bioanalytika II analytické metody v klinické praxi Jan Havliš, Ph.D. MU PřF doporučená literatura Analytické metody v klinické chemii V. Chromý, J. Fišer, MU PřF, Brno, 2000 Bioanalytika - Analytická chemie v laboratorní medicíně V. Chromý, J. Fišer, MU PřF, Brno, 2002 @^®® Creative Commons: Uveďte autora-Neužívejte dílo komerčně-Zachovejte licenci 3.0 Česko License sylabus přednášky základní metody a principy : barevnost a její analytické využití, indikátorové reakce : stanovení proteinů a enzymatická analýza : imunoanalýza : analýza nukleových kyselin : lékařská mikrobiologie stanovení vybraných analytů : případová studie: stanovení ALP : albumin, barbiturany, draslík, etanol... laboratorní medicína : vzorky - charakter, zpracování : instrumentace, integrace a miniaturizace : kontrola a řízení jakosti : výběr analytické metody : optimalizace postupu : analytická souprava : vyjadřování analytického výsledku 2 laboratorní medicína analýza složek tělních tekutin s diagnostickým významem stanovování analytů a metabolitů nebo jejich skupin, včetně monitorování hladiny některých léků zastřešuje obory zabývající se laboratorní diagnostikou: klin. chemie, klin. biochemie, hematologie, lék. mikrobiologie, imunologie... u nás tradovány jako samostatné klinické disciplíny výzkum diagnostika * »terapie definice IFCC {international federation of clinical chemistry) „Klinická chemie je aplikací chemických, molekulárních a buněčných principů a technologií s účelem porozumět lidskému zdraví a nemoci a umožnit jeho hodnocení. Jádrem oboru je poskytování výsledků měření a pozorování se vztahem k příčině nemoci a udržení zdraví. Na rozhraní laboratoře a kliniky následuje přeměna těchto dat na specifické a obecné informace se vztahem k pacientovi a nemoci. Úkolem oboru je prohlubování znalostí o zdraví a nemoci prostřednictvím základního a aplikovaného výzkumu." laboratorní medicína : v EU 5 - 10 analýz na hlavu za rok : největší světový producent (bio)analytických dat : a zasahuje do většiny analytických oborů laboratoře : nemocniční : soukromé : tzv. konsolidované (spojené) laboratoře : diagnostická centra obrovský rozsah analytické činnosti : nesrovnatelný s jinými vědními nebo průmyslovými obory 5 17 vzorek I v laboratorní medicíně biologický : invazivní (krev, mozkomíšní mok, tkáně, šťáva žaludeční a duodenální) : neinvazivní (sliny, moč, stolice, sputum, dech) krev = suspenze b. částic v kapalině (plazma) buněčné částice: krvinky (erytrocyty a leukocyty) : krevní destičky (trombocyty) srážení krve (opuštění kr. řečiště) - přeměna rozp. fibrinogenu na nerozp. fibrin krev srážení> tuhý krevní koláč + krevní sérum krevní sérum - podobné složení jako plazma, bez srážlivých látek plazma a sérum směs anorganických a organických látek ve vodě nativní plazma - oddělením od krvinek z krve v nádobce s nepolárním povrchem (plast) bez protisrážlivého prostředku : nejvíce blizi tomu, co je přítomno v cirkulující krvi plazma - z krve v nádobce s protisrážlivými prostředky sérum - oddělením od sraženiny z krve v nádobce s polárním povrchem a bez antikoagulancií : příprava plazmy je rychlejší : získá se asi o 20 % více plazmy než séra : plazma snižuje riziko nežádoucí hemolýzy (v séru až lOx vyšší) : v séru po odstředění nežádoucí dodatečná koagulace : sérum je svým způsobem artefakt : v plazmě nelze provádět elfu bílkovin => fibrinogen překrývá řadu yglobulinů : protisrážlivé prostředky vnášejí do plazmy ionty, které pak nelze stanovovat : řadu analytů maskují a inhibují i některé enzymy plazmy 7 moč ________________ světle žlutá tekutina produkovaná ledvinami a vylučovaná z organizmu prostřednictvím močovodů, močového měchýře a močové trubice obsahuje: močovinu, chloridy, ionty sodíku, draslíku, fosforečnany, sírany, kreatinin a kyselinu močovou mozkomíšní mok (likvor, cerebrospinální tekutina) čirá, řídká tekutina, která cirkuluje mezi mozkovými komorami, centrálním kanálem v páteři a prostupem mezi mozkem a míchou a jejich ochrannými membránami (meningami) obsahuje: elektrolyty a podobné organické látky (podobné jako krevní plazma, ale jiné koncentrace) např. glukózu, bílkoviny, laktát, pyruvát, cholesterol, enzymy, soli a určité typy lymfocytů a)dané vlivy b) proměnné vlivy dané rasa a pohlaví např. různé referenční hodnoty analytů: kreatinkinázy, a-amylázy a granulocytů v O v v : vyssi u múzu nez u zen :: ženy mají většinou nižšia užší referenční intervaly u celé řady analytů : narůstají vzestupně od bělochů přes žlutou rasu k černochům věk např. různé referenční hodnoty analytů u novorozenců, dětí, dospívajících, dospělých a starých lidí 9 biorytmy - chronobiologické vlivy lineární: mění se průběžně s věkem cyklické : denní (cirkadiánní) : měsíční (lunární) : roční období (sezónní) biorytmy způsobují změny koncentrací ana/ytů cyklické biorytmy - kolísají koncentrace ze dne na den i v průběhu dne významná změna biorytmů v těhotenství vlivy proměnné : stravy, hladovění (=> malnutrice; podvýživa) A koncentrací tuků, cukrů, bílkovin => A hladiny sérového amoniaku a močoviny 10 tělesná námaha krátkodobá a intenzivní námaha : spotřeba ATP, i hladiny glukózy a laktátu dlouhodobá námaha : t koncentrace iontů sodíku, draslíku, vápníku, fosforu, ALP, albumin, močovina, bilirubin, AST, pyruvátkináza, CK míra změny je individuální a závisí na okolnostech vliv nadmořské vvškv {zátěžorganizmu) : t koncentrace C-reaktivní proteinu, ß2-globulinu, kyseliny močové, hemoglobinu a hematokritu adaptace na vysoké nadmořské výšky je pomalá a trvá týdny adaptace po přechodu zpět je jen několikadenní 11 běžné drogy kofein : t koncentrace glukózy, neesterifikovaných mastných kyselin a katecholaminů nikotin (cigareta) : akutní i chronické změny např. t koncentrace sérových mastných kyselin, glukóza, fibrinogenu, cholesterolu, volného glycerolu, aldosteronu a kortisolu, některých hormonů a tumorové markery a těžké kovy (Cd, Cu, Pb) alkohol : ovlivňuje intenzita a délce konzumace okamžité vlivy: i koncentrace sérové glukózy, metabolická acidóza (etanol=>acetaldehyd=>acetát) dlouhodobé vlivy: t aktivity enzymů GMT, GLD, AST a ALT (intoxikační vliv na játra) chronický alkoholizmus: t koncentrace triacylglycerolu, cholesterolu a některých hormonů 12 jiné bezne vlivy biologické tekutiny - komplex anorganických a organických molekul, navíc jsou tvořeny nepravými roztoky bílkovin a emulzí tukových kapének látky mohou být vázány na bílkoviny => jejich obsah se v živém organizmu dynamicky mění; změny souvisí s jejich individuální stabilitou nebo rozkladnými procesy (metabolizmus a bakterie) biologické vzorky - potenciálně infekční materiál => bezpečnostní předpisy počet analytů ve vzorku - stovky + jejich deriváty s proměnným obsahem a proměnnou foto- a termostabilitou = biologická matrice vliv odběru a následného transportu - tzv. preanalytická fáze nutnost rychlého transportu a uchovávání v chladu nebo konzervace 13 vlivy medikace vzorky nemocných - lékové interference zkreslují výsledek nebo úplně znemožňují provedení analýz údaje o interferencích - zjišťovány empiricky : vlivy jednotlivých léků (běžné) : vlivy lékových kombinací (vesměs neznámé) : odběr krve nalačno, ale i po vysazení léků na dobu 24 - 72 h : většinou jen znalost léků pacienta analytická interference léčiv - je sledována IFCC, zjištěné analytické interference v databance standardní (normovaný) operační postup (SOP) - analýza směsného séra dárců nebo nemocných obohaceného známým množstvím příslušného léčiva : výsledek analýzy je statisticky hodnocen 14 preanalytická fáze odběr, transport a uchovávání vzorků postupy a operace se vzorkem analyzovaného materiálu do zahájení analýzy odběr a transport biologického materiálu analyty mají omezenou časovou stálost : jsou meta bol izovány, jsou termolabilní nebo fotolabilní stabilita - doba skladování, kdy se za přesně definovaných podmínek nemění počáteční obsah analytu ve vzorku; jeho koncentrace nebo aktivita vyjadřuje se jako čas, během něhož se počáteční obsah analytu s 95% pravděpodobností nezmění o více než 1.5-násobek referenčního intervalu 15 ,. . t zásady odběru vlivy stavu pacienta tělesná poloha - u vysokomolekulárních látek jsou nižší při odběru vleže a zvyšují se až o 15 % při odběru vstoje fyzická námaha - A koncentrace látek podílejících se na energetickém metabolizmu, dochází k zahušťování makromolekulárních látek, zvyšuje se aktivita enzymů AST a CK, kreatininu, snižuje se hladina thyroxinu odebírá se vsedě3 alespoň po 30 min klidu stažení paže elastickým obinadlem a po dezinfekcimísta vpichu obi nad lo se rychle uvolní- odbírá se volně proudící krev před vpichem se /7es/77/pacient staženou paží dlouho cvičit rychlé neuvolnení obinadla a příliš intenzivní cvičení paží => významně ovlivnění hladiny některých sérových analytů: í koncentrace Na+ a Ca2+, hemoglobinu, cholesterolu, ALP, bílkovin, bilirubinu a některých enzymy; i se koncentrace glukózy, kreatininu, fosforečnanu... venózní (žilní) krev odběr ráno nalačno poslední lehkou potravu kolem 18:00, a druhý den ráno v malém množství jen vodu nebo n es lazený čaj vysazení léků na dobu alespoň 24 - 72 hodin : většina analýz (kromě hematologických) je prováděna ze séra : po odběru srážlivé krve a před oddělením séra od krevní sraženiny odstředěním je nezbytné vyčkat nejméně 30 minut, což je doba nezbytně nutná pro koagulační proces : s prostředky zrychlující proces krevní koagulace, stačí obvykle jen 10 minut kapilární krev vpichem lancetou do prstu, do ušního lalučku nebo patičky (děti) : šetrné : skápnutí nebo odsátí (mikropipetou nebo kapilárou) 1-3 kapek krve : okamžitá analýza (stanovení glukózy na diagnostickém proužku) : transport v plastové mikrozkumavce s protisrážlivým a anti-glykolytickým prostředkem 17 protisrážlivé prostředky fantikoaqulancia) látky schopné komplexovat ve vzorku ionty endogenního vápníku a tak zabránit procesu srážení krve - koagulaci : sodné nebo draselné soli kyseliny citrónové, šťavelové nebo EDTA : heparin, akcelerátor antithrombin III (inhibitor krevní koagulace) : hirudin (antikoagulans pijavek lékařských) v hematologických analýzách a testech je nutné naopak nesrážlivou krev rekalcifikovat a tím obnovit srážlivost krve přidáním přebytku vápenaté soli k vysycení antikoagulancia 18 odběrové nádobky otevřený systém - otevřená zkumavka uzavřený systém - evakuovaná nádobka či zkumavka s pryžovou zátkou, nebo speciální injekční stříkačka sloužících k odběru a současně i jako centrifugační zkumavka obsahují - antikoagulancia nebo látky urychlující srážení krve (želatina, aprotinin, polystyrénové kuličky apod) stanovení glukózy - speciální nádobky s prostředky potlačujícími glykolýzu v kombinaci s antikoagulačními prostředky protisrážlivé prostředky jsou většinou soli a vnášejí vždy do biologického vzorku některé ionty, nelze tyto ionty v takto ošetřeném biologickém materiálu stanovovat 19 bezpečnostní uzávěr HEMOGARD sterilní evakuovaná zkumavka VACUTAINER© - jehla pro „ . , ." , předdefinované vícenásobný odběr bezpecnostn. vent.l vakuum speciální separační gel - oddělí po centrifugaci sérum nebo plazmu od krevní srazeniny nebo krvinek; není nutné rychlé oddělení séra/plazmy od zbytku krve nádobky na odběr krve jsou barevně odlišeny pro snadnější manipulaci; zakotveno v příslušné normě ISO červená - čistá; zlatá - gel pro centrifugaci šedá - glukózové (NaF, K2(ox)), zelená - heparin fialová - EDTA, modrá - citrát... 20 jednorázové p. {disposables) - třída pomůcek, mezi než patří i uzavřené nádobky a další plastové jednorázové pomůcky pro odběr, transport, odstředění, dávkování a uchovávání dalších tělních tekutin ve sterilním provedení dále jsou to: nástavce automatických pipet, nádobky a zkumavky na moč, plastové destičky ELISA, na určení krevních skupin atp. hemolvza rozpad erytrocytu => mění kvalitu odebrané krve : zpracování odebrané krve na sérum či plazmu optimálně do 30 minut, nejpozději ale do 1 hodiny po odběru projev - t koncentrace draslíku a chloridů, t aktivita enzymu ALT, i glukóza vzhled - normální sérum i plazma - nažloutlé a průhledné : hemolýza => červené (uvolnění hemoglobinu) : mléčný zákal- emulgované tukové kapénky - chvlózní f lipemicke) sérum hemolyticke a chylózní sérum nebo plazma jsou pro většinu analýz nevhodné 21 qlvkolvza obsah glukózy v krvi rapidně klesá po odběru - krvinky stále žijí sérum/plazmu je nutné uchovávat při teplotě kolem +4 °C účinné, ale komplikuje transport teplota 15 - 25 °C => obsah glukózy za den na ~30 %, za 2 dny jen 6 % teplota +4 °C => obsah glukózy za den na ~80 %, za 2 dny 32 % biochemická povaha glykolýzy - katabolizmusglukózy : aerobní glykolýzu - konečným produktem C02 a voda : anaerobní glykolýzu - konečným produktem laktát : pentózový cyklus - přímá oxidace glukózy; hexóza => pentóza 22 potlačení glykolýzy : potlačení funkce významných enzymů daných katabolických drah glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza - dehydrogenace glyceraldehyd-3-fosfátu na l,3-bis(fosfo)glycerát : inhibována kyselinou monojódoctovou {cca0.5 mg/ml vzorku krve) enoláza - převod 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát metaloprotein - Mg2+ v aktivním centru : inhibována fluoridy v kombinaci s endogenními fosforečnany {cca 2 mg/ml KF nebo NaF; krev lze uchovávat až 24 hodin při pokojové teplotě) hexokináza - fosforylace glukózy : inhibována mannozou v přebytku {koxwpeWWvxú substrát, 15 mmol mannózy, stabilita krve na 12 h při pokojové teplotě) kontraindikace: nelze použít hexokinázovou metodu pro stanovení glukózy : inhibována též fluoridy v kombinaci s protisrážlivým přípravkem (EDTA; na 1 ml krve 1.6 mg Na2EDTA a 2 mg KF) kontraindikace: EDTA, KF interferují nebo inhibují stanovení některých analytů (např. metaloproteiny) 23 moc jednorázový sběr (první ranní moč) nebo sbíraná moč{12 nebo 24 hodin) : katetrízace (cévkování) hygiena odběru - bakteriální kontaminace jednorázový sběr moči : základní analýza a vyhodnocuje se močový sediment : analýza nejpozději do 2 hodin po odběru sbíraná moč : stanovení některých iontů, močoviny, glukózy, mikroalbuminurie, kreatininu a kreatininové clearance : stanovení některých hormonů (17-ketosteroidů, 5-hydroxyindoloctové kys. a kys. vanilmandlové) - konzervace zředěnou HCl : kvantitativní analýza 24 h moč (dU) - vztažení obsahu analytu na jeho denní vylučování močí; objemová eliminace konzervační prostředky : 5 ml 10 % thymolu ve 2-propanolu/l moči - pro většinu analýz : azid sodný, 10 mmol/l moči - glukóza, močovina, kys. močová, Na, Ca, oxaláty, citráty : 25 ml roztoku HCl 6 mol/l na dU - kys. 5-hydroxyindoloctová, Ca, Mg, P, katecholaminy : uhličitan sodný, 2q/l moči - porfyriny, urobilinogen : kyselina benzoová, 10 mg na dU - glukóza : úprava pH moči nad 8 - kyselina močová mozkomíšní mok lumbálnípunkce stanovení bílkovin, glukózy, chloridů aj. krom neurologických vyšetření, se využívají rutinní analytické metody j duodenální šťáva | sondáží dvanáctníku analýzy trávících enzymů (trypsin), kyselin, žlučových kyselin a barviv rychle se měnící vzorek, který musí být proto speciálně odebírán do nádob vychlazených ledem a okamžitě analyzován 26 dalsi biologické vzorky stolice, sputum, hnis, sliny, pot, sperma, vytery a stery sliznic a vzorky organu a tkání sputum, pot - vesměs nejsou předmětem práce běžné laboratoře klinické chemie, obvyklé v mikrobiologii, histochemii aj\ stolice - tzv. okultní (skryté) krvácení (krev ve stolici) sliny - analýza drog (alkohol atp.) a některých steroidu 27 úprava vzorku : odstředěnícelé krve, deproteinace, mineralizace, zkoncentrování odstreďovaní oddělení sedimentu od supernatantu podmínky - relativní centrifugační sila (RCS), čas a teplota RCS - kolikrát je odstředivé zrychlení u dna centrifugační nádobky větší než gravitační zrychlení (g) intenzivní centrifugace vede k nežádoucí hemolýze krve 28 odstranění bílkovin deproteinace - nutné pro stanovení některých analytů analyt : vsupernatantu- některé ionty nebo substráty : v sedimentu - organický fosfor, celková bílkovina v silně lipemických sérech, bílkovinný dusík Kjeldahlovou metodou apod. deproteinační techniky fyzikální - centrifugace, ultracentrifugace, adsorpce a denaturace teplem casove narocne, určeno pro speciální prípady chemické - srážení protilátkami (imunoprecipitace), dehydratací nebo solemi rychlé 29 dehydratace užívaná frakcionace bílkovin nebo v některých speciálních analytických případech silně závislé na pH - bílkoviny mají jak kladné, tak i záporné náboje : v kyselém prostředí- kationty, v alkalickém prostředí- anionty : izoelektrický bod (pí) - specifické pH kde je bílkovina elektroneutrální :: v izoelektrickém bodě jsou bílkoviny labilní a snadno se srážejí dehydratace: pomocí rozpouštědel nebo vysolením kompetice proteinu se srážedlem o vodu => odejme-li se proteinu určité množství vody => protein se sráží : metanol, etanol, aceton : pracuje se v oblasti pí dehydratace bílkovin je většinou vratný proces 30 srážení solemi obvyklé srážení bílkovin ve formě nerozpustných solí srážedla: : aniontová (trichloroctan, chloristan, pikran, wolframan, molybdenan, sulfosalicylan, metafosforečnan) : kationtová (zinek, rtuť, kadmium, uran, thorium, železo, měď a olovo) mineralizace speciální prípady mineralizace suchou cestou pro stanovení C, H a N elementární analýzou nebo stanovení kovů v biologické/organické matrici atomovou absorpční spektrofotometrií 31 mineralizace mokrou cestou pro stanovení organicky vázaného fosforu, stanovení celkového bílkovinného dusíku Kjeldahlovou metodou kieldahlizace v klinické chemii - směs obsahující konc. kyselinu sírovou se solemi, např. s K2S04 s CuS04, HgS04 a Se02 zakoncentrování zakoncentrování stopových, jinak nestanovitelných množství analytů (bílkoviny) metody dialýza, ultrafiltrace nebo separace na koloně : nejsou předmětem práce běžné laboratoře 32 instrumentace analyzátory; organizace, integrace a miniaturizace analýz historie významná změna za posledních 40 let manuální provoz => automatické analyzátory odběr- krev injekční jehlou do otevřené skleněné zkumavky : ta je buď neuzavřená, nebo v lepším případě uzavřená korkovou či gumovou zátkou v laboratoři - sraženou krev promíchat skleněnou tyčinkou, odstředit a sérum nad sraženinou odsát Pasteurovou pipetou, přenést do další zkumavky pro analýzu : vzorky a připravená činidla odměřit do reakčních zkumavek, a nechat proběhnout příslušnou chemickou reakci, přelít zreagovanou směs do kyvety fotometru, změřit absorbanci a provést výpočet obsahu analytu : stanovení jednoho analytu - od 50 do 500 pl séra a dalších 1.5 - 2 ml činidel srovnání: kolem r. 1930 byl objem reakční směsi pro stanovení alkalické fosfatazy přes anorganický fosforečnan několik mililitrů a inkubace trvala kolem 48 hodin 33 xx ■ analyzátory - kapalná činidla průtokové (50. léta) => centrifugační => pásové (70. léta) => revolverové : vícekanálová analýza - paralelní analýzy : vícekomponentová analýza - více analýz z jednoho vzorku průtokové a. skleněné kapiláry, vzorky oddělené vzduchovými bublinami nebo inertní kapalinou : vícekanálová analýza vysoká správnost a shodnost analýz 34 rotor s prohlubněmi paprskovitě od středu dvě reakční místa oddělená zvýšenou přepážkou centrifugační a, vnější prohlubeň - fotometrická kyveta, kolmo na rotor průhledné okénko : odstreďovaním dávkování vzorku i činidla; slití vzorku s činidlem :: přelití se do měřícího prostoru rotor - 28 pozic pro vzorky, standardy a kontroly, omyvatelný : analýzy po metodách {batch analyses) nevýhoda: neselektivní; nemožnost analýzy s přímým přístupem {random access analysis) 35 pasové a, kopírování reakcí ve zkumavce : nekonečne pohyblivé pasy osazené radami zkumavek ve vodní lazni : lineární pohyblivý dávkovač pipetuje sérum a fixní dávkovače jednotlivá činidla : po proběhnutí reakce byl obsah zkumavek nasát do měřících kyvet : zkumavkami byly umyty, vysušeny a znovu použity k analýze :: doslova zástupy pochodujících zkumavek nevýhoda: spotřeba vzorků i činidel revolverové a. kruh stojanů na vzorky, činidla a reakční kyvety se soustavou dávkovačů : řízeno procesorem : měření absorbance 340 - 600 nm vyměnitelnými filtry (5 - 8) malé, střední nebo velké : dosahované průměrné hodinové výkony (analýz/h) :: výkon se pohybuje od stovky za hodinu až nad tisíc v hodině paleta metod, bez přeprogramování: 15 - 50 speciální analyzátory - vybrané skupiny analytů dle lékařských požadavků : nebezpečná léčiva {drug monitoring), analýza moči, stanovení hormonů, stanovení onkomarkeru, koagulační hematologické přístroje (počítače krevních částic aj\) neodkladná (akutní) vyšetření- speciální malé analyzátory 37 analyzátory - suchá chemie suchá chemie - činidla v suchém stavu destičky či proužky (stripy) - nosiče reagencií principy měření signálu: kolorimetrie, měření odrazu, potenciometrie a imunochemické reakce až 50 různých druhů analýz analyzátor s destičkami: obsahuje zásobníky destiček, stojánek pro více vzorků a dávkovač