level
expression
reporter
gene
tol-C gen
MUT
DNA
damage
inducing
signal
RecA protein
activation
LexArepressor
cleaved
B
DNA repair
and other
SOS function
recA lexA
ON
activated
RecA
signalC
>20 target
genes
reporter
gene
SIGNAL
drop in level of
activatedRecA
DNA repaired
D
drop in level of
signal
LexA repressor
accumulates
o-nitrophenyle
 - D galactopyranoside
Lex A repressor
Schéma spřažení SOS
reparačního mechanizmu
s reporterovým
genem
- funkce fůzního genu
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
UMUC TEST I.UMUC TEST I.
Specifikace
Jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením a širokou specifitou k různým skupinám
genotoxických faktorů, který je založený na indukci SOS
odpovědi (model 2)
Princip
podstatou umuC testu je indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození DNA genotoxickou látkou
ve skupině SOS genů (din genů) jsou obsaženy i geny umuC a
umuD, jejichž přepis je zahrnut v komplexním procesu SOS
odpovědi
cílenou genovou manipulací byl do kmene Salmonella
typhimurium TA 1535 vložen plazmid pSK1002 nesoucí
specifický fúzní gen umuC::lac-Z
13
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
test bez metabolické aktivace: IF = 1,5
test s metabolickou aktivací: IF = 2,0
UMUC TESTUMUC TEST
podmínkou pro správnost odhadu IF je skutečnost, že při testování
dané látky (v určité koncentraci) nesmí být dosaženo více než 50
% inhibice růstu (G nesmí být menší než 0,5)
Testovací biologický systém
Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
UMUC TEST IX.UMUC TEST IX.
MODIFIKACE KLASICKÉHO UMUC TESTU
A) Nové kmeny Salmonella typhimurium
NM1011 - zvýšená produkce nitrátreduktázy
NM 2009 - zvýšená produkce O, N-acetyltransferáz
NM 3009 - zvýšená produkce nitrátreduktázy a O, N-
acetyltransferáz
OY1001/1A2 - produkce CYP 1A2 a NADPH-P450 reduktázy
NM5004 - produkce krysího glutathionu-S-transferázy
NM6001 a NM6002 - produkce lidských NAT1 a NAT2
TA1535/pSK-luc - reportérovým genem je zde gen pro luciferázu
14
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
UMUC TEST X.UMUC TEST X.
Velikost IF v závislosti na koncentraci 4-NQO
0
10
20
30
40
50
60
0,002 0,005 0,010 0,020 0,039 0,078 0,156 0,313 0,625 1,250 2,500 5,000
koncentrace 4-NQO [mikrogr./ml]
IF
Velikost IF v závislosti na koncentraci 2-AA
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0,002 0,005 0,010 0,020 0,039 0,078 0,156 0,313 0,625 1,250 2,500 5,000
koncentrace 2-AA [mikrogr./ml]
IF
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
VITOTOX I.VITOTOX I.
