Genetická preventivní vyšetření u vybraných monogenně dědičných onemocnění Renata Gaillyová 2010 Fakultní Nemocnice Brno Jihlavská 20, 639 00 Brno Molekulární biologie •Metodiky využívané stále šířeji v laboratorní praxi mnoha oborů • •Využití v klinické genetice je jednou z možností využití metod molekulární biologie Diagnostika chorob na molekulární úrovni •Stále se rozšiřuje počet onemocnění s objasněnou molekulární podstatou • •Stále se zvyšuje počet onemocnění s možností DNA diagnostiky • •Stále se rozšiřuje spektrum metod využívaných v DNA diagnostice - při vyhledávání mutací způsobujících závažná dědičná onemocnění DNA analýza dědičných onemocnění •Přímá – detekce mutací – potvrzuje klinickou diagnosu • •Nepřímá – segregační – nepotvrzuje klinickou diagnosu DNA analýza dědičných onemocnění •Diagnostické testy – potvrzení klinické diagnosy na molekulární úrovni, případně potvrzení segregace patologické alely v rodině • •Prediktivní (presymptomatické) testování – onemocnění s pozdním nástupem klinických příznaků, onkologie • •Prenatální testy • Genetické poradenství a DNA analýza •Vyšetření na molekulární úrovni by vždy mělo doprovázet genetické poradenství • •Diagnostika na molekulární úrovni musí být vždy prováděna s informovaným souhlasem pacienta nebo jeho zákonného zástupce • •Výsledek molekulárně genetického vyšetření by měl být vždy interpretován erudovaným lékařem – klinickým genetikem Molekulárně genetické vyšetření •Protokolární postupy – cílené vyšetření vysoce suspektního onemocnění •Pokud možno přesná klinická dg. •Informovaný souhlas •Interdisciplinární spolupráce • (klinický lékař, klinický genetik, molekulární biolog, pacient) •Genetické poradenství před prováděným molekulárně genetickým vyšetřením a při předání – interpretaci výsledku vyšetření DNA banka •Slouží k uchování biologického materiálu, který bude možno využít v případě zavedení nových metodik, postupů či vyšetření u různých dědičných onemocnění • •Izolace a uložení DNA v DNA bance se souhlasem pacienta nebo rodiny umožňuje zachování vzácného materiálu, který v budoucnu může umožnit rodinám využít diagnostické, presymptomatické či prenatální vyšetření Genetická prevence u monogenních dědičných chorob •časná diagnostika •vyhledávání heterozygotů (AR,XR) •prenatální diagnostika •prediktivní a presymptomatické testy •preventivní léčba před rozvojem příznaků •genetické poradenství Autosomálně Recesivní •Recesivní alela na autosomu •horizontální typ dědičnosti •riziko pro sourozence 25% •poměr pohlaví 1:1 •postižení se objeví pouze u homozygotů •častější u příbuzenských sňatku • •Cystická fibrosa, Fenylketonurie, Kongenitální adrenální hyperplasie,Spinální muskulární dystrofie… • Rodokmen - AR dědičnost • Riziko postižení dalšího dítěte dvou přenašečů 25% bez rozdílu pohlaví • 50% dětí dvou přenašečů jsou zdraví přenašeči přenašečka přenašeč zdravý nemocná přenašeči zdraví Rodokmen - obvyklá situace Rodokmen - obvyklá situace Rodokmen – příbuzní partneři Rodokmen - příbuzní partneři AR dědičná onemocnění příklady •Cystická fibrosa (přenašeči 1/26) •Fenylketonurie (1/40) •Kongenitální adrenální hyperplasie – dříve adrenogenitální syndrom (1/40) •Mnohé dědičné poruchy metabolismu •Nejčastější typ vrozené dědičné nesyndromové hluchoty Cystická fibrosa •Lokalizace 7q •Frekvence nemocných v ČR