vzorek do okénka na jednu stranu destičky; vsákne se do reakční zóny => příslušná chemická reakce; odezva se měří v měřícím okénku na druhé straně destičky analyzátory s diagnostickými proužky: měří se odraz zbarvení reakční plošky 38 umožňují buď jednotlivé analýzy nebo analýzu souboru více analytů vzorek 10 Ml destilovaná voda < * «"^ ♦ wwfw ♦ ¥ ¥ vzorek reagencie krve formován produktu mwwn omytí 18 min. G12nM ~[\ 0, í W/L w #■ mereni na sucha suchá chemie - nemožnost rychlého transportu vzorku nebo výsledků; malý objem analytu : snadné pro obsluhu, ale nevhodné pro kvalitní screening; orientační stanovení 39 ostatní analyzátory AAS (atomová absorpční spektrometrie), FAS (fluorescenční absorpční spektrometrie), centrifugy, CZE a PAGE bílkovin a lipoproteinů, skenery, pH-metry, osmometry, coulometry, fluor i metry, analyzátory NA, chromatografy, hmotnostních spektrometry... přeměna laboratorní diagnostiky na laboratorní medicínu => pokroky v instrumentaci! laboratorní medicína <= patologie a laboratorní praxe na začátku 19. století (C. Bernard, R. Virchow, J. Hopkins a další) do 30. let využívána k dodatečnému potvrzení diagnózy - laboratorní diagnostika rozvoj po r, 1950 - prudkým růstem počtu laboratorních vyšetření nástupem nových diagnostických metod, zejména s imunodiagnostikou (kolem r. 1960), zrychlených automatizací a komputerizací analýz (po r. 1970); a molekulární biologií (po r. 1990) 1970 - 1990 : meziroční t počtu analýz o cca 12 %, náklady na laboratorní diagnostiku dosáhly již asi 10 % z celkových nákladů na zdravotnictví 41 racionalizace efektivita práce - slučování samostatných sekcí (hematologie, klinické biochemie, imunologie, částečně mikrobiologie) => => konsolidované laboratoře; rychleji a levněji komplexní servis kontrola u lůžka {bed-side monitoring) rychlá analýza u lůžka pacienta personálem kliniky akutní analýzy na místě - tzv. point-of-care testing (POCT) klinická chemie akutních stavů sledování tzv. vnitřního prostředí pacienta: pH krve, p02, pC02, ionty sodíku, draslíku, chloridy a hemoglobin nebo hematokrit sebekontrola pacientů (home diagnostics) analýzu nebo vyšetření si pacient provádí doma sám kontrola aktuálního stavu, dávkování léku, nebo signál k návštěvě lékaře miniaturizace a automatizace - robotizovaných celků, do tzv. diagnostických center 42 centralizace konsolidované laboratoře současně analýzy biochemické, hematologicke, imunochemicke, detekce některých cílových sekvencí NA + mikrobiologické analýzy soustřeďují analýzy z původně izolovaných laboratoří klinické biochemie, hematologie, mikrobiologie, imunochemie aj. do celku, který je schopen poskytnout na jednom místě hlavní laboratorní vyšetření biologických vzorků rychleji a levněji, napříč tradičním oborovým dělením diagnostická centra : komplexní palety analýz : vysoký stupeň automatizace :: umístění vzorků s čárovými kódy pacientů na vozík pohybující se na dráze kolem několika vzájemně kompatibilních analyzátorů, zcela automatické odměřování vzorků, provádění analýz a vydání nálezu : modulárním propojení kompatibilních analyzátorů : řízený celek : analýzy prakticky bez zásahu lidské ruky vzorky pacientů v jednorázových odběrových nádobek s čárovým kódem, ten zahrnuje požadované analýzy + identifikačních znaků rozdělení vzorku do zkumavek dle požadovaných analýz : vzorek se automaticky pohybuje mezi analyzátory : kumulace nálezů a databáze pacientů 44 organizace diagnostických center : centrální laboratoř {core laboratory) :: cca 75 % objemu činností :: analytická chemie, hematologie, toxikologie, imunologie, analýzy moči : mikrobiologie :: cca 20 % objemu činností :: kultivace vzorků krve a moči, sérologie : transfúzni služby :: cca S % objemu činností :: určování krevních skupin a předtransfúzní křížové testy/zkoušky malé, specializované laboratoře akutní analýzy, analýzy pro poradny (diabetológii, urologii, toxikologii apod), kde je vhodné nebo nutné provést některé základní analýzy na místě a co nejrychleji miniaturizace dlouhodobý trend : A rozměrů analytického místa na mikro- až nanometrové : A objemu vzorku a činidel na submikrolitry :: mikročipy mají analytická místa o rozměru cca 10 až 100 |jm :: velikost lidského erytrocytu je 7 |jm termíny z mikroelektroniky čip {chip, pův. tenký plátek polovodiče): soubor analytických míst na matrici (mikrojamek či mikrotecek obsahujících všechny potřebné reagencie); + další funkční elementy: kanálky, mikropumpy, čidla apod pole {array, pův. uspořádání v řádcích a sloupcích; soustava uspořádaných elementů): způsob uspořádání souboru nebo množiny analytických míst a funkcí na matrici mikroanalytická jednotka - celý analytický systém, tedy kompletní mikroanalyzátor, včetně dávkovačů, ventilů a detektorů měřeného signálu 46 technologie mikroanalytických přípravků => zachycení určitých cílových skupin obsažených ve vzorku vhodným čidlem (sondou) čidlo - afinitní systém (protilátka, enzym, bílkovina, NA nebo kompletním biologickým systémem) detekce - optické metody, elektrochemicky nebo měřeními reagujícími na hmotnost (např. akustickými vlnami) základní dělení mikroanalytických přípravků : mikroreakční destičky o vysoké hustotě reakčních míst : reakční místa na povrchu plochy : mikročipy a nanočipy : senzory a biosenzory (biočipy) 47 mikroreakční destičky o vysoké hustotě reakčních míst původní mikrotitrační destička ELISA: čirý polystyren, 8x12 (96) jamek na 9x12 cm, objem jamky je cca 0.2 ml dnešní mikroreakční destičky: od 192 do 20000 mikrojamek o objemu 125 |jl do 50 ni praxe: čipové přípravky s cca 100 analytických míst; kompromis mezi miniaturizací a její cenou mikrodávkovače (na bázi techniky ink-jetodměřující mikro- až nanolitry) mikrodetektory (spojení mikroskopu s fotometrem či fluorimetrem) měří signál (např. absorbanci) v mikrojamce destičky shora dolů; jamka je současně reakční cela i měřící kyveta měření: metoda „smíchej a měř" mikroreakční destičky - polymerní materiál; odlitím nebo vrtáním jamek laserem, laserovou ablací apod mikroreakční destičky - mikročip i mikroarray reakční místa na povrchu plochy reakční systém - přímo na podložce, cca 1 až 2 cm2 (ne v mikrojamce) : stovky mikroteček o velikosti 10 - 100 pm materiál podložky: sklo, křemík, plasty (teflon, polymetylmetakrylat, polykarbonát, polypropylen, polyakrylamid apod) nanášení vzorku: technika ínk-jetnebo tiskem (fotolitografie) měření analytického signálu: většinou odrazem ■ 49 mikročipy mikročipy a na noci py 1 matrice/nosič - cca 1.5x1.5 cm; tloušťka několik milimetrů materiály: sklo, křemík, hydrofobní plasty reakční místa: jamky nebo mikrotecky; propojeny nanokanalky s ventily, kanálky jsou naplněny gelem : možnost osazení elektrodami => elektrické napětí mezi jamku/vzorek a senzor průtok vzorku sledován čidly s laserovou diodou (excitace fluorescence; detekce fotonásobičem; značení reaktantů/vzorků fluorofory) analýza: DNA, RNA, léčiv apod tekutiny se pohybují na principu elektrokineze elektroosmóza; využívá el. pole k pohybu vodivých vodných roztoků elektroforézou; dělení molekul v el. poli podle jejich náboje 50 externí mikropumpy - jiná možnost pohybu tekutin : velikostí čipy mnohonásobně přesahují; nesnadné spojení s |j-čipem centrifugační analyzátory - řešení problému externí pumpy původně pro analýzy v beztížném stavu mikročip pro centrifugační analýzu - LabCD materiál: třívrstvý disk, vícenásobné stanovení jednoho typu analytu {cca 96 stejných mikrokyvet) obsah: řídící software, zahřívací elementy a mikrokanalky, reakční jamky, ventily a mikrokyvety pohyb kapaliny - kapilární síly, centrifugační odstředivé síly míšení, zřeďování, promývání; zahřívání, filtrování, lyžování, separace buněk, fotometrická nebo fluorimetrická detekce modifikace - systém tzv. povrchově řízeného toku uvnitř mikrokanálků (tzv. surface-directed liquid flow inside microchannels) - mikrofluid n í systém => rychlý laminárnítok, molekulární difúze kanálky zhotovené fotolitografií 51 funkce LabCD 1. nanesení vzorku 2. odstředění prekoncentrace na koloně 3. promytí kolony 4. eluce z kolony 5. vzorek v detektoru nanocipy další miniaturizaci mikrocipu => nanometry kopírují často funkci přírodních molekul (např. kolagen - kabel, DNA - paměťová jednotka, bílkovinná membrána - pumpa) ultramikroanalýzy (nanoanalýzy) - léčiva, biologicky aktivní látky, imunoanalýza, mitochondriálních DNA apod omezení - limity citlivosti analýz a náklady (prudce zvyšují) komplikace - odpařování mikroobjemů vzorku i činidel na mikrocipu vzorek: objem 1 \A, analyt 2 fmol/l = 6020 molekul analytu redukce objemu na 1 ni => jen 6 molekul analytu!! : většinou pod detekčním limitem analytické metody na mikrocipu : postupy prekoncentrace: flow-through apod 53 senzory využití mikroelektrod na křemíku např. odpor tenké kovové vrstvy (Au, < 30 nm) se zvyšuje s přítomností jiných atomů a molekul na povrchu filmu Au : elektrony dopadající na kovový film (~ zrcadlo) jsou odráženy : v místě adsorpce jiných atomů a molekul se elektrony neodrážejí, ale jsou rozptylovány => změna odporu filmu Au (t); odpor = /"(koncentrace) využití: např. stanovení stop těžkých kovů v roztocích (iontů Cd, Pb, Ni, TI, Zn, jejich organické komplexy), limit detekce ppb (parts per billion) průtokové cely - kvalita pitné vody, korozní procesy, ale i v organizmu čipový senzor pro penicilin křemík s pH-citlivou strukturou (Si3N4) D O O O O O > penicilináza ---------► i mobilizace ------->■ p H citlivá vrstva -------► oxid křemičitý ------->■ křemík penicilín + H20 pemaiáza> kySi 6-aminopenicilanová + H+ měří se vysoce citlivou pH-vrstvou 54 biosenzory (biočipy) biologický systém (enzym, receptor, orgán) s analytickým čipem využití: medicína, biotechnologie, kontrola a monitorování potravin životního prostředí princip: propojení biomolekul s křemíkem technologie EIS {capacitive electrolyte insulator semiconductor) BioFET {biologically sensitive field-effect transistors) modelový analytický systém biosystém + analyt => produkt + elektrony/protony(H+) pripadne biosystém 1 + analyt => produktl biosystém2 + produktl => produkt2 + elektrony/protony(H+) analýza metabolitů, osobní ID (pot) apod. referenční elektroda / elektrolyt membrána ISFET iontově selektivní tranzistor řízený polem ion-selective field-effect transistor referenční elektroda roztok analytu ENFET enzymový tranzistor řízený polem enzyme-controlled field-effect transistor 56 DNA-čipy určování cílových sekvencí nukleových kyselin detekce patogenů, prenatální diagnostika, forenzní diagnostika, testy POCT princip: na čipu sonda s sekvencí DNA (Watson-Crickovo párování) komplementární k cílové sekvenci NA pouze komplementární sekvence interagují! vzorek TAACGCGATTGTGTGAC sonda ATTGCGCTAAGTCACTG sonda je značena např. luminoforem => indukce laserem + fluorimetr zachyceno červené nedokonale zachyceno žluté nezachyceno zelené a a a a * a .\ t»J 41 * ft a a * j ir| a u a a ^ j ^ a j , ' • ■ * • -j * a i a t > >• j J A j • j u v u a 4 a • )*# 4 a i A j|d u a ' j • a 9 40' a i ■ • • J J > -J a id» •>#« a »« * (r . 4 O 0 ] * * u a - * ■ •44 - :■ -J C j ujo, 0 a • • * • DQj d d a « a • u -J * • ■j j a j u j oc u j 0 j j a a j j t ■ » 4 #a a 1 0 »•O« «• 101 0 | u v a • J U u 1 D 0 ■J 1 J * ***** i íj • 57 imunosenzory miniaturizace imunoesejí (kompetitivní, někompetitivní) imunoanalýza na nasákavé podložce : metoda suché chemie materiál: filtrační papír, tkané rouno : ukotvené reakčními komponenty; difuzibilní sekundární značená protilátka vzorek difunduje nasákavým materiálem do reakčních zón : 1 až 5 minut => barevné pruhy indikující výsledek testu detekce: vizuálně nebo jednoúčelovým reflektometrem analytické systémy - binární jednoúčelové testy - ano/ne analytické kazety (patrony) materiál: plastová patrona s činidly v suchém nebo v kapalném stavu vzorek se v systému kanálků smísí s činidly detekce: v místě optické kyvety se odečte analytický signál : analýza léčiv, drog, nebo pro akutní analýzy 58 mikročipy pro stanovení jednoho druhu analytu na mikročipu - pole stejných analytických míst - mikroteček mikrotecka - imobilizovana primární protilátka (AbJ, v přebytku r^i pf rvi senzor pevná podložka Abi vývojka Ab2 jif ^ [V) PT rvi přidá se vzorek/antigen (Ag) => kotvený imunokomplex [Ab^-Ag] promytí; přidá se značená sekundární protilátka (Ab2*) => => sendvičový imunokomplex [Ab1b-Ag]-Ab2* detekce: spektrofotometricky primární protilátka - protilátka senzorová sekundární protilátka - protilátka vyvolávací multifunkční mikročip - mikrotecky obsazeny různými druhy protilátek => současné stanovení několika různých analytů 59 mikročipy pro současné stanovení několika analytů analytická místa (mikrotečky) - různé primární protilátky (AbJ např. proti antigénu Aga primární protilátkou Abla, proti antigénu Agb primární protilátkou Ablb atd. promytí; přidá se směs monoklonálních sekundárních značených protilátek proti stanovovaným antigenům (*Ab2a, *Ab2b, atd) detekce: laserový mikroskop detektory fotonů alfa beta \ / ^r^r-o ® P^O------TT— mikročip pro více analytů multianalytové imunomikročipy - POCT (cca 8 až 10 analytů), onkomarkery, alergeny, hormony pro endokrinológii, screening vybraných analytů dárců krve v transfusních stanicích apod. 60 jakost v klinické analýze její kontrola a řízení „fatálnP' význam klinické medicíny aplikace norem ISO řady 9000 jakost charakteristické a žádoucí vlastnosti nebo rysy výrobku či služby jakost je nepřímo úměrná variabilitě výrobku nebo služby : variabilita - odchylka od návrhu/záměru prověření všech etap celého stanovení analytu : od odběru vzorku až po výpočet; výcvik analytika, příprava činidel, mytí nádobí, nakládání s odpadem atd výsledkem je návrh na jejich správné provádění a vytvořit podmínky pro provoz s minimálními odchylkami od předepsaného postupu, včetně kontrolního mechanizmu 61 III. definice dle CSN ISO 8402 jakost (quality) celkový souhrn vlastností a znaků výrobku (např. analytické soupravy) nebo služby (např. provádění analýz), které zaručují schopnost uspokojovat předem stanovené nebo předpokládané potřeby koncepce jakosti (quality policy) celkové záměry a směry působení organizace v oblasti jakosti formulované vrcholovým vedením (např. vedoucím laboratoře) řízení jakosti (quality management) součást funkce celkového řízení, která určuje a realizuje koncepci jakosti systém jakosti (quality system) organizační struktura, zodpovědnosti, postupy, procesy a zdroje potřebné na realizaci řízení jakosti; požadavkem je, aby veškeré postupy byly jasné, řádně dokumentované a dodržované; systém jakosti je pravidelně kontrolován a doplňován; všichni pracovníci se aktivně zúčastňují zavádění a provozování systému jakosti 62 příručka jakosti řízení jakosti v laboratoři - příručka jakosti : je v každé certifikované či akreditované laboratoři komplexní dokument zahrnující všechny aspekty činnosti laboratoře, od činnosti vrcholového managementu až po úklid laboratoří „domácí norma" - převod obecných norem ISO 9000 resp. EN 45000 správné laboratorní praxe (GLP), bezpečnostních předpisů, zákonů a nařízení aj\ na konkrétní podmínky laboratoře celková koncepce jakosti 63 1) laboratoř a její povinnosti - jméno laboratoře, adresa, fax, e-mail, tel. čísla, jméno zodpovědného vedoucího 2) pracovní doba laboratoře - způsob a doby příjmu vzorků 3) seznam zajišťovaných služeb - (včetně analytů) 4) komunikace mezi laboratoří a uživateli - popis žádanek, popis nálezového formuláře, pravidla pro předávání výsledků telefonicky, způsob, pro opravy či doplnění předaných analytických nálezů, dobu potřebnou k provedení analýz, včetně způsobu kontroly jejího dodržování 5) odběry vzorků (doba) - instrukce pro pacienta, doprava vzorků, úprava až po přípravu zkušebního vzorku a skladování včetně expirační doby; zajištění jednoznačné identifikace pacienta; způsoby vyřazení nevyhovujících vzorků; směrnice pro předávání dílčích vzorků do různých sekcí laboratoře 6) provádění analýz - psané návody pro užívané analytické postupy; dohledatelnost každého stanovení od žádanky až po laboratorní nález; kalibrace včetně návaznosti na metrologický vyšší etalony 7) interpretace výsledků - údaje o možnostech konzultace pracovníků laboratoře, určené kontaktní osoby 64 8) účast na klinických poradách, setkání s externími lékaři 9) výchova pracovníků laboratoře, kliniků, sester a studentů 10) informování o změnách v provozu, o akreditaci či certifikaci 11) účast na vývoji a výzkumu - koncepci účasti laboratoře na výzkumu a vývoji; systém kontroly a jména příslušných odpovědných pracovníků 12) způsoby zajištění povinné mlčenlivosti 13) počty pracovníků v jednotlivých kategoriích 14) údaje o vybavení laboratoře - názvy přístrojů, výrobci, rok nákupu, cena, údaje o záruce, umístění přístrojů, údaje o servisních prohlídkách, o opravách, provozní deník přístroje a jeho uložení; o kalibraci 15) bezpečnostní pravidla laboratoře a nemocnice - uložení příslušných směrnic; záznamy o nehodách a úrazech jakost není stav, ale dynamický, vylepšující se proces 65 kalibrační, kontrolní a referenční materiály chybná analýza => špatné rozhodnutí => poškození zdraví nebo smrt merici proces - k merenemu signálu přiřadit jeho odpovídající koncentrace pomocí kalibračních materiálů (standardů) kontrolně-regulační proces - validace výsledku analýzy a zahrnutí do řízení jakosti; sledovaní analýzy v delším časovém intervalu : vyžaduje vhodné kontrolní a referenční materiály 50. - 70. léta XX. století analýzy manuální (fotometrický, titračně apod.) nebo poloautomatické (nalévací/odsávací kyvety) : objem vzorku 20 - 500 |jl, objem činidel 1 - 5 ml : vodné roztoky připravené z čistého analytu dnes automatické analyzátory : objem vzorku v mikrolitrech, objem činidla v desítkách mikrolitrů : viskozita => potíže, kalibrační roztoky bez biologické matrice nesplňují :: požadavek shody s analyzovaným vzorkem :: místo vodných roztoků kalibrátory s bílkovinnou matricí : certifikované referenční materiály 66 vodné kalibrační roztoky a standardy IFCC - všude, kde je to možné - kalibrace pomocí vodných roztoků standardů stabilizování a ochrana (oxidace, bakteriální kontaminace apod.) užití: atestace enzymů, ověřování výtěžnosti analytické metody, kontrola vlnových délek fotometrů apod. příprava: vážením; vysoce čisté chemikálie, redestilovaná voda uchování: skleněné ampule nebo dobře těsnících lahviček : pod inertní atmosférou N2 nebo C02 pomocné látky: albumin, polysacharidy, cukry, glycerol (stabilizace enzymů), cystein, dithiothreitol, kyselina askorbová (ochrana před oxidací), komplexany, (např. EDTA, maskování těžkých kovů katalyzujících oxidaci), různé pufry a produkty enzymové hydrolýzy substrátů (zvýšení stability enzymů) a konzervační přísady (benzoan sodný, azid sodný apod.) nesmějí obsahovat jako příměs/nečistotu uvažovaný standard (jen stopové a definované množství) kontrolní séra a moče k operativnímu řízení jakosti (k tzv. vnitřní kontrole kvality) kapalná - zmrazená (- 80 °C) : původně séra zvířecí: koňská {equině), hovězí {bovine), prasečí {porcine) : nahrazována séry lidského původu lyofilizovaná - stabilnější : připravována v nejméně dvou koncentracích pokrývajících jak referenční interval analytů, tak i patologické hodnoty séra s atestem - určení správnosti v delším časovém intervalu séra bez atestu - určení shodnosti (reprodukovatelnosti) parametry: pH 7 až 8, rozdíl obsahu ve stejné šarži < 0.1 %, volný glycerol < 0.2 %, mají být sterilní, zbytková vlhkost < 1 %, stabilita v chladu 3 roky, rozdíl obsahu labilních složek < 4 %, zákal po rekonstituci a zředění vodou 1:9 měřený kyvetě 1 cm jako absorbance při 700 nm pod 0.05 a při 340 nm pod 0.2 68 sérové kalibrátory podobné složení a chování jako analyzovaný vzorek příprava: jako kontrolní séra; koncentrace analytů se upravuje přidáním lyofilizáty - stabilita komutabilita s určenými metodami příprava a atestace: jako u kontrolních sér obsah jednotlivých analytů stanoven definitivními či referenčními metodami certifikovanými referenčními materiály přípravky pro normální a patologické hodnoty analytů multikalibrační přípravky 69 0221 certifikované referenční materiály (CRM) : kalibrace definitivních a referenčních metod : testování/porovnávání rutinních metod (komutabilita) RM - materiál nebo látka, hodnoty vlastností stanovenými pro kalibraci přístrojového vybavení, vyhodnocení metody měření nebo pro stanovení hodnot materiálů CRM je RM doložený certifikátem : certifikovaná metoda je doprovázena nejistotou při dané konfidenční úrovni koncentrace a matrice analytu v CRM stejná jako analyzovaném vzorku vhodnost RM pro daný účel se prověřuje (ISO Guide 35) šarže CRM musí být homogenní : rozdíly mezi reprezentativním měřením vzorku musí být vždy menší než celková nejistota všech měření CRM musí mít uvedenu svou expirační lhůtu CRM - opatřen atestem koordinace evropskou komisí při evropské unii, např. institutem pro referenční materiály a měření v Belgii (IRMM) 70 validace a