Specifikace
Jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením založený na stejném principu jako umuC test
Princip
podstatou Vitotoxu je opět indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození genomu testovacího kmene Salmonella typhimurium
tentokrát je využíván geneticky manipulovaný kmen Salmonella
typhimurium, jež obsahuje lux operon luxCDABE izolovaný z
Vibrio fisheri a opatřený recN promotorem podléhající regulaci
ze strany lexA proteinu (tedy fůzní gen recN:luxCDABE)
reportérový operon je uložen v plazmidu pMOL1067 nebo pMOL1068
15
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
recArecA TESTTEST
Specifikace
Jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením založený na stejném principu jako umuC test
Princip
podstatou RecA je opět indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození genomu testovacího kmene Escherichia coli DPD2794
tentokrát je využíván geneticky manipulovaný kmen Escherichia
coli, jež obsahuje fúzní gen recA::luxCDABE
Fúzní gen je tvořen bezpromotorovým operonem lux operon
luxCDBAE izolovaným z Vibrio fisheri, který byl opatřen
promotorem recA genu podléhajícímu regulaci ze strany lexA
proteinu
reportérový operon je uložen v plazmidu
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
TESTY GENOTOXICITY NATESTY GENOTOXICITY NA
KVASINKKVASINKÁÁCHCH
16
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
RAD54 - GFP
Geneticky modifikovaný kmen
Saccharomyces cerevisiae
Kopie promotoru pro reparační
gen umístěn před gen pro GFP
protein vykazující fluorescenci
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
RAD54 - GFP
Princip testu:
RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii
Po poškození DNA dojde ke
spuštění reparačního
procesu a tím i k produkci
tohoto GFPproteinu, který je
detekován měřením
fluorescence
Paralelně sledování
cytotoxicity měřením
absorbance (A600)
17
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii
Úprava na O.D590 = 1.0Optimalizovaný postupOptimalizovaný postup
100 ul inok (O.D. 1.0)
890 ul Yeast media (YG ­ viz obr)
10 ul VZORKU (či DMSO)
Rozpipetování obsahu Eppendorf zkumavky po 200 ul do 3 jamek (opakování)
Design založení testu v mikrodestičce (černá, s
čirým dnem pro fluorimetrii)
Design zaloDesign založženeníí testu vtestu v mikrodestimikrodestiččcece ((ččernernáá, s, s
ččirým dnem proirým dnem pro fluorimetriifluorimetrii))
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii
Design založení testu v mikrodestičce (černá, s
čirým dnem pro fluorimetrii)
Design zaloDesign založženeníí testu vtestu v mikrodestimikrodestiččcece ((ččernernáá, s, s
ččirým dnem proirým dnem pro fluorimetriifluorimetrii))
18
RECETOXRECETOX ­­ EkotoxikologickEkotoxikologickéé biotestybiotesty ­­ TestyTesty genotoxicitygenotoxicity a mutagenitya mutagenity ­ přednáška
RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii
Aplikovaný experimentální designAplikovaný experimentální design
BLBLBLBLBLBLNKNKNKNKNKNKH
PK-2PK-2PK-2PK-2PK-2PK-2PK-1PK-1PK-1PK-1PK-1PK-1G
Vz6
1:4
Vz6
1:4
Vz6
1:4
Vz6
1:2
Vz6
1:2
Vz6
1:2
Vz6
1:1
Vz6
1:1
Vz6
1:1
Vz6
1:0
Vz6
1:0
Vz6
1:0F
Vz5
1:4
Vz5
1:4
Vz5
1:4
Vz5
1:2
Vz5
1:2
Vz5
1:2
Vz5
1:1
Vz5
1:1
Vz5
1:1
Vz5
1:0
Vz5
1:0
Vz5
1:0
E
Vz4
1:4
Vz4
1:4
Vz4
1:4
Vz4
1:2
Vz4
1:2
Vz4
1:2
Vz4
1:1
Vz4
1:1
Vz4
1:1
Vz4
1:0
Vz4
1:0
Vz4
1:0
D
Vz3
1:4
Vz3
1:4
Vz3
1:4
Vz3
1:2
Vz3
1:2
Vz3
1:2
Vz3
1:1
Vz3
1:1
Vz3
1:1
Vz3
1:0
Vz3
1:0
Vz3
1:0C
Vz2
1:4
Vz2
1:4
Vz2
1:4
Vz2
1:2
Vz2
1:2
Vz2
1:2
Vz2
1:1
Vz2
1:1
Vz2
1:1
Vz2
1:0
Vz2
1:0
Vz2
1:0
B
Vz1
1:4
Vz1
1:4
Vz1
1:4
Vz1
1:2
Vz1
1:2
Vz1
1:2
Vz1
1:1
Vz1
1:1
Vz1
1:1
Vz1
1:0
Vz1
1:0
Vz1
1:0
A
121110987654321