cca 1/2000 – 1/4000 •Frekvence přenašečů v ČR cca 1/25-1/29 •Gen zmapován v roce 1989 •V roce 2002 známo 1002 mutace •V současnosti známo cca 1500 mutací v CFTR genu Klinické příznaky •Respirační trakt •GIT •Iontová dysbalance, zvýšená koncentrace chloridů v potu •Poruchy reprodukce •Poruchy růstu Průběh onemocnění •Typické formy • •Atypické formy Přirozený průběh •V době stanovení diagnosy průměrný věk 6-8 měsíců, 66% do 1 roku •Závažnost limituje především postižení plic •Medián přežití v roce 1976 - 18 let, v roce 1995 - 30 let, od 1990 velmi malé zlepšení •Klinická heterogenita na základě mutací CFTR genu •10/2009 – novorozenecký screening CF • Strategie genetického vyšetření •F508del - 68,8% •6 mutací - cca 80-85 (90 a více???)% •R117H, IVS8polyT – vztah k mužské sterilitě •36 mutací - cca 95% •skrínovací metody + sekvenace •nepřímá DNA analýza • Nejčastější mutace v CFTR genu 0 % 0,37% E92X 0,37 % 0,55 % W1282X 1,29 % 0,74 % R347 P 0,37 % 1,11 % 2143 del T 0,37 % 2,04 % 1898+1 G-A 5,56 % 2,22 % G542X 1,11 % 3,02 % N1303K 1,85 % 4,03 % G551D 5,56 % 4,64 % CFTR dele 2,3 70,32 % 68,8 % F508del OLG Brno Czech Republic Mutation Genetické poradenství u CF •Retrospektivní - po porodu dítěte s cystickou fibrosou - riziko opakování pro dalšího sourozence 25% bez rozdílu pohlaví • •Prospektivní - prevence prvního výskytu CF - steriliní a infertinlí páry, příbuzní partneři, vyhledávání dalších osob v riziku - přenašečů v CF rodinách • •Novorozenecký screening CF – 2009 SMA •5q12.2-13.3 - gen SMN1 •typ I, II a III • •vyhledávání homozygotů - nemocných - časná postnatální diagnostika •prenatální diagnostika •vyhledování přenašečů Příbuzenské páry •Riziko především vzácných autosomálně recesivně dědičných onemocnění X- Recesivní •postižený je většinou muž, jeho synové jsou zdraví a dcery jsou přenašečky onemocnění •ženy-přenašečky mají 1/2 synů nemocných a 1/2 dcer přenašeček •vzácně výskyt u žen - dcera postiženého muže a ženy přenašečky, ženy s karyotypem 45,X, 46,XY, female…. Rodokmen X- recesivní dědičnost • Žena přenašečka má 50% nemocných synů a 50% dcer přenašeček • Nemocný muž má všechny syny zdravé a všechny dcery přenašečky X XY XX X XY XR – příklady onemocnění •Hemophilia A and B •Duchenneova/Beckerova svalová dystrofie • • •Syndrom fragilního X chromosomu • (X-vázané onemocnění) Duchenneova/Beckerova svalová dystrofie •XR, lokalizace Xp21 •incidence u chlapců asi 1/3-6 000 •dystrofinopathie - chybění proteinu dystrofin ve svalových buňkách •DMD -progresivní dystrofie, úmrtí kolem 20 roku věku •BMD - pomalá progrese DMD/BMD •molekulárně genetické vyšetření - 60% mutací jsou velké delece •vyhledávání žen přenašeček - nepřímá DNA diagnostika, neurologie, UZ, emg, biochemie ( JT, CK), svalová biopsie, RNA dg. imunohistochemické vyšetření, FISH • •prenatální dg. Duchnneova/Beckerova svalová dystrofie (Xp) •časná diagnostika • •vyhledávání přenašeček • •prenatální diagnostika • • Možnosti vyšetření pacientů DMD/BMD •přímá DNA analýza genu pro dystrofin syntézou 19 exonů dle Abbse 1991 (oblast Pm, ex 3, 4, 6, 8, 13, 19, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 60) •nepřímá DNA analýza s využitím intragenových polymorfních míst STR44, STR45, STR49, STR50,5´(CA)n,3´(CA)n •MLPA – detekce delecí a duplikací •RNA analýza svalové tkáně, reverzní transkripce, PCR, sekvenční