správná laboratorní praxe potvrzení měřením (zkoušením) a opatření objektivního průkazu, že byly splněny jednotlivé požadavky pro určený účel validovaná analytická metoda - poskytuje medicínsky správné výsledky a využitím analytického výsledku při léčení pacienta nedojde k jeho újmě ověření velikosti celkové chyby - součtu chyb náhodných a systematických správná laboratorní praxe {good laboratory praxis, GLP) : mezinárodně dohodnutý systém zabezpečení a kontroly jakosti : zahrnuje organizaci zkoušek, studií a podmínek, za nichž jsou neklinické studie plánovány, prováděny, monitorovány, zaznamenávány, archivovány 71 operativní řízení jakosti také vnitřní kontrola kvality (VKK) nástroje VKK tzv. „báječná sedma": tabulka lodyha-list {stem-and-leaf display) - kontrolní data OBŮ rozepsaná tak, aby bylo možné rychle posoudit globální rozdělení dat =>----- list závad {check list) - kalendář s uvedenými příčinami závad; řádky s----- tvoří kalendář, do kterého se zapisuje, kdy a kolikrát se daná závada objevila Paretův graf {Pareto chart) - histogram se sloupci vyjadřujícími li. četnost jednotlivých typů závad v klesajícím pořadí diagram příčina-následek {cause and effect diagram) - grafický /T~ rozbor chyb a jejich zdrojů PPP proudový diagram {flow chart, defect concentration diagram) -grafické zobrazení zařízení či procesu s vyznačením citlivých bodů korelační diagram {scatter diagram) - korelační graf k odhadu vzájemných závislostí analyzovaného problému regulační diagram {control chart) 72 regulační diagram : 1931 W.A. Shewhart : 1950 S. Levey a E.R. Jennings - klinická biochemie jednoduchá grafická interpretace Gaussova rozdělení množina normálně rozdělených dat => v intervalu směrodatných odchylek od -s do +s leží 68.3 % údajů od -2s do +2s leží 95.5 % údajů {varovná mez) od -3s do +3s leží 99.7 % údajů {regulační mez) to c (O u (O c a> u c 1p. 15 den měření + 3s ♦ 2$ 2s 3s osa x - cas osa y - měřený signál : uvedený podíl údajů musí ležet v odpovídajících pásech na grafu : polovina těchto údajů musí být střídavě nad a polovina pod osou x 73 kumulace jen na jednu stranu intervalu => systematická chyba v analytickém procesu : mimo varovnou mez > lx měsíčně : mimo regulační meze > lx za 18 měsíců :: mimo varovné meze častěji => závady v analytickém procesu nebo proces je úplně mimo kontrolu odchylky: A směrodatné odchylky (s); A vychýlení (B) účinnost regulačního diagramu průměrné délky série (PDS) : 0 počet bodů, kdy právě vynášený bod indikuje metodu mimo kontrolu PDS = 1/a kde p je pravděpodobnost, že libovolný bod překročí kontrolní meze operativní charakteristické křivky : závislost chyby ß, tj. pravděpodobnosti nezjistit posun ß = 0 (Ĺ - k^N) - 0{-L -HN), kde 0 je Gaussova funkce, L je násobek s dle zvolené meze, k je faktor respektující změnu x v násobcích s, N je počet vzorků 74 silofunkce na rozdíl od operativní charakteristické křivky osa y - (1-/?), tedy pravděpodobnost zamítnutí 1.0 0J8 0.6 04 0.2 0.0 1.0 1.6 2.0 2jG 3.0 ks 1-ß N = fi^-^~~~^ /^í>^~^^ y S^ 1^^^^ ■ /jS mezilaboratorní posuzování jakosti (EQA, external quality assurance) součást obecného řízení jakosti každé laboratoře {cca lx za 2 měsíce) : validace metod : sledování laboratoře a porovnání její přesnosti vůči ostatním laboratořím nebo obecně platným požadavkům posuzuje se : vychýlení ve vztahu k současně dosahované úrovni {state-of-the-art), resp. vůči údajům získaným referenčními či definitivními metodami : dosahovaná úroveň všech zúčastněných laboratoří, a to jak podle inter-, tak i podle intralaboratorního rozptýlení nalezených údajů : vztah mezi nalezenými údaji a způsobem kalibrace, analytickým postupem, užitými komerčními analytickými soupravami a použitým přístrojovým parkem : dosahovaná současnou úroveň v závislosti na koncentraci analytu v kontrolních materiálech 76 mezinárodní harmonizovaný protokol pro ověřování způsobilosti (chemických) analytických laboratoří international harmonised protocol for proficiency testing of (chemical) analytical laboratories : od roku 1992 : IUPAC, ISO a AOAC {association of official analytical chemists) materiál IFCC: základy mezilaboratorního posuzování jakosti přesná a protokolární organizace testu statistické vyhodnocení testu z-skóre z = (x-Xa)/sf kde 5 je cílová směrodatná odchylka, x je naměřená veličina, Xa dohodnutá (skutečná) hodnota veličiny a z má tvar směrodatné normální veličiny interpretace z-skóre z\ < 1 lze hovořit o dobrém skóre z\ < 2 o skóre dostačujícím 2 < \z\ < 3 o skóre problematickém skóre \z\ > 3 skóre nedostačující význam hodnocení laboratoře úspěch laboratoře v externím hodnocení kvality její výkony jsou v tolerančních limitech akceptovaných (mezi)národní společností klinické chemie pro dané období příslušnou výběr Ai odběr preanalyt. f. mimo laboratoř] 20.2 % ^ IjugJ transport registrace preanalyt. f. v laboratoři 57.1 % III odstředění f rozdělení příprava vzorku preanalytická fáze analytická fáze postanalytická fáze 78 řízen a kontrolován - pouze vlastní analytický postup opomíjení preanalytické fáze (odběr, transport a uchovávání vzorku) chyby preanalytické fáze - až 50 % X analytický proces má asi 25 % zbytek připadá na tzv. postanalytickou fázi jednu hrubá chyba na cca 1600 analýz příprava vzorku (55 % jde na vrub jeho hemolýzy), nedostatečný objem vzorku (21 %), záměna vzorků (12 %) a koagulovaný vzorek (5 %) hrubá chyba ohrožuje život => zpřísnění kontroly preanalytické fáze Kill as few patients as possible & 56 other essays on how to be the world's best doctor, Arlan Cohn, 2004 postanalytická fáze : uskladnění vzorků i výsledků : přeměna analytických výsledků na podložené informace (smysl lab. medicíny) : komunikace s praktikem, zpětná vazba : metaanalýza výsledků 79 analytické metody výběr a optimalizace_____ výběr metod/postupů je poznamenán vývojem oboru analytické chemie : kvalitativní : kvantitativní původně: metody chemické : počet stanovovaných analytů byl malý, nepřesáhl několik desítek od 70. let: metody biochemické/enzymatické/molekulárně biologické : spektrofotometre : průmyslová výroba enzymů, analyzátory zájmem klinické laboratoře je analytický postup : náročnější požadavky - analytické i klinické požadavky vlastní nepřesnosti výsledku testu: včetně preanalytickych chyb, systematické vlivy, náhodné chyby a omyly biologické vlivy: intra- a interindividuální variabilitu, chyby způsobené nestandardním odběrem vzorků nejistoty: schopnost testu skýtat správné závěry (diagnóza, prognóza, nebo terapeutická rozhodnutí) 80 historie stanovení glukózy: 1) oxidoredukční vlastnosti v alkalickém prostředí, oxidace kyselinou pikrovou, ferrikyanidem nebo redukcí Cu1+; pracné, málo citlivé, nespecifické 2) 0-toluidinem přes Schiffovu bázi; citlivé a specifické; o-toluidin -kancerogen, činidlo obsahuje ledovou kyselinou octovou 3) stanovení enzymovými postupy (GOD) charakteristické znaky analytické metody definovaná a popsaná analytická metoda : charakteristické znaky, normované v mezinárodních normách ISO i v odvozených nebo převzatých národních normách 81 specifické klinické požadavky přesnost metody ve vztahu k biologické variabilitě rozsah kalibrační funkce - minimální rozsah kalibrační funkce v rozsahu referenčních hodnot analytu analytická metoda - v principu funkce daného analytu v organizmu ekologické a toxikologické požadavky analýza potenciálně infekčního biologického materiálu neužívat k analýze jedy, kancerogeny, žíraviny a hořlaviny nevyhnutelnost: stanovení kreatininu kyselinou pikrovou, celkové bílkoviny biuretovou reakcí s NaOH, stanovení hemoglobinu přes hemigiobinkyanid aj. 82 vlastní znaky analytické metody znak analytické metody {analyticalperformance characteristic) : vlastnost z množiny vlastností, které jsou nutné pro ověření přesnosti měřícího postupu a jeho vhodnosti pro daný účel a které může být přiřazena experimentálně určitelná hodnota definováno IFCC a IUPAC "V v Česká společnost chemická (CSCH) -jiná nomenklatura analytických znaků správnost {accuracy, truenessr, ČCHSpravdivost) : těsnost shody mezi průměrnou hodnotou získanou z velké řady výsledků zkoušek a přijatou referenční hodnotou přijatá referenční hodnota {dohodnutá referenční hodnota) : hodnota, která slouží jako schválená referenční hodnota, odvoditelná jako a) teoretická b) odsouhlasená (certifikovaná), založená na experimentálních pracích c) přiřazená (certifikovaná), založená na experimentální spolupráci d) není-li ani a), b), c); očekávaná hodnota měřitelné veličiny, tj. střední hodnota specifikovaného základního souboru měření 83 strannost čili vychýlení {bias, odchylka) rozdíl mezi střední hodnotou výsledků zkoušek a přijatou referenční hodnotou stanovení: pomocí CRM nebo RM výtěžnost {recovery) relativně vyjádřený rozdíl mezi údaji měřícího systému při měření vzorku se známým přidaným množstvím analytu a vzorku bez přídavku, vztažený na přidané množství shodnost, preciznost {precission, přesnost) těsnost shody mezi nezávislými výsledky zkoušek získanými za předem specifikovaných podmínek opakovatelnost {repeatibilitý) shodnost stanovená za podmínek opakovatelnosti (stejná laboratoř, stejná metoda, stejné zkušební zařízení, stejný operátor, během krátkého časového intervalu) 84 reprodukovatelnost {reproducibility) shodnost stanovení za podmínek reprodukovatelnosti (stejná metoda, různá laboratoř, různý operátor, různé zkušební zařízení, různá doba) přesná specifikace - slouží jako základ při konstrukci regulačních diagramů nejistota měření {uncertainty of measurement) parametr přidružený k výsledku měření, charakterizující rozptyl hodnot, které by mohly být důvodně přisuzovány k měřené veličině zahrnuje mnoho složek nejistota typu A - charakterizace směrodatnou odchylkou určenou ze statistického rozložení výsledků nejistota typu B - charakterizace směrodatnými odchylkami z předpokládaných rozložení na základě zkušenosti nejistota jako směrodatná odchylka - směrodatná nejistota u^ výsledná nejistota metody - kombinovaná směrodatná nejistota uc^ nejistota - interval kolem výsledku měření (rozšířená nejistota U) U = k*uc, kde k je koeficient rozšíření normálně rozdělené hodnoty a k = 2 => => výsledek v uvedeném intervalu s pravděpodobností 95 % 85 kalibrace soubor úkonů, za specifikovaných podmínek se stanoví vztah mezi hodnotami měřených veličin a odpovídajícími kalibračními hodnotami (etalony) kalibrační funkce S = f (c) analytická citlivost - první derivace této funkce podle koncentrace dS/dc = d/^/dc vypočet kalibrační funkce z kalibračních údajů regresní analýzou přednost - lineárnízávislosti{stanovení mezí spolehlivosti, jednodušší výpočty) mez detekce {limit of detection, LD, LOD) - souvisí s mezemi spolehlivosti a = ß- 0,05 ß- pravděpodobnost falešně negativního výsledku a- pravděpodobnost falešně pozitivního výsledku dolní mez stanovitelnosti {limit of quantification, LOQ) nejnižší výsledek měření, pro který může být udána nejistota stanovení; IUPAC: pro LOQ nejistota (variační koeficient) = 10 % 86 pracovní interval {measuring interval) uzavřený interval hodnot, které lze určit daným měřícím postupem; je omezený dolní a horní mezí stanovitelnosti. U fotometrických metod se vybere lineární oblast kalibrační křivky nebo lineární část grafu závislosti 7~= /"(log c) linearita kalibračního vztahu {linearity) rozsah koncentrací, ve kterém je analytický signál lineární funkcí koncentrace kalibrace (lineární funkce): : 10 koncentrací v pracovním intervalu, 3-4 měření jedné koncentrace : test na homoskedascitu (rovnost jejich směrodatných odchylek) : konstrukce regresní přímky :: normální regrese (homoskedascita) :: vážená regrese (heteroskedascita) : test na linearitu : výpočet mezí spolehlivosti (toleranční interval) 87 analytická specifita, specifita {analyticalspecifitý) schopnost měřícího postupu stanovovat pouze tu měřenou veličinu, která má být stanovena vyjádření - jako nespecifita, tj. jako efekt libovolné složky vzorku odlišné od analytu způsobující změnu indikace měřícího přístroje a tím zavádějící systematickou chybu interference systematická chyba měření způsobená analytickým interferentem analytický interferent - složka vzorku, která je současně složkou ovlivňující veličiny, která však sama není zdrojem signálu měřícího systému, ale která způsobuje přírůstek nebo pokles indikované hodnoty robustnost metody {robustness, ruggedness) schopnost metody skýtat přijatelné výsledky měření i v případě malých odchylek v měřícím postupu nebo ve složení vzorku 88 srovnání s jinými metodami {comparison with other methods) např. rutinně laboratoří používaná metoda a její porovnání s metodou referenční (IFCC), či s metodou definitivní, pokud je k dispozici rozmývání vzorku {carry-over) není znakem metody, ale jedná se o zjištění, zda nedochází k rozmývání po sobě jdoucích vzorku (vzájemné ovlivnění měření signálu nízkého vzorku po vysokém a naopak) problém na levácích a průtokových kyvet provedení: 15 analýz, 5x s vodou (absorbance Ax až A5) 5x se vzorkem (absorbance A6 až A10) nakonec 5x s vodou (absorbance An až A15) A6 - A5 = A10 - A5 = A10 - An a A15 - A5 = 0, nedochází k rozmývání rozmývání - numericky v % jako podíl rozmývání 100 * (A10 - A6)/(A10 - A5) 89 kritéria výběru analytické metody analýza v laboratorní medicíně : smysl pouze k vyhodnocení zdravotního stavu pacienta dva hlavní aspekty klinická užitečnost - jaká je požadovaná jakost z lékařského hlediska jakost analytického stanovení - nesprávnosti a neshodnosti, interference a specifita metody výběr metody podle analytických znaků dle současného stavu (state-of-the-arť) volí se postupy podle právě žádoucích klinických potřeb při užití analytických metod 90 dle požadavků expertů či expertních skupin (panel experts) : empirická zjištění expertů ve specializovaných lékařských odvětvích : kompromisy přihlížející spise k současné dosazenému stavu nez k reálným potřebám dle výsledků řízení jakosti : s rostoucí jakostí analytických metod klesají náklady a pracnost kontroly výběr podle požadavků kliniků zkušenosti lékaře konfrontované se současnou úrovní postupů není možné navrhnout univerzální požadavky na jakost postupů nevýhoda - liší se v řadě případů a není možné stanovit společná hodnotící kriteria výběr založený na biologické variabilitě nejpřiměřenější klinickým i analytickým požadavkům : intra- i interindividuální variabilita analytů je skoro konstantní (i ve stáří) : je možný geografický i časový přenos 91 výběr podle klinické významnosti ke změnám koncentrace nebo i složení některých analytů může dojít při jakékoli změně zdravotního stavu; pro praktické využití je účelné užívat jen některé indikace změny - potřeba definovat užitečnou indikaci změny testy s binárními výsledky výsledky testů: pozitivní/negativní (ano/ne) diagnostická významnost (kontingenční tabulka 2x2) : řádky - výsledky nalezené u skupiny nemocných a u skupiny ne-nemocných pacient pozitivní test negativní test suma nemocný správně (sp) falešně (fn) N*sp + N*fn ne-nemocný falešně (fp) správně (sn) N*fp + N*sn suma N*sp + N*fp N*fn + N*sn N*(sp + f n + f p + sn) 92 senzitivita {citlivost) : pravděpodobnost, že u nemocného bude nalezen pozitivní výsledek testu sens = N*spi {N*sp + N*frí) směrodatná odchylka ssens =V[(se/7s* (1 - sens) / N] specifita : pravděpodobnost, se kterou se u ne-nemocných získá negativní výsledek spec= N*snl {N*fn + N*fp) směrodatná odchylka sspec = V[(s/?ec* (1 - spec) / N] nesenzitivita {necitlivost) : pravděpodobnost očekávání falešně negativního výsledku u nemocného : nesenzitivita je doplňkový pojem k citlivosti (1 - sens) = nesens = N*fn / {N*fn + N*sp) nespecifita : pravděpodobnost očekávání falešně pozitivního výsledku u zdravého (1 - spec) = nespec = N*fpl {N*fp + N*srí) 93 predikce {předpověď) : pravděpodobnost nemoci, je-li test pozitivní (nebo test ne-nemoci negativní) : popsáno dvěma podmíněnými pravděpodobnostmi predpos = N*spl {N*sp + N*fri) pred n eg = N*sn) (N*sn + N*fri) T -iT Z D 94 6 100 -iD 5 95 100 Z 99 101 200 sens = 94/100 =0,94 spec = 95/100 = 0,95 nesens = 6/100 = 0,06 nespec = 5/100 = 0,05 predpos = 94/(94 + 5) = 0,95 predneg = 95/(95 + 6) = 0,94 94 význam prevalence : pravděpodobnost nemoci v definované populaci v určitém okamžiku prevalence- podíl nemocných z počtu testovaných 100 D + 100 -iD => 200 testů => převal = 0.5 citlivost a specifita se nemění, mění-li se počet vyšetřovaných, mění se predikce vždy srovnávat jen souměřitelné testovací skupiny T -iT Z D 470 30 500 -■D 475 9025 9500 £ 945 9055 10000 predikce infaktu D = 500, -iD = 9500 => převal = 0.05 populace X kardiaci sens = 470/500 = 0,94 spec= 9025/9500 = 0-95 predpos = 470/945 = 0-497 predneg = 9025/9055 = 0,997 95 incidence : výskytu nemoci za určitý časový interval (např. rok) např. cukrovka : prevalence v USA - 2.00 %, tj. cca 4 miliony občanů nemocných diabetem : incidence v USA - 1.99 %, tj. každý rok nových 398 000 případů vydatnost : poměr počtu všech správných výsledků k jejich celkovému počtu vydatnost= {N*sp + N*srí) / {N*sp + N*sn + N*fp + N*frí) věrohodnost a poměr věrohodností věrohodnost (likelihood) : pravděpodobnost je mírou pro nastoupení jevu při dané hypotéze : věrohodnost je mírou pro nastoupení jevu při různých hypotézách 96 poměr věrohodností LQ {likelihood quotient, likelihood ratio) LQ = sens I (1 -spec) místo prevalences prediktivní hodnoty: naděje {chance, W) post - naději po provedení testu ante - naději před provedením testu Wpost = LQ * "'ante vztah mezi pravděpodobnostmi a nadějemi W= PI (1 -P)} P = Wl (1 + W) Wante =P/(1-P) = 0.05 / (1 - 0.05) = 0.0526 LQ = sens I (1 -spec) = 0.94 / (1 - 0.95) = 18.8 %ost = ĹQ*Wante = 0.0526 * 18.8 = 0.98888 %ost/ (1+^post) = 0.98888 / (1 + 0.98888) = 0.497 97 definitivní metody klasifikace analytických metod založené na izotopovém zřeďování (ID) a hmotnostní spektrometrii (ID-MS), popř. na kombinaci ID s plynovou chromatografií (ID-GQ : nejsou většinou aplikovatelné do denní praxe - složité a pracné : slouží hlavně při atestaci kalibrátorů a kontrolních přípravků referenční metody základní, důkladně prostudovaný a definovaný měřící postup, jehož analytické znaky (nepřesnost a strannost) dovolují jeho užití k posuzování správnosti jiných měřících postupů a k charakterizaci referenčních materiálů doporučené metody (dle IFCC) s popsanými logickými sledy operací, které jsou součástí postupu měření tak, jak byly definovány a doporučeny příslušnou pracovní skupinou rutinní metody metody, které nepatří do některé z výše uvedených skupin : musí být komutabilní s metodou referenční komutabilní metoda - poskytuje na reprezentativním souboru nativních sér stejné výsledky jako metoda referenční 98 optimalizace analytické metody _________________________________________________________________________ optimální podmínky analýzy : složení reakční směsi (druh, koncentrace složek, pH a teplota reakční směsi apod.) : jednotlivé kroky a pořadí přidávání činidel hledání optimálních reakčních podmínek - zkoumání většího počtu parametrů, zjišťuje se jejich vliv existuje většinou jen jedna určitá optimální kombinace metoda postupného měnění parametrů {single variable approach, SVA) : relaxační metoda zkoumá odděleně reakční parametry; vyžaduje větší počet nezávislých měření; zkoumá odděleně i ty, které spolu mnohdy těsně souvisí (může vést k nesprávnému závěru) multivariační metody {multivariable approach, MVA) zkoumá parametry komplexně; mění se současně několik parametrů; metodicky správnější : vyžaduje plán pokusů {experimental design, ED) plány pokusů způsob rozvržení experimentů tak, aby z co nejmenšího počtu bodů byla získána maximální informace a tedy co nejlepší popis průběhu funkce o více proměnných faktorový plán plně faktorový plán {full factorial experimental design, FED) : obsahuje všechny možné kombinace vybraných faktorů parametry: počet faktorů a počet úrovní každého faktoru počet faktorů(f) odpovídá počtu vstupních proměnných (počtu složek) počet úrovní (L) je počet hodnot každé vstupní proměnné {např počet měřených koncentrací) počet bodů faktorového plánu(celkový počet experimentů rí) n = Lf 100 tříhladinový dvoufaktorový plán (Z. = 3); 32 experimentů c c >a> E p (N *JÜ C C >0J E o proměnna 1 0-----0-----0 —0— —*— proměnná 1 (N C C >a> E o JZ7\ dvou h lad i nový dvoufaktorový plán (Z. = 2) nejjednodušší) 22 experimentů proměnná 1 dvouhladinový třífaktorový plán (Z. = 2) 23 experimentů redukovaný faktorový plán {fractional factorial experimental design, FrED) snižuje počet experimentů oproti FED (ten je někdy zbytně komplexní/pracný) : stále popisuje vliv každého parametru a kontroluje možné interakce : vhodný v případech drahých a časově náročných experimentů hvězdicový plán : další varianta plánu pokusů : může být FrED variantou faktorového plánu : tříhladinový dvoufaktorový faktorový plán => dvoufaktorový hvězdicový plán obsahuje (2xf+l) experimentů, kde f je počet rozměrů (složek) rozmístění bodů hvězdicového plánu je dáno polohou centrálního bodu ostatní body jsou rozmístěny symetricky kolem středu C C >a> E p o—9—o (N C C >a> E p proměnna 1 •^ proměnna 1 dvoufaktorový hvězdicový plán 2xf+l experimentů t řífa kto rovy hvězdicový plán 2xf+l experimentů 102 centrálne a necentralne kompoziční piany kombinace faktorového a hvězdicového plánu pokusů - komplexní hyperpiocha centrálně kompoziční plán - středy obou plánů shodné necentrálně kompoziční plán - středy shodné nejsou C C >a> E o proměnna 1 pětihladinový trifaktorový centrálně kompoziční plán 2f + 2xf+l pokusů aproximativní metody a algoritmy optimalizace - snaha „odhaliť' numericky funkci závislosti výstupu na optimalizovaných parametrech - aproximace black box : algoritmy nepopisují fyzikálně chemické vlastnosti, ale „jen" numericky zaznamenávají vztahy mezi proměnnými parciální metodou nejmenších čtverců {partial least squares, PLS) parciální metoda nejmenších čtverců - MVA, hodnoty pro všechny komponenty analyzované směsi počítány současně kanonická korelace {canonical correlation, CC) 104 umele nervové (neuronové) site {artificial neural networks, ANN) nápodoba biologického systému vzájemně propojených neuronů : procesory - neurony : způsob spojení- topologie sítě skryté vrstvy neuronů > c o 3 0) C s— c Q. 3 4-1 Ví neurony jsou sdružovaný do vrstev výstupy n-té vrstvy jsou přivedeny do každého neuronu ve vrstvě n + 1 první, vstupní vrstva - přijímá hodnoty pro zpracování poslední, výstupní vrstva - hodnoty odezvami celého ANN na změny podmínek vstupních parametrů počty neuronů ve vstupní a výstupní vrstvě jsou dány počtem vstupních a výstupních proměnných vnitřní, skryté vrstvy - počet závisí na složitosti aproximované funkce 105 RMS Q 2 - o -I- -I-------- 3 4 6 Spojení mezi neurony počet skrytých neuronů reprezentováno racionálním číslem - váhou spojen í {w) učení se předpovědi výstupních hodnot s minimální odchylkou hodnot před povezených ANN od hodnot experimentálních - opakovaným nastavováním číselných vstupů transformační funkce a sledování výstupů na funkční (reálnou) hodnotu odchylka - úplná suma čtverců {total sum ofsquaresfJSS) součet čtverců rozdílů před povezených a vstupních hodnot n TSS=l(z.-OU7[)2 i=l zx - hodnota výstupní proměnné z pro danou trojici {x/ y z), OUTx {output) -její před povezená hodnota, n - počet prvků trénovací sady každý neuron (kromě vstupních) sčítá hodnoty z předchozí vrstvy a násobí je vahou spojení w\ NET^ = Z {INPX * wx) +BIASX INPX - hodnota vstupu {input), wx - hodnota příslušné váhy a BIASX -hodnota prahu {bias), která je tzv. prahovým parametrem a je nezbytná pro správné nastavení hodnoty neuronu NET^ a pro celý výkon sítě 7V£7j - neuron j v neuronové síti OUT-x - transformace součtu NET^ {output) OUTx = 1 / ( 1 + e ~NETí) sada trénovací/učící- n sad parametrů určených plánem pokusů testovací- nejméně 3 sady parametrů uvnitř hranic daných plánem verifikační- nejméně 3 sady parametrů v hranicích daných plánem (i hranice sami) 107 analytické soupravy v laboratorní medicíně analytické sety/kity předr. 1960- analytická činidla připravována v klinických laboratořích dnes- analytické přípravky ve formě mikročipů určené pro speciální analytické přístroje již nelze v běžné laboratoři vyrábět vůbec požadavky na analytickou soupravu připravena k okamžitému použití {ready-for-use) jednostupňová metoda -jeden pracovní roztok dvoustupňová metoda - dva pracovní roztoky; enzymová stanovení stabilní alespoň 12, ale nejlépe až 24 měsíců : jednotlivé činidlo po otevření při 2 - 8 °C stabilní týden 108 metoda s rychlou analýzu - signál, nejčastěji absorbance, do 5 minut, kinetické měření v intervalu nejvýše desítek sekund metoda bez úprav vzorku - deproteinace, mineralizace, zkoncentrování obsahu analytu apod příprava analytické soupravy výrobní postup - technologický reglement : popis všech výrobních, kontrolních a dalších operací formou standardního operačního postupu výroba analytických souprav ie organizována podobně jako výroba léčiv kapalná činidla príprava: väzením (vcetne vody; presnejší) nádoby: skleněné nebo plastové, objem od 10 do 200 ml stabilní - nelouhovatelne, nepodtékající, neprostupné pro plyny (oxidace, únik ochranného inertního plynu) : nízkotlaký PE, PP, PET (polypropylentereftalát) aj\ plnění: pruplach nádoby inertním plynem, dávkování čerpadlem, bakteriální filtry (mikrofiltrace), štítkování (čárový kód) 109 pevná činidla příprava: navážka pevné směsi do obalu, pevná směs se tabletuje a tablety se zatavují (blistry) : mlýnky, míchací a homogenizační zařízení, tabletovací stroje, granulátory; za snížené vlhkosti vzduchu (< 20 %) choulostivá činidla (enzymy, bílkoviny) - lyofilizáty : lyofilizace {freeze drying, mrazová sublimace) - odstranění vody sublimací v hlubokém vakuu ze zmrazeného vodného roztoku produktu; voda kondenzuje v chladiči, který má proti produktu podstatně nižší teplotu (vyšší tepelný spád) lyofilizační houba - látky umožňující snadnější proces (bílkoviny, deriváty rozpustné celulózy apod.) fotochemický laminát PET kompletace soupravy : poloautomaticky, na pásu ^^^ — -'£_# r- 'i ' 1.1 3. elektrochemický vnejsi obal- finální etiketa skladování: pokojová teplota nebo v chlazených boxech adhezivum reakční složka nosič (PC) vod. inkoust reakční ploška nosič (PET) 110 soupravy pro suchou chemii diagnostický proužek reakční zóna - na plastovém proužku impregnace: koncentrované, kapalné analytické činidlo nasáté do nasákavého materiálu; fixace navařením síťky z plastu nasákavá podložka - definované vlastnosti (gramáž, tj. hmotnost v g/m2 a nasákavost pro kapaliny) => nasákne téměř stejné množství roztoku činidla uskladnění: vysoušedlo (silikagel/molekulové síto) obsah analytické soupravy název soupravy : analyt; princip jeho stanovení : skladovací podmínky, doba exspirace, počet analýz : údaje o jedech, hořlavinách a žíravinách pracovní návod : princip soupravy (i chemickými rovnicemi), odkazy (lit. a patent.), složení činidel, složení reakční/inkubační směsi, postup jejich přípravy, uchovávání a stabilita : referenční hodnoty analytu, schéma pracovního postupu, doporučené kalibrační a kontrolní materiály, poznámky o vzorku a k bezpečnosti práce m obsah analytu ve vzorku analytické výsledky způsob jejich vyjadřování 1 původně: hmotnost, popř. aktivita na objem (v biologické tekutině) g a mg/dl, jinak též gramprocenta (g%) a miligramprocenta (mg%) 1977: soustava SI hmotnost (g, mg) => látkové množství (mol) koncentrace - mol/l (analyt s přesně definovanou molekulovou hmotností) enzymy, koncentrace katalytické aktivity místo koncentrace enzymu katalytická aktivita 1 katal - množství enzymu, které rozloží 1 mol enzymového substrátu za 1 s za definovaných reakčních podmínek koncentrace katalytické aktivity- katalytická aktivita vztažená na objem obsah katalytické aktivity- katalytická aktivita vztažená na hmotnost mezinárodní jednotka U (international unit, IU) - množství enzymu, které rozloží za 1 min 1 pmol enzymového substrátu za daných podmínek 1 U = 1 umol/min = 16.67 nmol/s = 16.67 nkat 112 hmotnostní koncentrace enzymů/proteinů {mass concentration) : stanovení v imunodiagnostice a u enzymu CK :: koncentraci vyjadřujeme jako mg či pg proteinu/l počet elementů v biologických tekutinách (buněk, částic, různých útvarů) :: početní koncentrace, tj. počet částic v litru močový sediment - arbitrárni početní koncentrace (arbitrárni jednotka) : zjednodušení při vyjadřování počtu částic (elementů) na definovaný (dohodnutý) objem po odstředění vzorku moče se zjistí počty jednotlivých elementů v zorném poli mikroskopu v odečítací komůrce s definovaným objemem (Biirkerova komůrka) jiné užití: analýzy některých testů v moči (např. průkaz bílkoviny), v mozkomíšním moku, ve stolici (obsah železa) apod IFCC a IUPAC: systém zkratek pro vyjadřování analytického nálezu pro tyto typy vzorků nad rámec SI 113 interpretace výsledku analýzy analyt - součást vzorku, kterou stanovujeme {kreatinin v séru a v moči) : stanovení s určitou přesností v závislosti na obsahu, stabilitě, metodě stanovení apod analytická metoda/postup - metoda stanovení analytu {Jaffého reakce s kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí) výsledek analýzy - hodnota ve vztahu k diagnóze (kreatininová clearance) test na určitou funkci - testovaný stav ve vztahu k diagnóze {glomerularni filtrace) index - diagnostické poměry obsahu analytu analytická variabilita- preanalytická i analytická fáze biologická variabilita (BV) populace - komplexní charakterizace rozptylu výsledků biochemických vyšetření; suma intra- a interindividuálních variabilit vyjádření: variační koeficient v procentech (ČV) stanovení: analytické postupy, které mají CV < cca 1/3 intervalu BV 114 dohodnuté odchylky od cílové hodnoty analytu {target value, TV) - místo BV cílová hodnota : průměrná hodnota všech výsledků souboru po jejich záznamu : průměr stanovený definitivní nebo referenční metodou, v případech, že definitivní ani referenční metoda zatím nejsou stanoveny, může být užita srovnávací metoda souvislost mezi analytickým nálezem a stavem pacienta zdravý (normální) nebo má analyt vybočující (patologické) hodnoty pro běžné analyty zpracovány tzv. referenční hodnoty (dříve normální či fyziologické hodnoty) | - - ™UZI : referenční hodnoty referenčního jedince - donora Sri ľ : referenční skupiny "M I 111 n ml I íTrh : referenční populace 0.2 0.8 1.4 0.2 0.8 1.4 aktivita ALP získávání: analýzou vzorků osob, které se hodnotí jako zdravé referenční (fyziologický) interval - hodnoty laboratorního testu, mezi nimiž leží většina hodnot získaná měřením referenční populace 115 analytické soubory funkční soubory jednotlivých analytických metod klinicko-biochemické požadavky lékařů : jaterní soubor, soubor pro tukový metabolizmus, soubor pro poruchy glukózové tolerance aj.) jiné důvody- organizační, bezpečnostní, ekonomické akutní í statunová) analýza stanovení jednoho nebo skupiny hlavních analytů co nejdříve a nonstop glukóza (diabetes), kreatinin nebo močovina (ledviny), bilirubin a aminotransferáza ALT (jaterní testy), kreatinkináza a troponin (srdce), a-amyláza či lipáza (slinivka), acidobazicka rovnováha krve, základní toxikologické vyšetření a základní vyšetření moči základní biochemické vyšetření základní (screeningové) vyšetření analytů charakterizujících činnost hlavních tělesných orgánů a funkcí celkovou bílkovinu, bilirubin, kreatinin, močovinu, glukózu, cholesterol, kyselinu močovou, ALP, aminotransferázy ALT a AST, popř. GMT nebo CK - 1fí 61 základní hematolooické vyšetření stanovení krevního obrazu hemoglobin, erytrocyty, hematokrit, leukocyty, trombocyty, retikulocyty, osmotickou rezistenci erytrocytu, bazofilní tečkování erytrocytu apod. organizační dělení analýz do souborů imunochemická vyšetření imunoelektroforéza sérové bílkoviny, al-fetoprotein, imunoglobuliny A, G, M, prealbumin, al-antitrypsin, a2-makroglobulin, transferin, ceruloplasmin, CRP, prostatický specifický antigen aj. radioimunoanalvtická vyšetření thyroxin, trijodtyronin, thyreotropin, luteinizační hormon, folikuly stimulujícího hormonu, Prolaktin, choriogonadotropin, estradiol, progesteron aj. vyšetřenímozkomíšního moku chemické stanovení analytů + různé speciální testy 117 základní vyšetření moči pH, dusitany, bílkovina, glukóza, bilirubin, urobilinogen, ketolátky osmolalita, erytrocyty a hemoglobin, leukocyty, vyšetření močového sedimentu doplňkové analýzy morfologická analýza močového sedimentu (epitelie, válce granulované, voskové, epitelové, erytrocytární, leukocytové, žlučové, pseudoválce, spermie a mikroby (kvasinky, bakterie, trichomonady, plísně) drug monitoring kontrola hladiny těch léčiv, která jsou ve větších dávkách toxická a hrozí jejich predávkovaní, nebo protože mají lidé na některá léčiva individuální toleranci speciální analyzátory nejčastěji monitorovanými léčivy - digoxin, fenytoin, fenobarbital, kyselina valproová, diazepam, theofylin, gentamicin, tobramicin, methotrexat, cyklosporin a dal. drogy {drugs of abuse) instrumentální metody (HPLC, GC, MS, CZE apod.) alkohol, amphetamin, barbiturany, benzodiazepiny, cannabinoidy, kokain, methadon, opiáty, antidepresiva, anabolické steroidy aj vybrané instrumentální analytické metody v laboratorní medicíně spektrometrické metody : UV-Vis, fluorimetrie : AAS, AES : hmotnostní spektrometrie elektrochemické : coulometrie, potenciometrie separační metody : chromatoqrafie (kapalinová, plynová) : elektroforeza (gelová, kapilární) 119 vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) princip separace dle různých rozdělovačích konstant analytů v systému dvou fází (pevná-kapalná) rozdělovači poměr D D = Cs /CM C^ - koncentrace analytu na stacionární fázi, CM - koncentrace ve fázi mobilní retenční čas tR : čas, za který analyt projde kolonou mrtvý (nulový) čas tM : čas, za který projde kolonou samotná mobilní fáze, nebo neinteragující látky (jejich tR = tM) sorpce - analyt z mobilní fáze se zachytí na fázi stacionární desorpce - obrácený proces chromatografie - dynamická rovnováha sorpce a desorpce analytu čtyři hlavní sorpční mechanizmy: adsorpce, rozdělení (obdoba extrakce), iontovou výměnu na iontoměničích a stericke vylučování (stacionární fáze s kontrolovanou porozitu, dělení látek dle jejich velikosti a molekulové hmotnosti) 120 adsorpce - povrchový efekt působený elektrostatickými interakcemi (vodíkové můstky, vazba dipól-dipól a vazba dipól-indukovaný dipól) analyty soutěží s mobilní fází o limitovaný počet vazebných míst na povrchu adsorbentu chromatografické dělení látky - symetrický neboli gaussovský koncentrační profil ve směru pohybu mobilní fáze, tzv. zóny čili píky kvalita chromatoqrafického dělení : účinnost kolony počet teoretických pater N /V = 5.54* ( ŕR / MO2 W- šířka píku v polovině jeho výšky výškový ekvivalent teoretického patra H H-LjN L - délka kolony vysoké H => účinné dělení multikomponentních směsí látek rozlišeníRs Rs = 2*ArR/ {W1 + W2) | : oddělení dvou sousedních píku Rs > 1.5 uspokojující, Rs = 1.5 je tzv. dělení na základní linii laminarni tok kapaliny cas 121 stacionární fáze f SF) chemicky modifikované silikagely nebo různé kopolymery silikagel Si-OH - polární a slabě kyselý : modifikace alkylchlorsilany s délkou alifatického uhlíkového řetězce 1 až 18; hydrolyticky stálé siloxany s typickými vazbami Si-O-Si-C : nejužívanější fáze - oktadecylsiloxany (ODS čili C18); tzv. reverzní fáze mobilní fáze f MF) dle polarity: /7-hexan, cyklohexan, metylbenzen, chlorované uhlovodíky, tetrahydrofuran, aceton, acetonitril, /so-propanol, etanol, metanol, voda... jednotlivě nebo jejich mísitelné směsi MF teče pod tlakem až 40 MPa, rychlostí toku asi 0.05 - 2.00 ml/min reverzní HPLC - směs metanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo s roztokem pufru velmi důležité pH vodné složky - ionizované formy látek menší afinitu k C18 122 kolony pro H PLC konvenční- nerezová ocel, délka 3 do 25 cm, vnitřní průměr 3-5 mm mikrokolony- délka 5-50 cm, vnitřní průměr 0.5 - 2 mm kapilární HPLC detekce signálu : v MF po eluci z kolony fotometry UV-Vis (PDA/DAD), fluorimetry, refraktometry, elektrochemické detektory, nově hmotnostní spektrometrie citlivost HPLC detektorů : refraktometrické a vodivostní detektory 5.10-7 g/cm3 : fotometrické detektory 10~10 g/cm3 : fluorimetrické a ampérometrické detektory do 10~12g/cm3 123 syndrom fragilního chromozómu X příčina vrozené mentálníretardace (2. nejčastější po Downově chorobě) projevy: obličejová dysmorfie, velké uši, velká tvář s výraznou bradou a čelistí poruchy chování: stereotyp, špatná komunikace, hyperaktivita a špatná prostorová orientace dere/ctnígen FMR 1 na chromozómu X {fragile X mental retardation gene 1) mutace: zmnožení trinukleotidových repeticí (SNP, single nucleotide polymorphism) : Fra X - zmnožení repetice CGG a následná metylace cytosinu : metylace cytosinu v sekvenci CGG => potlačení exprese genu => projevy Fra X podle obsahu deoxycytidinmonofosfátu (dCMP) a jeho metylovaneho derivátu (mdCMP) a podle počtu repeticí CGG může mít gen FMR 1 tři stadia: stav FRM 1 dCMP[%] mdCMP [%] počet CGG normální 70 - 100 0-30 6-53 premutační 50-70 30-50 < 200 mutační 10-50 50-90 > 200 124 stanovení poměru obsahu dCMP/mdCMP diagnostika Fra X syndromu NH, N^VN buňka => DNA endonukleáza Msply nukleOtidtrífOSfáty exonukleázallly nukleotidmonofosfátv (mdCMP / dCMP)! i/ä (mdCMP / dCMP)2 %mdCMP = mdCMP / (mdCMP + dCMP) dAMP o ' HjfOj-O-CHj- dTMP HN^'^t-CH, 0=L ~N HjPOj-O-CHj OH OH o mdCMP má R = CH3 dGMP JL N dCMP o H T" \ HjPOj-O-CH ■ CH=-0-POJH3 ■OH HO- kontrolní poměry (mdCMP + dCMP) / dGMP = 1 dAMP / dTMP = 1 zlepšení citlivosti o řád UV-Vis => fluorescenční detekce derivace dansylchloridem < 70- E kompenzace kationtu pufru => Sternova elektrická dvojvrstva potenciálový gradient => hydratované kationty v pohybu => posun celého elektrolytu (EOF) => unáší ke katodě všechny přítomné látky (neutrální i ionty) rychlost EOF - t se t pH pufru a napětím; i s viskositou základní elektrolyt (vodivé medium) - pufr oji -*- EOF -*- EOF+N {background electrolyte, BE) 3—*■ K" : zásadní vliv na konstantní mobilitu dělených látek ■-------*- eof-a- H3N+-CH2-COOH (H2N-CH2-COOH H3N+-CH2-COO-) H2N-CH2-COO- 127 separace neutrálních látek - přidání povrchově aktivních látek do BE vytváření micel => uzavření neutrálních látek => nabité micely jsou separovány separace na základě jejich rozdílné rozpustnosti v micelách nebo na základě rozdílů v distribučních koeficientech analytů mezi vodnou a micelární fází detekce signálu : UV-Vis - citlivost 10"13 až 10"16 mol (10~5 až 10~8 mol/l) : ampérometrická detekce - 10-11 mol/l : laserem indukovaná fluorescence (LIF) - 10~14 až 10~16 mol/l :: derivatizace fluoroforem 128 PAGE - polyakrylamidová gelová elektroforeza migrace v polymerní matrici (agar, škrob, agaróza, polyakrylamid) : separace makromolekul provedení: izokratická, gradientova : denaturující (SDS; Lamm li) : nedenaturující ey °k protel^v - Oy SDS 1 -> 3 ■ !A -,.—2—, | 23.13 kb 9.42 kb 6.56 kb 4.36 kb 2.32 kb 2.03 kb proteiny . _ . Coomassie modř, stříbro, SYPRO rubínová, Cu2+, Zn2+ detekce: *.* barvení, denzitometrie SYBR ze|eňř ethjdjum bromJdř akridinová oranž 129 r aplikace CZE v laboratorní diagnostice metabolické poruchy : porušené metabolické dráhy (blokování, nepřítomnost enzymu /geneticky/) :: přítomnost produktů neúplného metabolizmu y moči a krvi stanovení obsahu purinů a pyrimidinů diagnostika xanthinurie a deficitu enzymu hypoxanthinfosforibosyltransferázy BE - borátový pufr 30 mmol/l o pH 10.2; hydrodynamické dávkování 10 s, separační napětí 15 kV, teplota 25 °C, UV-detekce při 260 nm o N N xanthin o o hypoxanthin o N V N ^N' N N- kyselina močová ir "o « u c (D .Q i_ O .Q (D c 1 C »ro +j > >> c o .£ + (D X o Q. o E - C C >« C (D ■™ .£ C C C ^ £ (D Ol (D >« 3 X .* .-.---------------------*H J\ ' 1 1 1 migrační čas [min] 130 hmotností spektrometrie (MS) : fyzikální metoda; určení molekulové nebo atomové hmotnosti analytu princip molekuly analytu se ionizují v plynné fázi; pak jsou rozděleny buď v prostoru nebo v čase podle poměru jejich hmotnosti a náboje {m/z) ionizace => hmotnostní analýza => detekce iontů ionizace - polem nebo vysokoenergetickými částicemi (elektron, foton, atom) měkká i/s. tvrdá ionizace hmotnostní analýza iontový zdroj magnet magnetický sektor detektor doby letu laser | extra kto r iontů iontová optika VA- v ionizační I komora I r I extra V I iont tiftrr letová trubice reflektron iontový detektor detektor 4f detekce iontů - systém dynod 131 tandemová MS sériové spřažení několika hmotnostních analyzátorů + sekundární ionizace- kolizní cela : první analyzátor rozdělí ionty dle m/z : selekce iontu o určitém m/z : sekundární ionizace-fragmentace : rozdělení fragmentů v druhém analyzátoru : detekce iontů fragmentů Val Lys Val Leu Gly Asp Val He Olu Val His Gly Lys _^ h2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 bS bl0 b11 bl2 ti Ü 0 l t l Hjc-c-w-c-c 0 kj ^12 yi1 yi0 y9 y8 y7 h y5 \ h \ yi analýza proteinů a nukleových kyselin MALDI-TOF MS {matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flighf) H H 0 í i I -N-C-C I H H 0 I I I H-C-I H L .N II M 0 N-C-C I H H 0 i I J Íi-C-C I R» H H 0 i I i tí-C-C H H O 1 i ■ N-C-C H H 0 I i i N-C-C i H H 0 l l l N-C-OOH E., aplikace MS v laboratorní diagnostice 80 -, MALDI PSD TOF rozpad za zdrojem {post-source decay) identifikace hormonu tandemovou MS sP 60 O* (O Ň 40 C 0) 20 - [M+H]+ b ^ a. _LJL-L jJJL__jUuL/Jw*»*»n a. .4 : ml a. iMii^^jyiu^i^ y7 ^ ■ b y a wAw^^kJwÍvW* ü+U W**M*~,*)4i U T T T T 200 400 600 800 1000 , 1200 m/z an, bn n = 1 pGlu-His- 8 -Trp- -Ser- -Tyr- ■Gly- ■Leu- -Arg- ■Pro- -Gly-NH; 8 1 =n yn lidský hormon uvolňující luteinizační hormon (LHRH) 133 imunochemická analýza v praxi klinické imunodiagnostiky imunitní systém (IS) - informační soustava : zodpovídá za udržení identity a integrity jedince a jeho individuality složky: lymfocyty, fagocyty, komplement, interferony a protilátky (Ab) lokalizace: v krevním a lymfatickém oběhu funkce: tolerují vlastní struktury, cizí označují a odstraňují : rozpoznání vlastního od cizího : likvidace cizího: mikroorganizmy, cizí buňky, tkáně, cizorodé bílkoviny a antigenně působící látky interakce antigen + protilátka : analytické využití imunitního systému - afinitní (specifická) interakce :: nekoválentn í :: reverzibilní :: variabilní antigen {antibodygenerator) (Ag) : obsahuje determinanty (epitopy) => vyvolávají imunitní reakci fimunoqen) :: makromolekula (> 8 kDa) :: makromolekulami nosič + hapten bakteriální toxiny, lipopolysacharidy, aglutininy, revmatoidní faktor, endotoxiny, alergeny protilátka {antibody) (Ab) : rozeznávají determinanty => odpověď imunitního systému na Aq : specifická Ab reaguje s určitým Ag - označí jej : váží se na determinanty vazebným místem (paratopem) :: imunizace - vystavení IS novému Ag => výroba nových Ab monoklonální, polyklonální Ab - rovnocennost epitopů křížové reakce Ab - interakce jednoho paratopu s podobnými epitopy 135 imunoglobuliny IgA (15 - 20%) - na povrchu sliznic z exokrinních žláz IgD - aktivace B-buněk IgE - u alergií; dvojvazný: alergen-IgE-glykoprotein IgG (75%) IgM (3 - 10%) - intravaskulární prostor protilátka - detail struktury antigen vázán na Fa b fragment antigen I lehký (L) řetězec I těžký (H) vazné místo A. sacharid disulfidické můstky j Fc fragment 136 sledování interakce : přímé - precipitace, rozptyl světla : nepřímé - aglutinace, vazba komplementu : značením - imunostanovení :: homogenní :: heterogenní ::: přímé, kompetitivní ::: nepřímé, sendvičové imunoanalýza detekce u přímých a nepřímých imunoanalýz : vizuální : optická (nefelometrie, turbidimetrie) : hmotnostně-spektrometrická prostředí : roztoky : gel (imunodifúze) : imobilizace a jejich kombinace :: tkáně u imunoanalýz se značením : spektrofotometrická, fluorimetrická : radiometrická : elektrochemická 137 prima imunoanalvza - precipitacni reakce bivalentní Ab (precipitin), makromolekulami Ag (precipitinogen), 1:1 precipitát - viditelná sraženina vzniklá přímo z molekul disaqreqacni latky - braní precipitaci .