analýza •PT test •od 2006 DHPLC u probandů bez delece a RNA • Možnosti vyšetření potenciálních přenašeček •nepřímá DNA analýza •mRNA ze svalové biopsie •real time PCR využívající fluorescenčních sond a koamplifikace referenčního genu •FISH - detekce delecí v genu pro dystrofin - sondy Cytocel (ex 3-6, 8,12,13,17,19,32-34,43,44,45,46-47,48,50,51,60) •MLPA – detekce delecí a duplikací Prenatální diagnostika DMD/BMD •volba pohlaví • •přímá DNA analýza detekce delecí genu pro dystrofin u plodu mužského pohlaví •nepřímá DNA analýza •FISH delecí genu pro dystrofin •vyšetření delecí a duplikací metodou MLPA •Preimplantační genetická diagnostika (IVF) – FISH, DNA analýza •svalová biopsie plodu • Hemofílie •časná diagnostika •vyhledávání žen - přenašeček •prenatální diagnostika •specializovaná péče o gravidiní - přenašečku Hemofílie, perninatální péče na specializovaném pracovišti, informovaný ošetřovatelský tým Hemofílie •Hem A - Xq28, deficit f VIII •frekvence cca 1/5 000 chlapců • •Hem B - Xq27.1-27.2, deficit faktoru IX •frekvence cca 1/25-30 000 chlapců Autosomálně Dominantní •dominantní mutace na autosomu •vertikální typ dědičnosti •postižení většinou heterozygoti •riziko opakování pro potomky a sourozence 50% bez rozdílu pohlaví •často nové mutace, variabilní expresivita, neúplná penetrance • Rodokmen - AD dědičnost • 50% riziko pro děti nemocného bez rozdílu pohlaví • • Děti zdravého jsou většinou zdravé zdravý nemocný AD dědičná onemocnění •Myotonická dystrofie I a II •Neurofibromatosa •Huntingtonova choroba •Syndrom prodlouženého QT intervalu – dědičné arytmie srdeční •Leidenská mutace v genu pro f V – dědičné trombofilie Preventivní vyšetření - LQT syndrom •10% nosičů mutace má během života klinické potíže, první projev onemocnění může být náhlá srdeční srmt • •diagnostika •vyhledávání nosičů mutace v rodinách •preventivní terapie positivně testovaných na kardiologii •prenatální diagnostika - málo využívaná AEC syndrom Ankyloblepharon, ectodermal dysplasie, cleft lip/palate • •Autosomálně dominantní dědičnost •Erose ve vlasaté části hlavy, hypoplasie mandibuly, převodní porucha sluchu, atypický tvar ušních boltců, ankyloblepharon, atresie slzných cest, sporé obočí, řasy, rozštěp patra, rtu, anomálie dentice, srdeční vady, syndaktile 2-3 prstu DKK, zarudnutí jemné kůže, hyperkeratosy, hyperpigmentace, částečná anhydrosa – hypohydrotická ektodermální dysplasie, dystrofické nehty, jemné sporé ochlupení a vlasy, normální inteligence. Trombofilie •trombembolických příhod a u Preventivní vyšetření v rodinách s positivní anamnesou pacientek s opakovanými fetálními ztrátami • •preventivní vyšetření a dispenzarizace na hematologii, předoperační vyšetření apod., vyšetření příbuzných •Preventivní péče v gynekologii v graviditě Leidenská mutace G1691A f V •frekvence v bílé evropské populaci asi 5 - 9% •AD dědičnost •zvýšení rizika trombembolismu u homozygotů 50-100x, u heterozygotů 5-10x •asociace s rizikem časných fetálních ztrát není potvrzena •zvyšuje riziko fetálních ztrát od konce I. trimestru, ve II. a III. trimestru • G20210A f II Prothrombin •v heterozygotním stavu se mutace vyskytuje asi u 2-3% populace •zvýšení rizika trombembolismu •nosičství je spojeno se zvýšeným rizikem fetálních ztrát, abrupce, preeklampsie, IUGR •riziko časných SA není potvrzeno