-. 2.0 Ol ■=■ 1.5 H < U) CQ 10 ? os -y < U) íO 00 / / s v B 0.0 0^ 0.4 OG OJ BSA [mg] precipitační křivka korpuskulárni ŕ^^ / A9 --------> /korp.V£ nepřímá imunoanalvza - aqlutinační reakce polyvalentní Ab (aglutinin), korpuskulárni Ag (aglutinogen) aglutinát - viditelná sraženina vzniklá z makroskopických částic korpuskulace Ag: imobilizace na korpuskuli (makroskopickou částici) : hemaglutinace, cytaglutinace, latex; systém komplementu 138 kvalitativní metody prstencová p. - prstenec precipitatu na rozhraní fází s Ag a s Ab sklíčková p. - „kapkovacľ imunitní reakce N E parafín roztok Ag přeci pitát agaróza s Ab Oudinova metoda - dvě vrstvy gelu, s Ab nebo s Ag Oakley-Fulthorpova metoda - dva gely, s Ab nebo s Ag; více [AbAg] plazma Ouchterlonyho metoda : dvojitá radiální imunodifúze :: koncentrický systém jamek Ab vprostřed Ag okolo Ag . 1:64 Ab A9 Ag . 1:2 . 1:32 V^L^/ A9 1:4 • • Ag 1:16 Ag 1:8 neidentické album částečně identické anti-albumin anti-fibrinogen DNP-Ibumin nti-DNP + anti-albumin IgGK identické anti-Y + anti-K metoda dle Williamse a Grabara : imunoelektroforeza anoda gel s Ab precipitat start katoda :: startovací jamky s Ag, podélná jamka s volně difundujícím Ab protisměrná imunoelektroforeza : na opačných koncích Ab a Ag, precipitační proužky 140 hemaqlutinacne inhibiční test f HIT) vzorek X £ X Hu-IgG Gl epitop - anti Hu-IgG + ^ Gl epitop + s**V+ vzorek Hu-IgG jiný epitop + JL anti Hu-IgG _i_ Gl epitop ~ O; žádná aglutinace pozitivní- krev sedimentuje přítomnost Ab => žádná aglutinace aglutinace! negativní - aglutinované erytrocyty nepřítomnost Ab => aglutinace indikátory nebo č.krv. Rh+ č.krv. s Hu-IgG vzorek Jř £ Hu-IgG "* nebo matka isl A Coombsův test (CD : odhalení protilátek proti červeným krvinkám stanovení Agľ pomocí nekompletního Ab' primární komplex: Ag^b' sekundární komplex: Ag1AbiAg2 nepřímý CT krokl anti Hu-IgG dítě Coombsův reagent přímý CT + vzorek A + ľŕ + A %3 O krok 2 Jo^ + A kvantitativní metody vážková p. - vážení p., nefelometrie, turbidimetrie ___ ©^ -— o-— o~~ f ; Ab v gelu Ag 1.0 mg 2.5 mg 10.0 mg d Ag vzorek průměr [mm2] kalibrační závislost metoda Manciniové : radiální imunodifúze :: gel obsahuje Ab :: řada jamek ::: standardy (kalibrace) + vzorek metoda dle Laurela : raketová, spojitá, křížová IELFO; elektroimunodifúze :: gel obsahuje Ab, startovací jamky s Ag; tvar plamene - semikvantita 15 mg/ml metoda dle Clarka a Freemana - 2D IELFO rL :: l.D dělí Ag, 2.D interakce s Ab v gelu v úhlu 90° j1 start ..... * u gel s AB tandemová IELFO :: obdoba 2D IELFO se standardními množstvími Ag <+) 1. rozměr (+) 3 N -3 T 0< -t (-) I-l 142 imunoanaivza se značenými reaktantv imunostanovení, imunoesej {immunoassay)) neutralizace séra univalentní Ab, rozpustný Ag : vhodné Ab - monoklonální : vhodná značka (Ab, Ag) - fluorofor, chromofor, radioaktivní izotop, enzym : separační systém - imobilizace : detekce : standard či kontrolní stanovení jednoduchá imunoanalýza : imobilizace Ag : známé množství Ab : vazba Ab na Ag : určením obsahu Ag :: přímo - značená Abt :: nepřímo - značenou Ab2 proti Abt r •____• stWrr koncentrace Ag i značená Ab O substrát Ag + Ab* ^ [AgAb*] výhody: nízká spotřeba Ab nevýhody: imobilizace vzorku, značená Ab, nízká specifita, nízká selektivita (jen u přímé) kompetitivni imunoanalyza stanovení s omezeným množstvím reagentu : omezený počet vazných míst na Ab : neznámé množství Ag : soutěž o vazná místa se známým množstvím značeného Ag :: určením poměru značeného Ag a to buď volného nebo vázaného => neznámého Ag m<% yÍ^y ffÝf IffÝf koncentrace • Ag f Ab 4* značená Ab O substrát 2Ab + Ag + Ag* ^ [AbAg] + [AbAg*] výhody: nízká spotřeba Ab nevýhody: nízká specifita, nízká selektivita 145 sendvičová imunoanalýza, imunometrie stanovení s nadbytkem reagentu : dvě a více Ab zaručují specifitu imunoanalýzy : teoretický limit detekce je jedna molekula analytu :: nevázaná značená Ab může být použita ke kvantifikaci analytu YYYY • Ag Y Ab A značená Ab O substrát x Abt + y Ag -> y [A^Ag] + (x-y) Abt z Ab2* + y [AbiAg] -> y [AbiAg]-Ab2* + (z-y) Ab2* výhody: zvýšená citlivost, zvýšená specifita nevýhody: značené Ab, plýtvání Ab YtYÝ c Ol "55 koncentrace FIA - fluorescenční imunostanovení fluorescent immunoassay značeni Ab ci Ag fluroforem provedení homogenní : A fluorescenčních vlastností značené Ab/Ag po vzniku [AbAg] heterogenní : fluorescence značené Ab/Ag po vymytí nevázaného používané fluorofory: fluorescein, izothiokyanat fluoresceinu (FITC), rhodamin, ombelliferon, 8-anilino-l-naftalenesulfonát (ANS), cheláty lanthanoidů (Eu, Tb, Sm) výhody nevýhody : specifita : pozadí (zhášení) : citlivost : instrumentálně náročné : rozměr sondy : omezený výběr různých značek chemoluminiscence L LIA - luminiscenční imunostanovení luminescence immunoassay estery akridinia - nepotřebují katalýzu CO-0-3 -ROH CO-O CH. r CH. -CC, I +tn CH, luminol, izoluminol - potřebuje peroxid vodíku; peroxidáza R, O R NH I NH POD, H2Q^ R pH (10-11; co-o' CO-O" + N2 + hv + H20 O enzymaticky indukovaná složka: 1,2-dioxetan uscence 0-0 y CH» ň I 0PO(OH^ ♦V .Hŕ0| ď&-&-\* +■ hv 148 5 elektrochemoluminiscence NHS ester Ru(bpy) 2+ kotvení na magnetickém nosiči oxidace značky na Pt či Au eldě při 2 V + TPA (tripropylamin) v pufru - regenerace bioluminiscence, luciferin/luciferaza HO N N^COOH ATP, Mg2+, 02 HO --------------------^ luciferáza i—^hlA-co N N I i 0-0 -CO, HO N N^O výhody : poměr S/N : citlivost : rozměr sondy nevýhody : instrumetální náročnost 149 RIA- radioizotopové imunostanovení radioiosotopic immunoassay značení Ab či Ag radioizotopem (nestabilním / radioktivním izotopem) provedení : heterogenní, kompetitivní používané izotopy: 125I - proteinové Ag; 60 dní; 14C - hapteny; 3H - steroidní hormony další izotopy - 14C, 75Se, 57Co detekce: dle typu záření- a a ß {scintilator) či y {krystalovýpočítač) výhody nevýhody : pružnost : toxicita : citlivost : skladovatelnost : rozměr sondy : likvidace odpadu značeni Ab ci Ag enzymem EIA - enzymové imunostanovení enzyme immunoassay provedení homogenní : kompetitivní Ab + Ag-E + Ag -^ [Ab*Ag-E] + Ag-E + Ag heterogenní : kompetitivní : přímá/nepřímá : sendvičová používane enzymy: alk. fosfataza, peroxidaza, lysozym, galaktosidaza, glukozooxidaza, glukozodehydrogenaza, malatdehydrogenaza výhody nevýhody : různorodost : nestabilita : víceúčelovost : rozměr značky : zesílení signálu : heterogenní 151 imunodiagnostika imunoanalyzátory : plně automatizované imunoanalýzy : většinou na bázi heterogenního sendvičového imunostanovení (EIA, FIA) :: každý výrobce má vlastní modifikaci postupu (patenty) : relativně nízká cena (masová produkce Ab) imunoproužky : specializované jednoúčelové imunoanalýzy na jedno použití : většinou na bázi heterogenního sendvičového imunostanovení (EIA) : relativně nízká cena (masová produkce Ab) vzorek * tok vzorku uvolňovací ploška nasákavá membrána 7*- vývod pro čtečku membrána odsávací ploška - pro separaci plazmy mylarová | substrát elektroda kostra imunoreakční zóna wx AÍ1II 153 měřiče pro akutní analýzy na místě (POCT) na bázi imunoanalýzy : specializované jedno- i víceúčelové miniimunoanalyzatory : většinou na bázi heterogenního sendvičového imunostanovení (EIA) : vycházejí z použití imunoproužků 49 i mu noci py další miniaturizace klasické výhody čipové technologie sekundární Ab odpad pufr mrizka s imobilizovanými Ag : OptoLabCard+Skinpatch :: lab-on-foil => The SmartBioPhone™ imunohistochemie imunocytochemie ^ aplikace imunologických metod při studiu tkání a izolovaných buněk : detekce nádorů a patogenních změn 4-8 um tloušťky kryostatické řezy nejčastěji značení fluroforem, kovem a enzymem : přímá, nepřímá, nepřímá třístupňová (Ab-„můstek") - zesilování signálu + chromogenní substrát r Ab,* ALPáza + chromogenní substrát —* suDstrat/- T*%_ Ab2 T^_ Abi £- ~* j- ^ metoda BSPOX B - biotin, S - streptavidin, POX - peroxidáza metoda APAAP 156 aplikace imunologických metod při studiu buněk IS : detekce patogenních změn v IS nejčastěji značení Ab s fluroforem : průtoková cytometrie rozptyl buněčná suspenze fotonásobič barevné filtry rozptyl v přímém směru fotosenzitivní dioda separace buněk kontrola intenzita fluorescence antiCD4-Ab* o O o E *3 "O O a. I granulocyty ™»«V«T --- lymfocyty rozptyl v primem smeru 157 analýza proteinů v klinické biochemii VII, primárni struktura struktura proteinů sekundárni struktura . ß-skladany list terciami struktura kvartem í struktura primárni struktura - poradí aminokyselin (sekvence) sekundární struktura - samovolný vznik terciární struktura - 3D (indukované chaperoniny) kvartérní struktura - supra komplexy 158 specifická - stanovení určitého proteinu nespecifická - stanovení celkové bílkoviny nebo jednoho proteinu nespecifická stanovení Kjeldahlova metoda [chjeldálova] Polypeptid => amoniak, obsah p. se definuje dle organického dusíku peptide. ^ ^v * ^>V^ % vzorek se mineralizuje koncentrovanou kyselinou sírovou v ^V*t* 4 přítomnosti katalyzátoru; aminový dusík => amonné ionty amonné ionty se převedou na amoniak zahřátím a destilací se zachytí ve sběrné nádobě, kde se opět přemění na amonné ionty amonné ionty se stanoví neutralizační titrací 159 spektrofotometrické stanovení (SPEFO) 205; 260 a 280 nm peptidová vazba; aromatické struktury absorbanci ovlivňují : sekundární, terciární i kvartem í struktury : faktory jako pH, iontová síla atp. (ne)známý vzorek : kalibrace na BSA => extinkční koeficient při 205 anebo 280 nm neznámý vzorek s možnou kontaminací DNA : měření při 260 a 280 nm : koncentrace (mg/ml) = (1.55 x A280) - (0.76 x A260) neinvazivní (nespotřebovává vzorek) : nepřesné, snadné falešně pozitivní výsledky - kontaminace SPEFO - biuretová metoda : invazivní, zdlouhavé, velká spotřeba vzorku biuretove činidlo: 25 g vínanu sodno-draselného 0.75 g síranu meďnatého 5H20 1.25 g jodidu draselného :: vsev 100 ml 0.2 M NaOH biuretove činidlo glycin : vzorek 1-10 mg/ml proteinu : kalibrace na BSA : přidáme biuretove činidlo, rozmícháme a necháme stát 20 min : absorbanci měříme při 550 nm / \ NH2 N-H « vínan - rozpustnost iontů mědi v alk. # Jodid - katalýza redukce Cu2+ => Cu1+ ??? chylózní sérum - falešně pozitivní výsledky reagují i tyto skupiny -CONH2, -C(NH)(NH2)- a -CSNH2 161 o c / \ Nil? ,NH3 AT °^c\ NH3 0=C<" NII-. r H 2- . 0 C c=o 1 1 UN NH S \ HN UH 1 1 ?H» 1 L ii o c CH—N bílek _ 2- :h—díí) n—co- CO— N N_CH_ 2 Na Ô" CH----------C=0 Lfe SPEFO - Lowryho metoda : variace na biuretovou metodu v alkalickém prostředí s meďnatými ionty : po přidání Folin-Ciocälteu reagentu se tento váže na protein, je zvolna redukován na heteropolymolybdenanovou modř pomocí Cu2+-katalyzované oxidace aromatických kyselin; barva se mění ze žluté na modrou : 100 [ji vzorku + 1.0 ml Lowryho reagentu (alkalické prostředí CuS04) : inkubace 30 min při 25 °C : + 100 ml Folin-Ciocälteuova reagentu : inkubace 30 min při 25 °C : měříme při 595 nm Folin-Ciocalteu 750 ml vody; 100 g Na2W04; 25 g Na2MoO4;50 ml 85% kys. fosforečné; 100 ml konc. HCl; 150 g Li2S04 + pár kapek Br2 více rozdílů mezi proteiny, mnohdy nestačí jen kalibrace na BSA interferenty: barbital, CAPS, CsCI2, citronan, cystein, dietanolamin, dithiothreitol, EDTA, EGTA, HEPES, merkaptoetanol, Nonidet P-40, fenol, polyvinylpyrrolidon, deoxycholan sodný, salicylan sodný, thimerosol, Tricin, TRIS a Triton X-100 162 SPEFO - modifikovaná/Smith-Lowryho metoda : provedení podobné jako u Lowryho metody : absorbance při 562 nm : citlivost nezvýšena, ale snížen vliv kontaminantu velmi citlivá metoda na přesné pipetování mechanizmus o o n n C-ONa C-ONa kyselina bicinchoninová - BCA 1. protein + Cu2+- OH- ■*-Cu1+ BCA + Cu coo- coo- BCA-Cu1+ komplex 163 SPEFO - metoda Bradfordové A absorbance Coomassie Brilliant Blue G-250 po vazbě na protein : kalibrace na BSA (1 mg/ml) : absorbance při 595 nm bez inkubace není citlivé na interferenty, vyjma vysokých konc. tenzidů významný rozdíl abs. hodnot protein od proteinu => vhodná kalibrace! jiné modifikace SPEFO metody H3C n'^Y^Y'S03M koloidní zlato *>^<& ^w\4 L V 69943 Í 8^6 47 | ° L.1098.74 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 998.59 Edmanova sekvenace separace fenylthiohydantoinových derivátů : iontově párová H PLC : RP-HPLC : CZE jiné metody identifikace - bod tání srovnání Edman vs MS výhody MS - malá spotřeba vzorku předseparace na PAGE výhody ES - automatizovatelné rutinní metoda 167 / \_N-C-S fenylizothiokyanát + O O I I HjN-CH — C — NH — CH — C — I R, Bz N-terminus peptidu ___ H i N-N-C-S O O \=/ I I i H-N— CH — C— NH-CH-C- Fti H, fenylthiokarbamoylový derivát peptidového řetězce 2H* 1 H O a I I N — C— s + h3n—ch—c — H- A r, peptidový řetězec kratší o jednu jednotku O u—c — s. i \ C NH 1 CK fenylthiohydantoinový derivát R± B qelová elektroforeza (PAGE - polyakrylamidova gelová elfa) : separace v gelu + vhodné barvení denaturující PAGE - SDS normalizuje náboj, dělení jen podle M :: denzitometrie druhy barviv : barvení stříbrem - nekvantitativní : modř Coomassie Brilliant- sem i kvantitativní : SYPRO rubínová - kvantitativní hmotnostní spektrometrie : pomocí izotopově značeného vnitřního standardu kapilární elektroforeza H PLC : UV detekce- nevhodná : fluorescenční detekce- před kolonová derivatizace danzylchlorid, o-ftaldialdehyd 168 enzymová analýza enzym ~ biokatalyzátor holoenzym = koenzym (kofaktor) + apoenzym formy jednoho enzymu - izoenzymy E + S <—> E-S* <--► ES <--► E-X* <--► EP <--► E-P* <--► E + P .2 I E-X* E + S EP E + P reakční souřadnice aktivní místo f* enzym ö-O'-ä substrát (S) se váže do aktivního centra =^> komplex enzym-substrát [ES] [ES] => P; enzym regeneruje vazba ES - vysoce specifická; závisí na AA složení a kofaktorech účinnost enzymu - katalytická aktivita; koncentrace katalytické aktivity 169 inhibice enzymové reakce allosterícke enzymy nekompetitivní kompetitivní inhibitory : specifické a nespecifické : reverzibilní a ireverzibilní aktivované enzymové reakce & ^ $5 -' inhibitor \H/ akompetitivní : kationty: Ca2+, Mg2+, Zn2+... : anionty: Cl~ : organické látky: metabolické meziprodukty a hormony 170 aktivní místo substrát mechanizmus enzymové katalýzy zámek a klíč . obecná acidobazická katalýza : nukleofilní a elektrofilní katalýza kinetika enzymové reakce s jedním S €V^Í-€*1 enzym substrát komplex ES enzym produkt indukované přizpůsobení E + S *■ \ k-i (-> EP) -> E + P enzym komplex ES enzym produkt V v = - d[S] / dt = k^tEPtS] - k.^tES] = d[P] / dt = k2*[ES] [S] rovnice Michaelise a Mentenové Vmax - maximální rychlost Km - Michaelisova konstanta; koncentrace S, kde v = V2 Vr max 171 enzym + substrát => => krátká perioda pro vytvoření ES, tzv. lag-fáze (indukční perioda) [E] se enzymu snižuje, koncentrace [ES] narůstá až do ustáleného stavu {steady state, ms) => [ES] = konst, [P] = 0 U u o [S] [P] [ES] čas [s] CD U ru (D u o 1 lag-fáze [P] y \ y \ [ES] v. y i [E] i S 1 S • __y čas [ms] enzymová kinetika vyrež teplota vliv reakční ch podmínek rozsah teplotních optim: 0 až 150 °C k [S"1] : běžný rozsah teplotní stability: 20 až 40 °C 2000 - zvýšení teplotní stability :: kotvení na nosič; :: biotechnologický / genetický zásah rychlost enzymatické reakce - Arrheniuv zákon 1000 - 15 25 45 teplota [°C] dán počtem a kvalitou (pK) disociovatelnych skupin : pH optimum enzymu se syntetickými substráty in vitro :: je odlišné od pH optima pro enzym in vivo 173 : často i jiný význam než jen nastavení optimálního pH ^— :: synergický efekt pufru - kumulace efektů jednoduché pufry pufr iako druhý enzymový substrát am ° ^ stanovení katalytické koncentrace alkalické fosfatázy (ALP) enzymová aktivita zásadně závisí na typu pufru : uhličitan - ALP jako hydroláza : aminoalkohol - ALP jako fosfáttransferáza aminoalkoholovy pufr je současně druhým enzymovým substrátem stanovení katalytické koncentrace y-g/utamy/transŕerázy (GMT) akceptorem glutamylové skupiny aminokyselina jsouc druhým enz. substrátem : bez aminokyseliny - GMT jen jako hydroláza : optimálním druhým substrátem je glycylglycin : současně jako pufr + synergický vliv na GMT; pK ~ opt. pH pro GMT pufr jako specifický moderátor při stanovení enzymu enzymové turbidimetricke stanovení fibrinogenu s proteolytickým enzymem batroxobinem :: rychlost reakce se specificky zvyšuje za přítomnosti glycylglycinu v průměru až o 80 % :: enzymová reakce má pHopt = 8, ~ pK^ glycylglycinu => současně pufr i aktivátor, synergický efekt pufr jako nespecifický moderátor reakce enzymové stanovení glukózy se provádí s glukozaoxidazou (GOD), peroxidazou a oxidační kopulací :: TRIS: reakce probíhá pomalu a jen zvolna se ustaluje rovnovážný stav :: fosforecnanovy pufr: reakční rychlost se dramaticky zvyšuje a rovnováha se ustaluje rychle 175 pufr jako stabilizátor enzymové aktivity stanovení močoviny ureázou :: v aktivním centru skupinu -SH => pufry kombinující EDTA (kyselá složka pufru) s různými zásadami; EDTA chrání enzym před inaktivací stopami těžkých kovů pufr lako zdroi potíží pn enzymové analyze stanovení pomocí ALP :: dietanolamin a aminometylpropanol: odstrašujícími příklady pufru ::: látky medovite konzistence, nedají se krystalovat a je obtížné je vyčistit ::: obsahují nečistoty interferující při stanovení ALP, která je metaloproteinem; komplexují zinečnaté kationty v aktivním centru ALP 176 moderátor aktivátory nebo inhibitory inhibitor jako analyt z míry inhibice je možné stanovit koncentraci analytu substrát praktické důvody => syntetické substráty strukturní definovanost, průmyslová výroba : substrát s autoindikační vlastností 4-nitrofenylfosforečnan ^> 4-nitrofenol : substrát => produkt, jenž je substrátem indikátorové reakce 1-naftylfosforečnan *&> 1-naftyl + 4-aminoantipvrin => chinonmonoimin stanovení /Tm a Vmax enzymy jako analvtv linearizovaná rovnice Michaelise-Mentenové podle Lineweavera a Burka 1/1^=1/ Knax + Km /as\ l/v tg a = KM / V max 1/[S] alkalická fosfatáza (ALP) 1 /v í I vmax absorbance 400 nm AA/min -1 / km N^ inkubační směs -^ : ALP + substrát 4-nitrofenylfosforečnan : alkalické prostředí : pufr N-metyl-D-glukamin, pH 10.1 při 37 °C inkubační směs vždy stejné množství enzymu a pufru, startuje se substrátem, jehož koncentrace se plynule zvyšuje : AA se měří mezi 30 až 120 s po startu odhad Km a Vmdx lze provést z grafu linearizovane rovnice 178 enzvmv iako analytická činidla enzym : rychlá, elegantní, vysoce specifická chemická reakce za šetrných podmínek U .o o to .o urikáza : přeměna kys. močové na allantoin 1 - urikáza z hovězích jater 2 - urikáza z Aspergillus flavus 3 - urikáza z Candida utilis 3 4 aktivita [jjkat.l"1] způsoby mereni enzymu a substrátu vcetne kalibrace koncentrace katalytické aktivity enzymů : analytický postup musí být kinetický : reakce podle kinetiky nultého řádu a maximální rychlostí Vmax metodou konstantní koncentrace : z času potřebného k dosažení předem zvolené změny koncentrace metodou konstantního času : z velikosti signálu dosaženého za předem zvolený čas CT 'to 'n (D konstantní čas konstantní koncentrace vzorek 1 s vyšší a 2 s nižší aktivitou svislé přímky : metoda konstantního času vodorovné přímky : metoda konstantní koncentrace cas kalibrace enzym jako analyt - definice koncentrace katalytické aktivity enzymu produkt-em/-y, které vznikají enzymovou transformací příslušného substrátu nebo měřením jeho úbytku enzym jako analytické činidlo - kalibrace prováděna standardním roztokem použitým místo vzorku kalibrantv : certifikované referenční materiály(CRM) : sérové kalibrátory (lyofilizovaná séra obohacená o příslušné analyty), jejich obsah stanoven definitivními nebo referenčními metodami, pokud jsou k dispozici, nebo pomocí primárních standardů 181 stručné zásady enzymové analytiky konstantní teplota inkubační směsi s přesností + 0.1 °C (37 ±0.1 °C) stanovení enzymu: inkubační směs - vzorek (enzym), pufr a další nezbytné látky reakce; se startuje roztokem vytém pérovaného substrátu : objem startéru ne >l/20 až 1/10 celkového objemu : substrát musí být v dostatečném přebytku > cca 20x Km : startovat lze i vzorkem (např. sérem) stanovení substrátu: jako v bodě 2), startuje se vzorkem stanovení koncentrace katalytické aktivity enzymu: kalibrace jako definice katalytické koncentrace enzymu produktem, který vzniká transformací substrátu, nebo sérovými kalibrátory a CRM enzymové stanovení substrátu: kalibrace standardním roztokem substrátu, nebo CRM a sérovými kalibrátory 182 optimalizace enzymových postupů reakční směs - více složek navzájem se ovlivňujících, optimalizace tzv. relaxační metodou (SVA) : shromáždit údaje o enzymu/enzymech včetně Km (stačí i odhad) : hledání hlavní parametrů enzymové reakce optimalizačními postupy MVA metoda - validace => splňuje pro daný účel analytické a klinické požadavky analýza DNA v klinické biochemii VIII. onkológie vyšetření rakoviny přítomnost mRNA markerových proteinů: mRNA tyrosináza (melanom), GAPDH (rakovina plic), E-kadherin (trávicí trakt), AIB1 receptor (slinivka břišní), hypermetylace DNA (rakovina prostaty) prenatální a postnatální diagnostika vrozené metabolické nebo neurodegenerativníporuchy galaktosémie, fenylketonurie, Wilsonova choroba, MCAD (porucha metabolizmu mastných kyselin), Friedreichova ataxie, syndrom fragilního chromozómu X atp. soudní medicína zjišťování identity pomoci tzv. genetických otisků prstů určení příbuznosti; spor o rodičovství (paternita, maternita), identifikace oběti či pachatele 184 infekční nemoci průkaz původců chorob : vir (HIV, cytomegalovirus, viry hepatitídy B, C, enterovirus, adenovirus, herpes simplex virus) : bakterie (Mycobacteria, zejména M. tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Borreliae, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila) : houby a paraziti (Candidae, Aspergillus, Leishmania, Plasmodium, Trichomonas) terorizmus - antrax, tu la rem ie, botulizmus apod. sledování post-transplantačních stavů sledování stavu pacientů po transplantaci hladiny cytomegaloviru a herpesvirů, DNA-chimérizmus sledování kvality potravin a veterinární lékařství sledovánípatogenů mykobakterie, echinokoky, rotaviry, PRRVS a BVDV viry u chovných zvířat, helikobaktery v mléce, Escherichia coli 0157 převážně v hovězím mase či enteroviry obecně v potravinách a pitné vodě 185 struktura DNA primární struktura - sekvence baze: puriny - A, G; pyrimidiny - C, T nukleosid: baze + (2'-deoxy)ribóza nukleotid: nukleosid + 5'-fosforečnan; MP - monofosfát, DP - difosfát, TP - trifosfát N K O N H. HN O H 7 ^ 9. 7,s> N' N N3 N H lil HNt O ■CH, adenin (A) 5' HOCH, guanin (G) cytosin (A) thymin (A) NH„ CH2 0 OH N O -R OH H adenin (A) HO-P=0 5'CH, H O baze C HOCH2 _0 0 H H deoxycytidin (dC), R = H OH H H 5-metyldeoxycytidin (mdC): R = CH3 O H HO-P=0 deoxycytidin-B'-S'-difosfát (dCDP) 186 sekundami struktura — dvousroubovice DNA párování baží (Watson-Crickovo) G-C A-T HO-PO 5 CH2 Q 4'I\H baze o3' I HO-P=0 0 H CH baze 3-° H H 0 1 HO-P=0 0 I CH baze 2 O 0 I H CH, HN-H^°Y^ Y 0 N" -N' cIR adenin - thymin 0^ ^HN - -NH^ N ^ m ^ 1 dR H guanin - cytosin jiné párování baží Hoogsteenovo, Wobbleho, obrácené Watson-Crickovo G-A G-T A-C neshoda {mismatch) - nešednoucí sekvence, „uzeľ 187 ssDNA - jednořetězcová DNA {single stranded DNA) dsDNA - dvouřetězcová DNA {double stranded DNA) dvousroubovice - formy šroubovice A b dsDNA OWWWW&/ í m chromatin 30n inch romati n rozvinutý chromatin kondenzovaný chromozóm mmmmimm J 1 1 nm i 30 nrn mitotic ký chromozóm 50 OOOx zkráceno terciární struktura DNA nadšroubovice : topoizomerázy : histony 189 transkripce; DNA => m RNA translace; m RNA => protein CYTOPLAZMA volné aminokyseliny "X tRNAs aminokyselinou kodón ^—w /*>^ v mRIMA translace A4^Ö0uÜti0üC^ ribozóm mutace ^x: /i A sekvence DNA, A struktury a počtu chromozomů DNA RNA ____/s^ A genové exprese, vznik RNA o chybné sekvenci genealogické vyšetření diagnostika poruch znak, resp. ■■■■► fenotypový projev protein A enzymové aktivity, poruchy stavby buněk a tkání A stavby a funkce orgánů, poruchy metabolismu, poruchy vývoje molekulárně-biologické vyšetření 191 analytické postupy >í X Lr (ill 4 \\ U K K H j» n II IX 11 ii_ 1í íl j 14 rt it XI 11 11 11 XL _Lf n t« it ti «'.XXK 111 * X K sledování numerické aberace : monozómie (Turnérův syndrom), polyzómie (Downův syndrom) identifikace známé sekvence : mutace (fenylketonurie) identifikace neznámé sekvence : sekvenace nových patogenů ÄAAQCCTG GGGTGCCTAATGAGTGA GCTA AC TC A CT A T T A AT T GC G TT GC G C TC AC TG C C Cľ GC T 200 210 220 230 . 240 TCCAGTCGGG A A AC C TGTC GTGCCÄ G C TGCATTA ÄTC-A ATCC-GC CA AC G-CGCGÖGGA GAGGC GC 250 260 270 2flD 290 30Ď A! .A Mkft "TTGC G-TATTGGGCGCTCTtCC GC T TC C TC GC TC AC TGAC T C GC TGCGCTC G GTC GTTC GGC TG 310 320 130 MÚ 350 360 37C sledování stavu DNA : metylace deoxycytidinu (syndrom fragil n ího chromozómu X) 192 základní metodické postupy analýzy NA : zmnožení (PCR) :: multiplikace výchozí DNA, 25 cyklů ~ 224= 17 xlO6 kopií : štěpení restrikčními enzymy :: štěpení namnožené DNA (specifické) : (přenos otisku po gelové elektroforéze) :: oddělení separovaného úseku DNA : hybridizace - na přenosové membráně či na čipu :: reakce s komplementární označenou ssDNA 193 izolace DNA PCR: 10 - 500 |jg lidské DNA 1 - 10 |jg bakteriální DNA 0.1 - 1 |jg plazmidové DNA 1) extrakce NA + sorpce na Si02 po cytolýze 2) postupná šetrná degradace buněk organickými rozpouštědly přípravu vzorku a separace DNA afinitnípurifikace- princip hybridizační schopnosti NA : vzorek + lyzační pufr; + biotinylační pufr; inkubace : po inkubaci => mikrozkumavka s povrchem modifikovaným avidinem nebo streptavidinem adsorpce na silikagelu : NA v přít. guaninu adsorbují na silikagelu : eluce pomocí A pH a iontové síly gelova filtrace : mikrokolonky plněné gelem : adsorpce na silikagelu a gelova filtrace se mohou urychlit centrifugací polymerazova řetězová reakce původní DNA ľ Pis cílová sekvence 1. cyklus 2 molekuly 2. cyklus 4 4 molekuly 3. cyklus 4 8 molekul / \ l)a2) 3) J I ! A pnmery | r 1 a~\ nové |nukleotidý| 5) /\ i\ (jl\ AV- (polymerase chain reaction, PCR) 1) iniciace - zahřívat na 96 C 5 min až DNA i primery roztají 2) tání - zahřívat na 96 °C po 30 s; přidat DNA-polymerázu 3) připojení - zahřívat na 68 °C po 30 s 4) prodlužování - zahřívat na 72 °C po 45 s 5) opakování - kroky 2-4 opakovat max. 25x 6) uchování - výsledná směs na 7 °C; chrání DNA před rozkladem 195 a m pi if i kače NA PCR polymerase chain reaction (DNA) polymerázová řetězová reakce RT-PCR reverse transcription PCR reverzně transkripční PCR TAS transcription-amplification system transkripčně-amplifikační systém 3SR self-sustained sequence replication nepřetržité zmnožování sekvence / 3SR amplifikační reakce NASBA nucleic acid sequence-based amplification (RNA, DNA) amplifikace na základě sekvence baží transcription mediated amplification (RNA, DNA) amplifikace zprostředkovaná transkripcí strain displacement amplification (DNA) amplifikace s vytěsňováním řetězce (RNA) (RNA, DNA) (RNA,DNA) 1985 1991 1989 1990 TMA SDA 1991 1992 amplifikace hybridizační sondy LAR ligase amplification reaction ligázová amplifikační reakce LCR ligase chain reaction ligázová řetězová reakce Q-beta Q-beta replicase amplification Q-beta replikázová amplifikace 1989 1991 1988 196 reštrikční enzymy EcoRl Escherichia coli BamHl Bacillus amyloliquefaciens HindlU Haemophilus influenzae MstU Microcoleus sp. Taql Thermus aquaticus Noťi Nocardia otitidis Alul Arthrobacter luteus 5 GAATTC 3 CTTAAG 5 GGATCC 3 CCTAGG 5'AAGCTT 3 'TTCGAA 5'CCTNAGG 3 GGANTCC 5'TCGA 3'AGCT 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5 AGCT 3 TCGA přenos otisku (blotování) identifikace známé sekvence NA PCR => štěpení NA reštrikční endonukleázou => => separace gelovou elfou => přenos => hybridizace => vizualizace značky DNA - prenos podle Southerna, „jiznr prenos (Southern blot) RNA - přenos podle „Northerna", „severnT přenos (Northern blot) 1 23 4(£)5678 910 1 2 3 4©5 6 7 8 910 1 2 3 4 © 5 6 7 8 9 10 hybridoblot hybridizace ssDNA fragment (analyt) + + značený komplementární ssDNA fragment (sonda) : chromofor, fluorofor, radioaktivní izotop (32P) 198 cytogenetická diagnostika FISH - fluorescenční in situ hybridizace sledování polyzomií, translokací, inverzí, delecí možnost analýzy interfázních chromozomů : nevyžaduje kultivaci buněk a přípravu metafázických chromozomů komplementární párování vyšetřované DNA s fluorescenčně značenou sondou sekvence vyšetřovaného genu : jednotlivý gen : celý či část chromozómu anebo centromerické či telomerické oblasti detekce - fluorescenční mikroskopie 199 mFISH - vícebarevná vysokorozlišovací fluorescenční hybridizace multicolour FISH high resolution banding kombinace více fluorochromů a více sond SKY - spektrálni kary o ty pováni spectral karyotyping ^T7r< identifikace početních i strukturálních chromozomálních aberací komplementární párovaní - 55 fluorescenčně značených sond počítačové zobrazení a analýza 200 CGH - komparativní genomova hybridizace comparative genomic hybridization vizualizace chromozómových poruch současná hybridizace dvou vzorků DNA značených odlišnými fluorochromy : DNA pacienta (nádorová), značena zeleně : kontrolní DNA (DNA zdravého jedince), značena červeně 201 genová terapie přenos genetického materiálu s léčebným účinkem (AW; adenovirový vektor) cílené vyřazení aberantního proteinu (rakovina; proti lantisensel terapie) obnova exprese mutovaného genu (dědičné choroby) problém obranných mechanizmů buňky k cizorodé DNA (transplantace) problém selektivní terapie defektních buněk protismyslná DNA s genem mRNA \ < proteolýza RNAza ■ v r zničeni ^_íf VÜftsC^. translace -*+ mRNA komplementární dvoušroubovice 6" cílový protein 202 r barevnost fyzikální jev 1 J IX. indikace => zrak => barva vlnová délka (nm) 700 650 600 550 500 450 400 j______i_______i i______i i červene modré I UV žluté oranžové zelené fialové modrá fialova červeno- zeleno-modrá modrozelená zelena zelenožlutá fialová červená oranžová žlutá sluneční světlo - bílé, bezbarvé rozkládá se hranolem <= index lomu je funkcí vlnové délky : více se odklání od kolmice paprsky fialové, méně žluté lidské oko vnímá jako barevné paprsky s vlnovou délkou mezi 400 až 760 nm absorbuje-li předmět , odráží modrou => jeví se modrý a naopak tzv. doplňkové barvy 203 popis absorpce Bouguer-Lambert-Beerův zákon 1 = 1 * 10 -£*c*d koncentrace c [mol/l], molární absorbance e, síla absorpční vrstvy d [cm] transparence vrstvy: I / I0 absorbance A [l/mol.cm]: A = log I0 / I = c*c*d £= A / c*d =^> úměrné počtu molekul absorbující látky spektrofotometricka absorpční křivka {absorpčníspektrum) A = f{K) o.s>- u c (O .Q o (A (O 0.6- 0.3- 0.0- 450 500 550 Ö00 650 700 vlnová délka [nm] absorpční spektrum: magon s ionty Mg2+ 1 - magon 2-magon + 2.10"6Mg2+ 3-magon + 1.10"5Mg2+ 4-magon + 8.1CT4 Mg2+ posuny polohy absorpčního maxima: bathochromní hypsochromní hyperchromní hypochromní : k vyšším vlnovým délkám : k nižším vlnovým délkám : zvýšení absorbance : snížení absorbance je-li změna spektra plynulá => existence izosbestického bodu : všechny barevné složky téže molekuly y něm mají stejnou absorbanci teorie barevnosti absorpce záření molekulami molekula = X atomů (X>2) absorpce světla - valenční vazebné elektrony : rychlost jejich kmitů je tím větší, čím je vazba pevnější molekuly absorbují: světlo s kmitočtem « kmitočtu vazebných elektronů celková vnitřní energie molekuly E: E = Erot + Evibr + Ee,ektr elektrony o - velká energie přechodu na vyšší energetickou hladinu => => neúčastní se absorpce světla ve Vis elektrony n - menší energie přechodu na vyšší energetickou úroveň => => mohou absorbovat již ve Vis vlastní příčina barevnosti: absorpce energie záření přechodem elektronů n mezi hladinami s různými E struktury způsobující barevnost řetězce konjugovaných dvojných vazeb excitační energie etan CH3-CH3 cca 180 kJ/mol A = 155 nm etyn CH2=CH2 cca 150 kJ/mol A = 190 nm butadién CH2=CH-CH=CH2 A = 210 nm lykopen (11 konjugovaných dvojných vazeb) A = 506 nm CH3 | CH3 CH3 CH3 1 CH3 1 3 CH3 C=CH-CH=CH-C=CH-CH=CH-C=CH-CH=CH-CH=C-CH=CH-CH=C-CH=CH-CH=C i i 1 CH2 1 CH2- /CH3 CH=C l CH2 H3\ 1 X!=CH-CHo dodatečný efekt : substituenty :: nukleofilní, elektrofilní :: nabité oxidace/redukce planarita struktury komplexace s ionty kovů detergenty, molekulární sloučeniny 207 substituenty - nukleofilní, elektrofilní substituenty - nabité ovlivňují rozložení elektronů nukleofilní: : aminoskupina (volný elektronový pár) : hydroxylova skupina (dva volné elektronové páry) benzen AmaY = 255 nm > fenol AmaY = 275 nm > anilin AmaY = 282 nm llldx llldx llldx elektrofilní: : nitroskupina, karbonylova skupina a iminová skupina nitrobenzen Amax = 268 nm, acetofenon Amax = 279 nm :: kombinace skupiny nukleofilní a elektrofilní: bathochromní posun ionizace umocňuje efekt přítomnosti substituentu nitrofenol pKd = 7.16 : kyselé prostředí bezbarvý Amax = 315 nm (vlevo) : alkalické prostředí žlutý (uprostřed) : chinoidní struktura (vpravo) Amax = 404 nm 208 I OH |0| 0=N=0 0=N=0 0=N-0 oxidace / redukce oxidace zvyšuje množství konjugovaných dvojných vazeb Cl 1 ľ 0= £- --o -OH + 2H + + 2e" HCT ť -NH- ■O -OH 1 Cl 1 Cl 2,6-dichlorfenolindofenol - modrý redukce - leukobáze (bezbarvá) redukce zcela výjimečně zlepšuje absorpci H H H LNH 2«- 0 II .C. ~NH' isľ NADH NAD koenzymy odvozené od nikotinamidu CH3-CH2-OH + NAD+ -> CH3-CH=0 + NADH + H+ 209 strukturální pla narita volné překrýváni n-elektronů v konjugovaném systému = rovinná struktura Pr Me ^_Xr v V Me hemoxygenáza - C02 + 02 1 - Fe2+ Me V MePr Pr Me Mt V H H H biliverdinreduktáza nahp+ + NADPH 1 Me V Me Pf Pí Me Me V H H H H hem - červený biliverdin - zelený bilirubin - žlutý 210 kovové cheláty vznik komplexu [ML] a vznik koordinační vazby na úkor volného elektronového páru zapojeného do systému konjugovanych dvojných vazeb je provázen zvýšením barevnosti l-nitroso-2-naftol : žlutooranžový : ionty Fe, Ni nebo Cr :: zelené a hnědé komplexy detergenty alkalická xylenolová oranž 2.10 5 mol/l 1 - XO, pH 10.5 2 - XO a 5.10^ mol/l CPB pH 10.5 3 - XO, pH 6.4 0.6- u S 0.4-i_ O to .o ro 0.2- 1 / \ / 3^2\ n D- 400 450 500 550 600 vlnová délka (nm) 650 molekulo vé sloučeniny aromáty, heterocyklické báze a arom. sloučeniny s nukleofilními substituenty aromatické uhlovodíky s elektrofilními substituenty chinhydron 211 využiti barevnosti v klinické diagnostice acidobazické indikátory stanovení pH : alkalimetrická titrace => stanovení celkové bílkoviny Kjeldahlovou metodou (NH3) : orientační stanovení pH => sem i kvantitativní stanovení pH moči - směsné indikátory (plynulý přechod) stanovení ana/ytů : semikvantitativní stanovení sérového albuminu - tzv. proteinová chyba : semikvantitativní stanovení močoviny- ureázová reakce, produkce NH3 : indikace mikrobiální kontaminace - přeměna cukrů na organické kyseliny 212 redoxní indikátory stanovení redukujících/oxidujících látek : stanovení kyseliny askorbové (vitamin C) : oxidační kopulace - stanovení glukózy, kyseliny močové, cholesterolu : stanovení ELISA s POD (křenová peroxidáza) : stanovení enzymů AST, ALT (fosfatázy) pomocí druhotné enzymatické redoxní reakce orqanočinidla a metalochromní indikátory stanovení iontů kovů - Cl~, Cai2+I Mg2+t Cu2+r Fe2+ chloridy - titrace Hg(N03)2; Hg2+ + difenylkarbazon - modrofialové zbarvení vápník - arsenaze III, o-kresolftalein komplexon hořčík - magon, calmagit měď- bathocuproin železo - bathofenantrolin, ferrozin činidla kopulační stanovení reagujících látek azokopulace : azobarviva - vodivé propojení konjugovaného řetězce dvojných vazeb původních molekul azoskupinou => rovinná struktura nové molekuly : aryldiazoniový kationt jako elektrofilní činidlo : aktivace /7-polohy fenolu při disociaci hydroxyloveho vodíku C6H5- Ň= Ň+ + -C6H5-R -► C6H5-N=N-C6H4-R reakce bilirubinu s diazosulfanilovou kyselinou oxidační kopulace : molekula se dvěma aromatickými kruhy konjugovanými přes iminoskupinu : nová molekula má chinoidní strukturu : další substituenty zvyšující její polarizaci => vysoce barevná využití vznikající peroxid vodíku C6H5-R + 2 H202 ^d> 0=C6H4-R + 3 H20 R-NH2 + 0=C6H4-R -> R-N=C6H4-R + H20 -R odpovídá =0, -NH2 nechromogenní produkty se převádějí na barevné 1-naftylfosforečnan *&> 1-naftyl + kopulační čin. => barevný produkt kyselá fosfatáza 215 činidla redoxní stanovení reagujících látek oxidace => změna redukované leukoformy na barevnou H3C CH, H3C C^ h2"ň^ y \ V-ŇH2 + H5O5, POD HŇ=( \ =/ \=NH -2^0 ^C C^ H3C OH, H¥~([ V -Cr- +H+ HjŇ—/ y —V \—NH2 -1+ H^C CH: H^C CH3 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin a oxidace na modř : oxidační mezistupeň - semichinon chromoqenní substráty pro enzymové reakce samy barevné, nebo enzymovou transformací vzniká barevný produkt a/k. fosfatáza 4-nitrofenylfosforečnan ^> 4-nitrofenol 312 nm 404 nm g Iutamát transfere za L-Y-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid gmi> kyS 5-amino-2-nitrobenzoová NH2 NH: A OH" **-------*- (l1 ^f^COÓ pHB V ■^coo" 1 o=h J-O" značeni biomolekul : afinitní- slabé interakce : kovalentní typy značek afinitní : chromofory, fluorofory : peptidy/proteiny : NA kovalentní modifikace : chemická : enzymatická H3,80 XH- : izotopicke (radioaktivní, těžké) : chromofory, fluorofory, luminofory : enzymy R2 trypsin ----------> 218 H a 180H + ' Vi R2 RJe značka R2je biomolekula RrCO-OJM, Ö 4? R2-N^ estersukcinylirnidu RrN=C=S + Ffc-NHa iiothiokyanát R^-CO-NH^ + HO-N Ö karbcoíarnid R-j-NH-CS-NH-R, thiourea FVSCfe-CI + RrNr^ -----*• RrSOrNH-R2 + HCl sulfonylcľilorid sulfoamid 0< R.-N. # ^2-ol Ri-N. O rnaleinirnid > thinfitriRr lékařská mikrobiologie postupy vyšetření J mikroorganizmy - základní složka biosféry : patogenní - zdraví škodlivé : oportunne patogenní - příležitostně škodlivé {Escherichia coli) lékařská mikrobiologie - mikrobiologická analýza důkaz etiologickeho agens - původce vyšetřované infekce; jeho citlivost na antibiotika a chemoterapeutika lekársky důležité mikroorganizmy bakterie mikroskopické houby prvoci viry subvirová agens (priony) obecný postup mikrobiologické diagnostiky : klinické vyšetření pacienta : odběr a transport vzorku : evidence a stanovení postupu 1. sled: mikroskopie, důkaz antigénu a DNA/RNA 2. sled: izolace agens, popř. nepřímý důkaz 3. sled: identifikace agens 4. sled: stanovení citlivosti na antibiotika : diagnóza a terapie přímý důkaz: nález mikroorganizmu : mikroskopicky - tvar, barvení : imunologicky - průkaz patogenních antigénu : geneticky - sekvenace : biochemicky - důkaz specifických metabolitu patogenu nepřímý důkaz: imunologicky - nález protilátek proti patogenum mikroskopicky důkaz : rychlý a levný : méně citlivý - až v koncentraci 105/ ml nativní preparát : důkaz větších mikroorganizmů - některých parazitů a kožních plísní :: diagnostika syfilitidy [Trepomena pallidum, treponemata) : mykologicke preparáty - „nativnľ jen v technickém smyslu slova; přibarvují se Parkerovým inkoustem nebo fluorescenčním barvivem barvený preparát fixace - narušenia přichycení mikrobiálních buněk na podložní sklo zahřátí nátěru nad plamenem nebo denaturací chemickými činidly (šetrné; metanol, bílkovinné antigény - etanol, viry - aceton) : orientační jednoduchá barvení- methylenová modř : barvení diagnostická (diferenciální) - barvení dle Grama, Ziehla- Neelsena, Giemsy a fluorescenční barvicí postupy 221 Gramovo barvení : přítomnost mikroorganizmů (významný počet) : velikost, tvar (koky, tyčinky, rovné, zahnuté či větvené) : vzájemné uspořádání (dvojice, shluky, řetízky apod.) pozadí preparátu - přítomnost a vzhled buněk makroorganizmu (epitelie nebo leukocyty) a dalších struktur (hlenová vlákna apod) rozdělí mikroby na modrofialové vybarvené mikroby grampozitivní růžově až červeně zbarvené mikroby gramnegativní provedení: fixovaný preparát na 20 s do roztoku krystalové violeti; pak 20 s v roztoku jodu, promytí alkoholem (max. 20 s), opláchnutí vodou, ponoření do roztoku safraninu a závěrečný oplach vodou stavba bakteriální stěny - komplex krystalové violeti s jodem, u bakterií gramnegativních snadno vyplavitelný alkoholem; snadno se dobarví na růžovo safraninem nebo zředěným fuchsinem diagnostika hnisavých afekcí (meningitida, kapavka, anaerobní infekce, záněty) 222 barvení dle Ziehla-Neelsena bakterie nebarvitelné podle Grama {Mycobacterium tuberculosis} provedení: fixovaný preparát se barví za horka v tzv. karbolfuchsinu, odbarvuje se okyseleným alkoholem a dobarvuje např. methylenovou modří; acidorezistentní tyčinky se barví růžově, pozadí preparátu modře fluorescenční barvení : citlivější postup důkazu acidorezistentních tyčinek provedení: teplem fixovaný preparát se barví směsí fluorescenčních barviv auraminu a rhodaminu, diferencuje se tzv. kyselým alkoholem, dobarvuje se fuchsinem; na sametově tmavorudém pozadí preparátu jasně žluté tyčinky barvení dle Giemsv-Romanowského : v hematologii k barvení krevních nátěrů; v mikrobiologii k důkazu prvoků (malárie, trypanosomy, leishmanie, trichomonády), špatně se podle Grama barvících bakterií (ehrlichií, rickettsií atp.) a ke znázorňování virových inkluzí provedení: fixace metanolem a barví se 2 h Giemsovým barvivem (1:10 ředěného vodou). Giemsovo barvivo - azur s eosinem; bakterie se barví tmavomodře, jádra prvoků karmínové, jejich cytoplasma bleděmodře _. izolace, kultivace mikroorganizmu => primy důkaz kultivační důkaz provedení : na kultivačních mediích : bakterie, kvasinky, plísně a prvoci : v buněčných kulturách {in vitro, in vivo) : prvoci a intracelularni paraziti kultivační media základní půda tekutá (bujón) : masový extrakt :: očkování kličkou, inkubace v termostatu základní půda pevná (živný agar) : rozvařené řasy v bujónu - gel (agaróza, agaropektin) :: očkování kličkou - křížový roztěr, inkubace v termostatu obohacené půdy : růstové faktory (vitamíny, AA, nukleotidy) : krevní agar, půdy vaječné {M. tuberculosis) selektivní pudy : inhibitory růstu nežádoucích organizmů - selekce 224 diagnostické půdy : růstové faktory, selekční inhibitory, substrát a indikátor Endova půda (střevní tyčinky), MacConkeyho půda půdy pro stanovení citlivosti na antibiotika : růstové faktory, selekční inhibitory, substrát a indikátor agar Mueller-Hintonové transportní půdy : bez živin, vlhké, inhibitory metabolizmu :: 24 h přežití Amiesovo medium - anorg. soli, thioglykat sodný, aktivní uhlí, 0.4 % agaru in vitro buněčné kultury : kuřecí embrya - viry, ricketsie, chlamydie tkáňové kultury, monovrstvy pod živným roztokem (Eaglovo esenciální minimální médium) in vivo : morčata, myši zásada „3 FT : refinement (propracování) - pečlivě připravené pokusy, nejlepší podmínky : reduction (omezení) - na co nejmenším počtu zvířat : replacement (nahrazení) - snaha nahradit pokus jiným postupem, např. tkáňovými kulturami nebo průkazem cílových sekvencí NA tuberkulózni mykobakterie - morčata; vzácné a neopakovatelné vzorky (likvor, vyňaté mízní uzliny apod) vivisekceje citlivější než kultivace- tularémie nebo psitakóza virológie - laboratorní myši; izolace viru klíšťové encefalitidy, coxsakievirů (zánětu mozkových plen a srdečního svalu) důkazy mikrobiálních toxinů - nejde bez vivisekce 226 biochemicky důkaz diagnostické půdy půdv cukerné - schopnost mikroorganizmu štěpit jistý sacharid produkt => kyselina i pH media - acidobazický indikátor adonitol, arabinoza, cellobioza, dulcit, fruktóza, galaktoza, glukóza, inositol, inulin, laktóza, maltóza, mannitol, mannóza, melesitoza, melibioza, rafinoza, rhamnóza, ribóza, sacharóza, sorbitol, škrob, trehalóza a xylóza substrátové půd v - schopnost enzymaticky zpracovat substrát deaminace - fenylalanin a tryptofan dekarboxylace - arginin, lysin a Ornithin hydrolýza - močovina, hippurát a tributyrin redukce - dusičnany na dusitany metabolické půdv - využití některých látek citróna n, octan nebo malonan - zdroje uhlíku : růstové faktory auxanoqram - zjištění, zda kvasinka neroste lépe v okolí tablety s určitým sacharidem 227 5 využívané mikrobiální enzymy: N-acetyl-ß-D-glukosaminidaza (NAG), C8-esteráza, a-galaktosidáza (aGA), ß-galaktosidaza (ßGA), ß-glukosidaza (ßGL), ß-glukuronidaza (ßGLR), yglutamyltransferáza (GGT), leucin-aminopeptidáza (LAP), pyrrolidonylarylamidáza (PYR), ureáza a ß-xylosidaza (ßXY) imunodetekce aglutinace na sklíčku : antigény tělové a bičíkové Salmonella enteridis, citrobaktery, pseudomonady, cholerová vibria, bordetelly, meningokokové virová identifikace virus-neutralizační test : specifická protilátka inhibuje některý biologický účinek viru 228 citlivost na antibiotika antibiotika, syntetická antimikrobiální chemoterapeutika kvalitativní důkaz diskový difúzni test princip: kolem disku z filtračního papíru nasyceného antibiotikem citlivý mikrob nevyroste - vytvoří se zóna inhibice o určitém průměru kmen citlivý vůči danému antibiotiku - zóna stejnou nebo větší než u referenčního kmene testovaná antibiotika - závisí na druhu mikroba, na charakteru onemocnění a na druhu vzorku, z něhož byl mikrob vypěstován a na místní situaci ve vývoji rezistence mikrobů na antibiotika 229 kvantitativní stanovení diluční postupy (zřeďování antibiotik); minimální inhibiční koncentrace (MIC) daného antibiotika pro vyšetřovaný kmen mikroba : mikrotitrační destička 8x12 s definovanou koncentrací určitých antibiotik klesající geometrickou řadou : po naočkování a inkubaci se zjišťuje, zda bujón zůstal čirý (úplná inhibice růstu), nebo zda má zákal či sediment MIC - nejnižší koncentrace antibiotika schopná růst zastavit; M9/ml m9/l minimální baktericidní koncentrace - nejnižší koncentrace antibiotika schopná vyšetřovaný kmen usmrtit : vzestupná koncentrace v sérii dnes zvláště - rezistence mikrobů k antimikrobiálním látkám rezistence na antibiotikum - změna cílové molekuly, zhoršení průniku do buňky, zrychlení vylučování antibiotika z buňky nebo tvorba enzymu, který antibiotikum inaktivuje 230 důkaz mikrobiální složky nepřim v důkaz stopy, které během infekce zanechal patogen v organizmu : mikrobiální antigény, toxiny, metabolické produkty a typické sekvence NA naprosté většině jde o stanovení množství protilátek (Ab) sérologický test imunostanovení syfilis, mononukleóza, infekce HIV apod : důkaz signifikantního nárůstu množství Ab; množství Ab se nazývá titr prípadová studie vývoj metody pro klinickou diagnostiku stanovení alkalické fosfatázy alkalická fosfataza (ALP) - analyt související s funkcí jater, růstem kostního aparátu, placenty aj\ 4 hlavní izoenzymy: kostní, jaterní, střevní a placentální případová studie - typický příklad pro vývoj analytické metody : vlivy metody, vliv teploty, pufru, modifikátoru, určeni optimální koncentrace substrátu, postup zjištění referenčního intervalu + výroba soupravy a způsoby stabilizace jednotlivých činidel 232 základní vlastnosti ALP d wi Ol ^ ■ Ol ^ ■ fosfohydrolaza monoesteru kyseliny ortofosforečné s alkalickým optimem : katalyzuje hydrolýzu fosforecnanových monoesteru na anorganický fosforečnan a odpovídající alkohol : může také hydrolyzovat všechny typy sloučenin s vazbami typu P-O-C, P-O-P, P-S a P-N, s výjimkou sloučenin typu P-C : v případě fosforecnanových monoesteru může i přenos fosforecnanove skupiny hydrolýza R-0-PO-(OH)2 + H20 ^p> R-OH + H3P04 transfosforylace R1-0-PO-(OH)2 + R2-OH ^p> Rj-OH + R2-0-PO-(OH)2 účinnost transfosforylace závisí značně na typu a koncentraci akceptoru ALP : metaloprotein; kofaktor Zn2+ (4 atomy) : Zn2+ hraje významnou roli při transfosforylačních reakcích ALP : Co2+ hydrolyzuje, netransfosforyluje nespecifické inhibitory: EDTA, KCN, cystein, o-fenantrolin, kyselina 8-hydroxychinolin-5-sulfonová aj. : odstraněním prvých 2 atomů Zn klesá aktivita enzymu asi o 90% : zbylé 2 atomy lze odstranit obtížněji, pak ale vzniká zcela neaktivní apoenzym specifický inhibitor - L-fenylalanin aktivátory: ionty Co2+, Mg2+ a Mn2+, zatímco inhibičně působí Be2+ a Zn2+ 234 4 235 význam ALP objev: 1907 v rýžových klíčcích analytické stanovení a využití v diagnostice : 1926 - diagnostika kostních nemocí : 1930 - obštrukční žloutenka sérum zdravých obsahuje hlavně kostní a jaterní izoenzymy T aktivita ALP : poruchy růstu a u některé kostní nádory (kostní izoenzym) : nemoci hepatobiliarniho systému (cholestáza a nádorové metastázy do jater) i aktivita ALP : hypothyreóza (kretenizmus), skorbut, nemoci z ozáření, těžká anémie a při léčbě imunosupresivy sezónní variace: vliv UV-záření; v zimě (nižší sluneční svit) t ALP v těhotenství t ALP o 12 až 50 % (placentami izoenzym) 236 metody stanovení ALP katalytická aktivita: závisí na substrátu a reakčních podmínkách - druhu, pH a koncentraci pufru, teplotě, přítomnosti modifikátoru historie: 1926 - substrát hexafosforečnan 1929 Kay - substrát ß-glycerofosfat, bez pufru; stanovení anorganického fosforu (48 h!!!) později - glycinový pufr pH 8.8, fosfor pomocí fosfomolybdenové modři (3 h) - barbitalový pufr pH 10.8 nové substráty: fenylfosfat a 4-nitrofenylfosfát, fenolftaleinmono- a difosfaty, thymolftaleinmonofosfát, 3-O-metylfluoresceinfosfát, naftyl-AS-MX-fosfát, metylumbelliferylfosfát, indoxylfosfát apod zvýšení citlivosti - fenylfosfátem, stanovení uvolněného fenolu oxidační kopulací se 4-aminoantipyrinem a ferrikyanidem nově - chromogenní substráty - fenoftaleinfosfát (=> fenolftalein) - thymolftaleinfosfát 237 substrát : jednoznačně definovaný, chemicky dostatečně čistý; s produktem hydrolýzy s autoindikačními vlastnostmi dnes - 4-nitrofenylfosforečnan (NPP 1), štěpí se na fosforečnan a 4-nitrofenol (NP2) NP je acidobazickým indikátorem s disociační konstantou pKa = 7.16 koncentrace NPP: 5-20 mmol/l teplota ALP - při 37 °C rychleji inaktivována (D > .2 (D 3 37 °C 30 °C T-----------------"- 30 60 - r nOO w cas [min] ^^ absorbance 0j6 QA OjO 260 300 360 400 450 5QD vlnová délka [nm] 238 pH a pufr již nepoužívané pufry: barbitalovy, glycinový, hydrogenuhlicitanovy, 2-amino-2-metyl-1-propanolový aj\ aktivita ALP je pufrem výrazně ovlivněna : pufr současně i druhým substrátem (akceptorem fosforečnanu) při transfosforylaci ovlivnění aktivity pufrem : neutrální / inertní (uhličitanový, barbitalovy apod) : inhibující (glycinový, propylaminový aj\) : aktivující (transfosforylující pufry) pufr pro ALP : akceptor fosforečnanu, : dostatečně stálý : dostupný ve vhodné analytické čistotě : disociační konstanta pKa ~ 10 H H,N C C OH | H2 C —CH, H, EAE etylarninoBtanol N H, H,C -C—OH H, CH, H,C —CH, I * NH H, H, ;h, AMP byl doporučen IFCC AMP 2-arnino-2-rnetyl-1-propanol DEA dietanolarnin HjC—N—CH3 2 I H 3 HC—OH R MEG N-rnetyl-D-glukarnin R- glukózovaný 239 způsoby měření kdysi: aktivita enzymů kineticky, manuálně a diskontinualne (dvoubodově) dnes: rychlý kinetický kontinuální postup modifikátory ALP inhibitory: sloučeniny arsenu, fosforečnany, látky schopné vázat ionty zinku silněji než sám enzym : nespecifické chelatotvorne inhibitory: EDTA a KCN specifický aktivátor: v pufru MEG ionty sodíku 240 stanovení ALP v MEG pufru optimalizace stanovení ALP : literárni rešerše (vlastnosti, metody stanovení apod) : vymezení orientačních podmínek analytického postupu (typ pufru a jeho pH a koncentrace, typ a koncentrace substrátu) : optimalizace složení inkubační směsi výhradně se substrátem NPP pufr : MEG - dobré tra nsfosfory lační vlastnosti, nízká reaktivita, vysoká čistota a snadná dostupnost : DEA i AMP vyřazeny pro obsah inhibujících nečistot 241 reakční podmínky a pracovní postup teplota 37 °C vlnová délka 420 nm pH (37 °C) 10.1 ±0.1 délka opt. dráhy 1 cm MEG puf r 0.35 mmol teplota (37.0 ± 0.1) °C NPP substrát 15 mmol/l signál AA chlorid sodný 70 mmol/l interval měření 30 - 120 s chlorid horečnatý 0.5 mmol/l sérum/inkub. směs (v/v) 1:51 (0.0154) čistota chemikálií NPP: < 0.05 % volného 4-nitrofenolu, < 0.25 % volného anorg. P043_ molární absorbance v 10 mmol/l NaOH A = 311 nm - 9 857 + 751 l/mol.cm MEG: bod tání 129 - 131 °C NP: molární absorbance v 10 mmol/l NaOH A = 401 nm -18 380 l/mol.cm 242 stálost činidel pufr - nejméně 1 měsíc při teplotě +5 °C (bez bakteriální kontaminace) substrát - připravit těsně před použitím; v temnu a chladu při teplotě +5 °C stálý nejméně 24 hodin standardní roztok NP - v temnu a chladu stálý nejméně 1 měsíc výpočet koncentrace katalytické aktivity fS-ALP [|Jkat/l] = AA420 * F F je faktor, AA420 = (AAj - AA2) absorbance kontrolního roztoku (AA2) - kompenzuje absorbanci NP vzniklou spontánním, neenzymovým rozkladem substrátu vlivem alkalického prostředí faktor F: 1) z kalibračního roztoku bez ALP 2) pomocí molární absorbance 4-nitrofenolu 243 optimálni podmínky stanoveni ALP aktivita 4 3 2 1 aktivita kostní ,__------Ü----------O. jaterní střevní 2 -i-----------1------------r- -i-----------1------------1- 8.3 9B 9.9 10£ 10.5 pH vliv pH referenční interval 00 0*2 0.4 QM 09 koncentrace MEG [mol.ľ1] vliv koncentrace MEG aktivita kostní -□—□- -o-------o- tŕ NPP + sérum jaterní střevní -ú 5 10 15 20 koncentrace NPP [mol.ľ1] vliv koncentrace NPP fS-ALP [|jkat/l]: muži 0.90 - 2.20, ženy 0.74 - 2.10, děti 1.20 - 6.30 200 dospělých, 112 chlapců a 152 dívek opakovatelnost a reprodukovatelnost opakovatelnost: ověřena na 10 externích pracovištích, přesnost v sérii a ze dne na den; N = 20; 0 rel. směrodatné odchylky: 3.5 % manuální analýza; 2.5 % analyzátor reprodukovatelnost: na 5 pracovištích; 1.4 - 4.2 % 244 souprava pro stanovení ALP činidlo 1 (6 lahviček) : pevná navážka substrátu obsahuje NPP 1.12 mmol/lahvičku : roztok substrátu se připraví rozpuštěním obsahu jedné lahvičky v 5.0 ml destilované vody; v temnu a chladu při +5 °C je roztok stálý asi 1 týden činidlo 2 (300 ml) : MEG pufr v kapalném stavu o koncentraci 0.56 mol/l, který obsahuje pro konzervaci 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan 0.3 mg/l a N-metylizothiazolon 1 mg/l činidlo 3 (2 ml) : standardní roztok NP v ampuli pod N2 obsahující NP 2.4 mmol/l a Na2EDTA 0.05 g/l sklad: v temnu a chladu při 2 - 8 °C, stálá 24 měsíců pracovní postup: vzájemné objemové poměry séra, pufru a substrátu jsou 1:50:5, tedy 0.02 + 1.00 + 0.10 ml 245 význam pufru v bioanalýze pufr - reakční prostředí : udržení pH (optimum) : druhotný substrát (enzymové reakce) : modifikátory - inhibitory, aktivátory 1900, Fernbach a Hubert: částečně neutralizovaný roztok kyseliny fosforečné působí jako ochrana proti náhlým změnám kyselosti nebo alkality při studiu enzymu amylázy výběr pufru základní charakteristiky: disociační konstanta kyseliny (složka); pKa vlivu ředění, iontové síly, pufrační kapacity a vlivu teploty na pH rozsah pH : pH = pKa + 1, přičemž nejefektivnější je pufr při pH = pKa 246 kompatibilita a synergický vliv pufru kompatibilita chemická : dobrá rozpustnost ve vodě (nemají ji barbiturany) : nekomplexovat ionty kovů (Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+/3+ aj.) : netvořit nerozpustné sloučeniny (tedy ne uhličitany, fosforečnany, citronany) : nereagovat s dalšími složkami systému (bílkoviny, sacharidy + boritany) : nenáchylný k bakteriální kontaminaci (tedy ne fosforečnany, citronany aj\) biochemická : ovlivňování aktivity některých enzymů (fosforečnany inhibují fosfatazy, karboxylázy, fosfoglukomutázy aj.) : interference v procesech oxidační fosforylace (barbiturany) : antisepticita; blokace aktivity většiny enzymů (fenoly) : amfolyty (obojetné ionty) oxidovány flavinovymi mononukleotidy (BICIN, TRIS) : reaktivní a inhibující pufry (TRIS) synergicita modifikace - aktivátor (GlyGIy; fibrinogen) nebo sekundární substrát (MEG) 247 D3B hlavní bioanalytické pufry zkratka složení P*a M ES 2-(N-morfolin)etansulfonová kys. 6.1 BIS-TRIS 2-bis(2-hydroxyetyl)amino-2-(hydroxymetyl)-l,3-propandiol 6.5 BES N,N-bis(2-hydroxyetyl)-2-aminoetansulfonová kys. 7.1 HEPES N-(2-hydroxyetyl)piperazin-N '-(2-etansulfonová kys.) 7.5 TRICIN N-(2-hydroxy)-l,l-bis(hydroxymetyl)etylglycin 8.1 BICÍ N N,N-bis(2-hydroxyetyl)glycin 8.3 AMPSO 3-[(l,l-dimetyl-2-hydroxyetyl)amino]-2-hydroxypropansulfonová k. 9.0 CAPSO 3-(cyklohexylamino)-2-hydroxy-l-propansulfonová kys. 9.6 CABS 4-(cyklohexylamino)-l-butansulfonová kys. 10.7 248 XI analýza vybraných anály tu anorganické, organické analyty a bioanalyty amoniak obsah: degradace aminokyselin v játrech; toxický (CNS) => močovina stanovení: v plazmě; referenční interval 11 - 35 pM chemické metody provedení: amoniak alkalizován, vydělen a absorbován do kyselého roztoku (Conwayova technika) : titrace, konduktometrie, ISE, Nessierovo činidlo (žluté) nebo Berthelotova reakcí (reakce s fenolem a s alk. chlornanem na modré chinoniminové barvivo) pracnéa neautomatizovatelné enzymové metody enzym: glutamátdehydrogenáza (GLD) 2-oxoglutarát + NH4+ + NADPH £^> L-glutamát + NADP+ + H20 : pokles absorbance NADPH při 340 nebo 365 nm provedení: TEA 150 mM, pH 8.6 + 2-oxoglutarát 15 mM, ADP 1.5 mM, GLD min 800 U/ml a NADPH 0.12 mM 249 fosfor, fosforečnany obsah: anorganické a organických fosforečnany; kostní tkáň, nukleové kyseliny, fosfolipidy, koenzymy, ATP apod stanovení: v séru; referenční interval 0.7 - 1.6 mM chemické metody anorganické fosforečnany. : reakce s molybdenanem amonným (bezbarvý fosfomoly bděna nový komplex) : s molybdenanem a vanadičnanem amonným (žlutý komplex kyseliny molybdatovanadatofosforecne); hydrolyzuje částečně i organické estery fosforu a tím nadhodnocuje stanovení anorganického fosforečnanu organické fosforečnany, po mineralizaci sražených bílkovin; závisí na pH (silně kyselé prostředí) provedení: deproteinace séra (silná kyselina), analýza supernatantu: měření při 340 nm; fosfomolybdenová modř (po redukci chlorid cínatý, kys. aminonaftalensulfonová, metyl-p-aminofenolsulfát, síran železnato-amonný, kys. askorbová aj. ) při 882 nm; kyselina molybdátovanadátofosforečná při 420 nm enzymové metody nekatalyzují hydrolýzu organických esterů fosforu a tím odpadá deproteinace vzorku : glykogenfosforyláza, fosfoglukomutáza a glukóza-6-fosfátdehydrogenáza - NADPH : purinnukleosidfosforyláza, xanthinoxidáza (peroxidázy) - oxidační kopulace : sacharózafosforyláza - NADH hořčík obsah: 21 - 28 g na cca 70 kg (60 % kosti, 20 % svaly, 19 % jiné tkáně, asi 1 % extracelulární tekutina); kofaktor asi 300 enzymů stanovení: v séru/plazmě; referenční interval 0.65 - 1.05 mM chemické metody AAS - optimální; volný Mg2+ - ISE : v analyzátorech - fotometrické metody s calmagitem, magonem... AAS: provedení: roztok LaCI3 (spektrální pufr, uvolňuje Mg2+ z fosforečná nových komplexů a ředí viskózni bílkoviny) má koncentraci 4.3 g/l s 10 ml konc. HCl; vzorek : pufru 1:50 do plamene (acetylén-vzduch), Mg-výbojka při 285.2 nm; kalibrační roztoky obsahují interferenty Na+ a K+ reakce s magonem: provedení: 10 pl séra s 2 ml pracovního roztoku (20 mM borátového pufru o pH 9.5 a magonu 0.28 mM rozpuštěného ve směsi DMF s etanolem 5+100), výsledné pH cca 11; je ovlivněno Ca2+ a těžkými kovy - maskování kyanidem + fyziologické koncentrace iontů Ca2+, Na+ a K+; pokles absorbance modře zbarveného komplexu okolo 500 nm reakce s calmagitem: provedení: v částečně nevodném prostředí s 2-metyl-2-amino-l-propanolem; maskování Ca2+ EGTA, měří se při 540 nm 251 hydrogenuhličitany obsah: krev; určení poruch acidobazické rovnováhy stanovení: v celé krvi, plazmě i séru jako C02 (po okyselení); referenční interval závisí na instrumentaci, obvykle C02 v kapilární plazmě asi 22 - 31 mM fyzikální metody plynný oxid uhličitý manometricky, pracné a nelze automatizovat chemické metody kontinuální měření- difúze C02 Si-membránou a sorbce jako HC03~ v alkalickém pufru, pH 9.2 s fenolftaleinem; pokles zbarvení (okyselení) fotometrický elektrochemické měření- C02 elektroda, parciální tlak rozpuštěného plynu v krvi enzymové metody alkalizace - převedení na HC03~ enzymy: fosfoenolpyruvátkarboxylázou (PEPC), malátdehydrogenáza (MDH): HCO3- + fosfoenolpyruvát hipc> oxalacetát + P043" oxalacetát + NADH + H+ ^^> malát + NAD+ provedení: alkalický pufr cca 70 mM, pH 8 + fosfoenolpyruvát 8 mM, NADH 1.6 mM, mikrobiální PEPC min 17 pkat/l a mikrobiální MDH min^ pkat/l 10 pl séra/plazmy (temperovaná kyveta) + 1 ml činidla, inkubace 5 min při 37 °C, absorbance při 340 nm 252 chloridy obsah: hlavní extracelulární aniont (67 %) stanovení: v séru i plazmě; referenční interval v séru je 98 - 107 mM titrace: 2 Ch + Hg(N03)2 ^> HgCI2 + 2 N03" provedení: v kyselém prostředí, roztokem dusičnanu rtuťnatého 5 mM, vzorkem je 0.20 ml séra, indikátorem je difenylkarbazon 20 mM v etanolu spektrofotometrie: 2CI- + Hg(SCN)2 ^> HgCI2 + 2 SCN" SCN- + Fe3+ => Fe(SCN)2+ provedení: měří se kolem 500 nm (červený produkt), rozsah 80 - 125 mM, kalibrace není lineární, linearita konstantním množstvím Hg(N03)2 který váže cca 60 mmol Cl~ na 1 L chloridů coulometrie. Ag+ + Ch => AgCI provedení: generování Ag+ konstantní rychlostí z anody až do ekvivalence, obsah chloridů je proto přímo úměrný měřenému času; kyselé prostředí (lepší vodivost) za přítomnosti želatiny nebo polyvinylalkoholu (reprodukovatenost) 253 měď obsah: metaloenzymy, v plazmě z 95 % na ceruloplasmin stanovení: v séru; referenční interval (pmol/l) 10.1 - 18.4 (muži), 11.3 - 25.2 (ženy) AAS : stačí pouze zředění vzorku reakce s bathocuproinem: provedení: deproteinace + redukční činidlo (hydroxylamin nebo pyrosiřičitan v kombinaci s p-(N-metyl)aminofenolem), odstředí se, supernatant se odměří do další zkumavky a přidá se roztok bathocuproinu; v silně kyselém prostředí oranžově zbarvený komplex se měří kolem 480 nm : značně závisí na čistotě skla; EDTA, promyté vodou s amoniakem zinek obsah: metaloenzymy stanovení: v plazmě, séru, slinách a moči; referenční interval (sérum) 10 - 20 pM spektrofotometrie s 5-Br-PAPS provedení: 2-(5-brom-2-pyridylazo)-5-(N-n-propyl-N-3-sulfopropylamino)fenol při pH 8.6 + maskovadla (další endogenní kovy), měří se při 560 nm, málo citlivé AAS provedení: vzorek se ředí 5x 5% glycerolem, měří se při 213.8 nm; moč jen ze 24 h sběru, moč je lze do plamene přímo; komplikace vysoký obsah solí v moči 254 vápník obsah: kostní tkáň (99 %), extracelulární tekutina, aktivní pouze volný Ca2+ stanovení: v séru, jen volný nebo i vázaný; referenční interval 2.1 - 2.6 mM reakce s o-kresolftaleinkomplexonem\ provedení: pH 12 v prostředí organické báze (2-amino-2-metyl-l-propanol, 2- etylaminoetanol); měří se při 580 nm, 8-hydroxychinolin potlačuje interference hořčíku reakce s arse n a ze m III: provedení: imidazolovy pufr pH 6, modrý komplex, měří se kolem 650 nm; specifické detergenty potlačují interference bílkovin AAS: provedení: podobně jako hořčík, měří se Ca-lampou při 422.7 nm, drahé, vyšší přesnost i správnost ISE: : měří se aktivita Ca2+, závisí hlavně na iontové sile (Na+ a Cl~) - kalibrátory 255 draslík obsah: K+ hlavním intracelulárním kationtem (4.6 mM) stanovení: ve všech tělních tekutinách, nejčastěji v plazmě a v séru, silně ruší hemolýza; referenční hodnoty v séru jsou 3.8 - 5.2 mM enzymové metody enzymy: tryptofanáza (TR), glutamátdehydrogenáza (GLD) tryptofan + pyridoxal-5-fosfát i&kí> indol + pyruvát + NH4+ NH4+ + 2-oxoglutarát + NADPH + H+ £^> glutamát + NADP+ enzymy: pyruvátkináza (PK), laktátdehydrogenáza (LDH) fosfoenolpyruvát + ADP EK£i> pyruvát + ATP pyruvát + NADH + H+ ^*> laktát + NAD+ : snížení koncentrace Na+ kryptandem chemické metody stanoveníAES\ provedení: sérum se ředí spektrálním pufrem (lithiovým nebo cesiovým, stabilizuje efektivní teplotu plamene; aniontové tenzidy Brij 35 nebo Sterox SE pro lepší atomizaci); plamen propan-vzduch; Na, K, Li a Cs s ostrými čarami při 589 nm, 768, 671 a 852 nm stanovení pomoci ISE\ : elektroda s kapalnou membránou 256 sodík obsah: Na+ hlavním extracelulárním kationtem {cca 142 mM) stanovení: ve všech tělních tekutinách, nejčastěji v plazmě a v séru, silně ruší hemolýza; referenční hodnoty v séru 132 - 142 mM enzymové metody enzymy: ß-galaktosidaza (ßGD) 2-nitrofenyl-ß-D-galaktopyranosid ßGC?Na+> galaktoza + 2-nitrofenol 2-nitrofenol (chromofor) se měří kineticky při 420 nm, snížení obsahu Na+ na měřitelné hodnoty se používá kryptand, např. Kryptofix 221 chemické metody AES\ jako draslík ISE\ elektroda se skleněnou membránou 257 barbiturany obsah: léčiva (sedatíva) stanovení: v séru (kontrola medikace), v moči nebo v žaludečním obsahu (otrava) chemické metody plynová chromatografie. provedení: k séru se přidá aprobarbital (vnitřní standard), dvojitá extrakce dietyleterem, odvodnění síranem sodným a odpaření dosucha; odparek se rozpustí v etylacetátu; GC separace - kapilární kolona s kotvenou fází (WCOT), plamenový ionizační detektor, nosný plyn Ar nebo He; analýza různých typů barbituranů (tzv. rychle, středně a dlouhodobě působící) titrační analýza: provedení: extrakce směsí fosforečná nového pufru pH 7 a chloroformu; k organické fázi se přidá opět pufr a chlorid rtuťnatý, znovu se protřepe a odstředí se; organická fáze se titruje roztokem difenylthiokarbazonu (dithizon), přechod z fialové (komplex [Hg2+-barbituran]) do oranžové (komplex [Hg2+-dithizon]); interferují zejména hydantoiny a cyklické imidy kyseliny glutarové 258 bilirubin a jeho estery obsah: metabolizmus hernu přes biliverdin na bilirubin a konjugáty (estery mono- a diglukuronidy) stanovení: v séru a v moči; referenční interval pro celkový bilirubin v séru (pM): novorozenci 68 - 138, děti a dospělí 3.4 - 17.1, z toho konjugovaný, tzv. přímý bilirubin 0-3.4 chemické metody stanovení bilirubinu a jeho konjugátů (a části bilirubinu kovalentně navázaného na albumin) je založeno na vzniku azobilirubinu (acidobazický indikátor): červený ve slabě kyselém a neutrálním pH, v silně kyselé a alkalické oblasti je modrý; konjugáty (tzv. přímý bilirubin) reagují bez akcelerátorů', nekonjugovaný bilirubin (tzv. volný) nereaguje, jen v přítomnosti akcelerátorů (alkohol, kofein aj.), které uvolňují a solubilizují bilirubin z jeho vazeb na albumin stanovení celkového bilirubinu za přítomnosti akcelerátorů', při zvýšeném obsahu se stanovuje i tzv. přímý bilirubin bez akcelerátorů; při novorozenecké žloutence a ozařování novorozenců UV-světlem, které slouží k rozkladu a odstranění volného, nekonjugovaného bilirubinu, byl pozorován vznik tzv. fotobilirubinů, které mají na rozdíl od popisovaného bilirubinu údajně jinou reakční kinetiku a mohou zkreslovat výsledky jeho stanovení 259 0836 2752 spektrofotometrie s diazotovanou kyselinou sulfanilovou. provedení: IFCC metoda stanovení celkového bilirubinu; v kyvetě vzorek + roztok kyseliny sulfanilové v HCl (štěpí bilirubin v místě metylenového můstku) s roztokem akcelerátoru (směs kofeinu, octanu sodného a benzoanu sodného) + se roztok NaN02 (diazoniová soli); po asi 10 minutách se změří ve slabě kyselém prostředí absorbance červeně zbarveného azobilirubinu při 430 - 460 nm; stanovení přes modrou formu, přidá se po reakci alkalický roztok pufru (směs NaOH a vínanu sodno-draselného) a v pH 12 se měří při 580 - 620 nm stanovení přímého bilirubinu se provádí bez akcelerátoru zastavením diazoreakce kyselinou askorbovou (ukončení rozložením diazočinídla), ta se přidává obvykle za 5 nebo 10 minut; celkový bilirubin se stanovuje s kationaktivním detergentem jako akcelerátorem (cetyltrimetylamonium bromid) spektrofotometrie po oxidaci. provedení: oxidace bilirubinu (žlutý) kyselinou vanadičnou na biliverdin (zelený); dvoubodový způsob měření absorbance před a po oxidaci (3 min); lze stanovovat celkový i přímý bilirubin enzymové metody enzym: bilirubinoxidáza (BOX) bilirubin (žlutý) ^x> biliverdin (zelený) provedení: pH 4.5, měří se v pásu 424 - 465 nm kineticky v časovém intervalu asi 5 min; celkový bilirubin se stanovuje při pH 8.5 za přítomnosti akcelerátorů 260 57 etanol obsah: intoxikaci alkoholem chemické metody Widmarkova metoda; destilace alkoholu ze vzorku, oxidace dvojchromanem v kyselině sírové na kyselinu octovou, přebytek dvojchromanu je stanovován titračně jodometricky; pro účely soudní je využíváno stanovení plynovou chromatografií : k průkazu těžkého alkoholizmu byl vyvinut test na tzv. karbohydrátovou deficienci transferinu (CDT) na bázi heterogenní imunoanalýzy enzymové metody enzym: alkoholdehydrogenáza (ADH) CH3CH2OH + NAD+ ^> CH3CHO + NADH + H+ provedení: deproteinace vzorku kyselinou chloristou, alkohol se stanovuje ze supernatantu v alkalickém pufru pH 8.7 (pyrofosfat, semikarbazid a glycin), absorbance se měří při 37 °C při 340 nm po inkubaci 25 minut 261 drogy obsah: zneužívaná léčiva (psychofarmaka) a jejich prekurzory - alkohol, amfetamin, barbiturany, benzodiazepiny, kannabinoidy, kokain, methadon, opiáty, antidepresiva, anabolické steroidy aj. stanovení: řazeno mezi klinickou chemii akutních stavů (POCT) chemické metody kompetitivníimunochemie - rychlé statimové orientační stanovení nejobvyklejších drog, screening moči na diagnostického proužku instrumentální techniky- GC-MS nebo HPLC, slouží většinou pro následnou kvantitativní analýzu po pozitivním screen i ngovém testu screeningové imunostanovení multifunkční (až 9-zónový) proužkový test, nejčastěji: amfetamin, barbituraty, benzodiazepiny, kokain, metamfetamin, morfin, fencyklidin a tricyklicka antidepresiva (popř. na jejich metabolity) 262 provedení: droga z moči(mAg) soutěží o vazebná místa s (obvykle) myšímonoklonální protilátkou proti ní(hbi*), fixovanou na povrchu mikročástic, které jsou jen sorbovány (nekotveny) v dolní části proužku; v horní části proužku je kotvena jako další (druhá) protilátka Ab2 proti myším imunoglobulinům tvořícím Abj* po ponoření multiproužku do vzorku moči obsahující některou z testovaných drog zreaguje na počátku příslušného proužku protilátka a vytvoří barevný imunokomplex [Ab^-mAg] a vzlíná nahoru moč bez drogy, komplex nevznikne a barevné mikročástice s fixovanou protilátkou vzlínají nahoru a ve střední části zreaguje Abj* se zde imobilizovanou drogou/metabolitem a vytvoří tam kotvený barevný imunokomplex [Ag-Abj*] jako negativní kontrolu moč s drogou, vzlíná se vzorkem vytvořený barevný imunokomplex[Ab^-mAg] dál a zachytí se až nahoře, kde zreaguje s Ab2 a vytvoří silně zbarvený proužek jako pozitivní test [Ab2.Ab1>|c-mAg]; protilátka Abj* je v tomto případě antigenem pro druhou kotvenou protilátku Ab2 citlivost. 10 - 100 ng/ml užívají se mikročástice z koloidního zlata (Au), výsledné zbarvení negativní kontroly i pozitivního testu červené nebo modré (na povrchu modře zbarvené mikročástice) 263 glukóza obsah: reprezentuje metabolizmus cukrů stanovení: v séru, plazmě a v moči (nejčastěji stanovovaný analyt); referenční interval (mM) pro sérum je 3.9 - 6.1, pro plazmu 3.3 - 5.6 a ve sbírané moči za 24 h je do 1.39 chemické metody reakce s o-aminotoluenem specifické (už jen galaktóza a manóza), supernatant deproteinovaneho vzorku v prostředí ledové kyseliny octové, kdy o-aminotoluen (6 % o-toluidinu v 80 % kyselině octové obsahující 0.5 % kys. šťavelové) kondenzuje s Glu za zvýšené teploty na glykosylamin, stabilizovaný Schiffovou baží, měří se zelený produkt při cca 630 nm : agresivní chemikálie, nutnost varu a deproteinace vzorku enzymové metody enzymy: hexokinaza (HK), glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (G6PD), glukozaoxidaza (GOD), glukózadehydrogenáza (GDH), peroxidáza (POD) stanovení s GDH R-CH=0 + H20 + NAD+ £dh> R-COOH + NADH + H+ provedení: vzorek se smíchá s pracovním roztokem (fosforečnánový pufr pH 7.6, GDH cca 4.5 kU/l a NAD+ cca 2.2 mM), inkubuje 7 min při 37 °C, měří se nárůst absorbance při 340 n m K 264 stanovení s HK a G6PD glukóza + ATP ***> glukóza-6-fosfát + ADP glukóza-6-fosfát + NADP+ ^hd> g|ukonolakton-6-fosfát + NADPH + H+ provedení: vzorek s pracovním roztokem (TRIS 50 mM pH 7.5, ATP 1 mM, NAD+ 2 mM, HK cca 3 kU/l a G6PD 2 kU/l) při 37 °C, po 5 min se měří absorbance při 340 nm; HK je pro glukózu nespecifický enzymem, specifita je v následné reakci stanovení oxidační kopulací s GOD a POD v praxi nejrozšířenější R-CH=0 + 02 + H20 GQD> R-COOH + H202 R-NH2 + C6H5-OH + 2 H202 HQd> R-N=C6H4=0 + 4 H20 provedení: vzorek s pracovním roztokem (fosforečnan cca 0.15 mM pH 8.0, GOD 10 kU/l, POD 1 kU/l, AAP 1 mM a 3-metylfenol 10 mM) při 37 °C, měří se změna absorbance při 500 nm v intervalu 30 - 90 sekund nebo výsledné zbarvení po 15 min; druhá reakce nespecifická, rušena redukujícími látkami (vitamín C) speciální analyzátory osobní glukometry pro sebekontrolu diabetiků provedení: imobilizovana GOD a elektrodový systém v suchém stavu, indikace ampérometricky (tzv. Clarkova elektroda): H202 Hí> 2 H+ + 02 + 2 e- nebo: glukóza + 02 + R-Fe(II) *od> glukonát + R-Fe(III) 265 pyruvát obsah: produkt oxidace laktátu katalyzované enzymem LDH, stanovení: v krvi obsaženy v malém množství do asi 41 - 67 nM enzymové metody enzym: laktátdehydrogenáza (LDH) pyruvát + NADH + H+ ^*> L-laktát + NAD+ kreatinin obsah: buněčný produkt svalového energetického metabolizmu přeměny svalového kreatinu stanovení: základní vyšetření séra i z moči (funkci ledvin - kreatininová clearance); množství je úměrné velikosti svalové hmoty; referenční interval pro sérový kreatinin je pod 115 pM chemické metody Jaffého reakce červenooranžový Janovského komplex (adukt kreatininu s pikrátem 1:1); nespecifické, reagují i tzv. nekreatininové chromogeny: bílkoviny, glukóza, kys. askorbová, guanidin, aceton, acetoacetát a pyruvát provedení: sérum s pracovním roztokem (kys. pikrová 4.4 mM, NaOH 150 mM a Na2HP0413 mM), měří se absorbance za 10 s a dále přesně po 2 min při 492 nm 266 enzymové metody stanovení přes chinoniminová barviva enzymy: kreatinináza (KRN), kreatináza (KR), sarkosinoxidáza (SOX), peroxidáza (POD) kreatinin + H20 ^^> kreatin kreatin + H20 ^> sarkosin + močovina sarkosin + H20 + 02 sex> glycin + HCHO + H202 2 H202 + 4-aminoantipyrin + fenol EQe> chinoniminová barvivo + 4 H20 provedení: vhodné deriváty fenolu -TBHB (2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoová kyselina) a EHSPT (N-etyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin), měří se absorbance při 550 nm triacylglyceroly (TG) obsah: 95 % všech tuků uložených v tkáních, jsou tvořeny nasycenými mastnými kyselinami od C12 až do C18 stanovení: v séru (nezávislý faktor rizika ischemické choroby srdeční), referenční interval méně než 1.7 mM chemické metody barevný produkt absorbující při 570 nm, nebo byl převeden acetylacetonem a octanem amonným (Hantzchova kondenzace) na žlutý 3,5-diacetyl-l,4-dihydrolutidin, který byl stanoven fotometrický nebo fluorimetricky 9fi- uvedené postupy lze (po extrakci TG) popsat těmito reakčními schématy: TG + ROH/OH" => glycerol + 3R-COOH glycerol + I04-=>HCHO + HCOOH + H20 + I03" HCHO + kys. chromotropová + H2S04 =^> barevný produkt OH O H03S S03H OH OH S03H H03S. x, ""HO.S .S03H OH OH nebo: 4 HCHO + NH4OH + CH3COCH2COCH3 => 3,5-diacetyl-l,4-dihydrolutidin + 5 H20 enzymové metody kombinace s chemickou metodou, využívají vznikající glycerol enzymy: glycerolkinaza (GK), glycerol-3-fosfátdehydrogenáza (G3PD), pyruvatkinaza (PK), laktatdehydrogenaza (LDH), diaforaza (DF), lipoproteinlipaza (LPL), glycerolfosfátoxidáza (GPO), peroxidáza (POD) 268 glycerol + ATP ^> glycerol-3-fosfát + ADP glycerol-3-fosfát + NAD+ £2Ed> dihydroxyacetonfosfát + NADH + H+ ADP + PEP hk> ATP + pyruvát pyruvát + NADH + H+ *^> laktát + NAD+ NADH + H+ + INT ^> červený formazan INT + NAD+ INT - jodnitrotetrazoliová violeť, cca 500 nm kombince s chemickými metodami příliš komplikované a nevhodné pro automatizaci stanovení přes chinoniminová barviva TG + 3 H20 ^=> glycerol + 3 R-COOH glycerol + ATP ^> glycerol-3-fosfát + ADP glycerol-3-fosfát + 02 fiEÔ> dihydroxyacetonfosfát + H202 2 H202 + 4-aminoantipyrin + fenol EQ^> chinoniminové barvivo + 4 H20 fenoly: 4-chlorfenol, nebo kyselina 3,5-dihydroxybenzensulfonová (DHBS), nebo N-etyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidin (ESPAS) stanovení přes NADH TG + 3 H20 *^=> glycerol + 3 R-COOH glycerol + ATP ^> glycerol-3-fosfát + ADP glycerol-3-fosfát + NAD+ ^ed> dihydroxyacetonfosfát + NADH + H+ provedení: probíhá s jedním roztokem, je jednostupňová a je vhodná k automatizaci 269 revmatoidní faktor obsah: pentamerické imunoglobuliny IgM se specifitou pro Fc fragment IgG, podobné vlastnosti i u monomerických IgM, IgA a IgG stanovení: v séru, indikace (až 75 %) všech revmatických onemocnění latexový fixační test provedení: separace dle Cohna (extrakce sadou roztoků etanolu za chladu), frakce II se smíchá s latexovými částicemi, na něž je pasivně sorbovan yQ'obulin, dochází k aglutinaci; citlivost je asi od 2 U/ml Rose-Waalerův test hemaglutinační test (ovčí erytrocyty modifikované taninem /zpevňuje buňky/, potažené králičí protilátkou proti ovčím erytrocytom); erytrocyty aglutinují se vzorkem obsahujícím lidský revmatoidní faktor na základě křížové reakce mezi králičím a lidským IgG 270 C-reaktivní protein (CRP) obsah: patří mezi tzv. bílkoviny akutní fáze a mezi rizikové faktory ischemické choroby srdce stanovení: v séru, jeho koncentrace narůstá cca 7 h po zánětu a kulminuje během 1 až 3 dnů, kdy může dosahovat až tisíc mg/l, referenční interval je pod cca 1.6 mg/l CRP lze stanovit různými imunochemickými metodami, nejčastěji jsou to metody s latexovými částicemi imunoturbidimetrické stanovení metoda DuREL {dual-radius enhanced fatex) - latexové mikročástice o dvou velikostech s vázanými dvěma typy monoklonální protilátky s různou afinitou k CRP (velké částice s vysokou afinitou); při nízké koncentraci analytu reagují přednostně velké částice, při vyšších koncentracích analytu reagují i menší částice => citlivý, široký a lineární měřící rozsah CRP + Ab => [CRP-Ab] : měří se turbidita při 340 nm 271 trypsin obsah: EC 3.4.21.4, serinová proteináza, ve dvanácterníku stanovení: v plazmě, v duodenální šťávě, ve stolici; test na poruchu exokrinní funkce pankreatu, referenční interval přibližně 150 ± 77 pg/l enzymatické metody /munocňem/cky(zejména RIA) fotometrický s chromogenními substráty L-TAPA + H20 in3£ßsin> N-a-tosyl-L-arginin + 4-nitroanilin žlutý chromofor 4-nitroanilin; podobný chromogenní substrát benzoyl-L-arginin-4-nitroanilid provedení: vzorek se ředí fyziologickým roztokem + pufr TRIS 200 mM pH 8 + substrát 1 mM, při 37 °C po 10 min se změří absorbance při 405 nm 272 těhotenský test (hCG) obsah: lidský choriový gonadotropin (hCG), glykoprotein, dimer ä 40 kDa; hormon produkovaný placentou stanovení: v mateřské krvi a moči; od 8. dne po oplodnění vajíčka, hladina hCG v moči při těhotenství prudce narůstá, nejvyšší je 8. týden, pozitivní test při obsahu hCG nad 20 - 50 U/l latexový aglutinační test provedení: na podložním sklíčku; v moči, hCG reaguje s monoklonálním antisérem (Ab, myší), a buď inhibuje následnou aglutinační reakci po přidání latexových částic s fixovaným hCG, nebo ji neinhibuje (reakce proběhne); současně se provádí i tzv. pozitivní kontrola malý obsah hCG (nestačí vyvázat antiserum) => aglutinace proběhne, negativní: hCG + Ab -> [hCG-Ab] + Ab Ab + hCG-latex -> [Ab-hCG-latex]^ vysoký obsah hCG (vše vysyceno) => aglutinace neproběhne, pozitivní: hCG + Ab -> [hCG-Ab] [hCG-Ab] + hCG-latex -> neproběhne aglutinace 273 test diagnostickým proužkem s koloidním zlatem proužek obsahuje v místě nanesení vzorku (dole) sorbovanou, ale nekotvenou monoklonálníprotilátku proti hCG na koloidních částicích zlata (Ab^Au), nahoře (ve směru difúze) dvě zóny s kotvenými protilátkami; prvá zóna obsahuje kotvenou sekundární protilátku proti hCG (Ab2b), druhá zóna obsahuje kotvenou protilátku proti Ab, (Ab3b) vysoký obsah hCG hCG reaguje s primární protilátkou na komplex, difunduje nahoru a zachytí se na prvé zóně s kotvenou Ab2 jako sendvič [hCG-Ab1-Au]-Ab2b; vznikne červený proužek f pozitivní reakce1) malý obsah hCG žádný komplex, A^ difunduje nahoru, zachytí se až na druhé zóně) tam se objeví červený pruh koloidního zlata (negativní reakce1), slouží jako kontrola, že test je funkční : místo koloidního zlata např. organické barvivo 274 proužek s protilátkou značenou enzymem : podobné jako u koloidního zlata : primární hCG protilátkou je značena vhodným enzymem (Abj*); v místě zakotvené (Ab2b) je v reakční zóně vhodný enzymový substrát a pomocné látky vysoký obsah hCG vznikne komplex [Ab^-Ag], který difunduje a zachytí se na Ab2b [Ab1*-Ag]-Ab2b; enzym katalyzuje rozklad bezbarvého substrátu a zóna se zbarví malý obsah hCG žádný komplex, značená primární protilátka je zachycena v kontrolní zóně třetí protilátkou (Ab3b) [Ab1*-Ab3b]; druhá zóna také obsahuje enzymový substrát -barevný pruh substráty: : pro enzym POD - TMB (v kyselém prostředí) : modré zbarvení : pro enzymem ALP - fenolftalein- nebo thymolftaleinfosfátu (alkalické prostředí) : červené až modré zbarvení kvantifikace hCG pomocí ELISA sendvičová technika; druhá Ab je konjugát s POD, substrát ABTS 275 Mycobacterium tuberculosis obsah: Mycobacterium jsou acidorezistentní tyčinky, patogenní (tuberkulóza) je M. tuberculosis a M. bovis, atypická mykobakteria, např. M. Kansas/' a M. avirenia původce malomocenství M. leprae, infekční je již i méně než 10 bacilů stanovení: sputum, ranní vzorek, asi 5 - 10 ml po 3 dny za sebou, někdy i likvor, hnis, biopsie, moč; nebarví se dle Grama kultivační průkaz provedení: dekontaminace (nespecifická mikroflóra) NaOH 1 M za přítomnosti laurylsulfátu, neutralizace HCl; naočkování na půdu {vaječná s obsahem solí, asparaginu, glycerinu, škrobu a malachitové zeleně; nebo tekutá obsahující glutamát, L-alanin, kaseinový hydrolyzát, hovězí sérum aj.), inkubace při 37 °C, odečítá za 1, 3, 6 a 9 týdnů (vyřadit kontaminované půdy); při pozitivním výsledku se pokračuje určením zachycených kmenů a založí se vyšetření na jejich citlivost (rezistenci) vůči lékům; pro rozlišení M. tuberculosis od M. bovis se ověřuje schopnost tvorby niacinu, redukce dusičnanů na dusitany, citlivost vůči hydrazidu kyseliny thiofen-2-uhličité (tzv. TCH-test) a hydrolýza Tween 80; M. tuberculosismá, na rozdíl od M. bovis, uvedené testy pozitivní průkaz pomocí PCR HIV (AIDS) obsah: tělní tekutiny, virus lidské imunodeficience, retrovirus stanovení: v séru, imunochemické postupy (ELISA) 276