BAC/PAC knihovny a jejich využití pro FISH techniku Metody používané v Laboratoři molekulární cytologie a cytometrie BFU, Brno Co to je? • BAC (Bacterial Artificial Chromosome) • PAC (P1 Artificial Chromosome) • YAC (Yeast Artificial Chromosome) • uměle syntetizovaná plazmidová DNA, kterou lze vložit do „organizmu" • vektor x klonovací vektor y AC systémy • podílely se na mapování lidského genomu • klonovací kapacita až 500 Kb, mohou nést celé lidské geny • v kvasince se udržují relativně stabilně v 1 nebo více kopiích • ale při manipulaci problémy (nestabilita, přeskupování DNA, tvorba chimér s cizorodou DNA, malé výtěžky), nižší účinnost transformace BAC systémy • struktura odvozena od F-plazmidů bakterie Escherichia coli • klonovací kapacita 50-350 Kb • v buňce v nízkém počtu kopií (1-2) • vysoká strukturální stabilita v buňce E. coli, schopnost udržet vloženou DNA, snadná manipulace s DNA • snadná izolace díky kruhové plazmidové struktuře (alkalická lyže, sloupcová chromatografie) • tvorba chimér méně častá než u YAC BAC systémy dobrá izolace díky selekčním znakům (př. gen pro rezistenci na antibiotika, přítomnost lacZ) vektory dále obsahují: místa pro reštrikční enzymy, geny pro regulaci par A a parB, klonovací místa (H/ncřlII, ßamHI) Aatlí cp& SalK parB \ parA ""Ampi pFOSl 9.5 kb repE oris/ \ Bacterial F" plasrrid Is cu: wilhín tocľgene wiih restrictior enzymes r v Fř plasmid jnd gene of interest I Gene of interest is etfoutuíing restriction enzyme Rŕr k ŕlfH-trrtpňntwl in1n F rn/icŕlk 4 Gels are plated on X-gat/ PTG medium White colonics ůrc composed o* transformed lacZ 'cells PAC systémy • 1. vektor odvozen od bakteriofága Á (nebyl vhodný pro mapování savčího genomu) • proto vyvinuty P1 vektory a PAC systémy (odvozeny od temperovaného fága P1) • P1 vektor se skládá ze 2 domén: adenovirový fragment (plní fágové kapsidy DNA) a P1 lytický replikon (spouští amplifikaci plazmidové DNA) PAC systémy - 2 • PAC systém má místo adenovirového fragmentu plazmid pUC povahy (zvyšuje výtěžek DNA) • je to kombinace P1 vektoru a bakteriálního vektoru • klonovací kapacita 130 -150 Kb • menší stupeň chimérizmu (jako u BAC), vyšší účinnost transformace, ale složitější příprava vektorů Využití klonovacích vektoru • fyzikální mapování, analýza a sekvenace nejen savčího genomu • príprava DNA sond • detekce různých poruch genetické informace (delece, inzerce, ...) «_ ,,.., x ' kliniď • detekce nádorových buněk «— využľ • studium struktury chromatinu v bunkách • tvorba genomických knihoven Genomické knihovny • zásobárny klonů s různými vloženými úseky sekvenovane genomické DNA • konstrukce knihoven: různý postup v závislosti na typu vektoru • hledání v knihovnách: pomocí sond a) pro vyhledávání sekvencí DNA b) pro vyhledávání produktů hledaných genů Konstrukce BAC knihoven • linearizace vektoru restrikčními enzymy a ligace s naštěpenou genomickou DNA • produkt elektroporací vnesen do E. coli a transformanty selektovány na plotnách s antibiotikem nebo IPTG a X-gal • vybrané transformanty jsou řazeny do mikrotitračních destiček • vektory pomnožovány v kmenech E. coli s poruchou rekombinace (DH5a, DH10B) Klonování do BAC vektoru • asi nejpoužívanější je vektor pBeloBAC11 • postup: linearizace vektoru, ligace s fragmenty genomické DNA, elektroporace nebo chemická transformace do E. coli • selekce a uchování (LB médium s antibiotikem a 30% glycerolem na -70^ nebo vpich do média při RT) • izolace DNA z transformantů její analýza (PFGE, PCR) Vektor pBeloBACll (klastr globinových genů) 5'HS: 5 4 3 2 1 -ia -10,9 -214 -14,7 -6,1 PAC 4396 (ISO Kb) I-----//- 5 HS: 1 +21,8 I , 1 : GV AT f P 5 P BAC 4396-44 (100 Kb) j_ Sail Sua BI Xliol Xbal EcoRV -II- -H EcoRV Schema klonování do PI vektoru piKti-iicki ]!hlA tutíťiMBíprrj LfpJikHin proanoLor i K4MKI Uiif-ail jmnnn Usnil D ._ . íninnmiy ^ 10014 TchF pív taP j+i2irtsV-ii'/ŕ(#Jlk*il 3E ktiptí rtplftaťipd idcncvirovV "HuJTo" Y,*f -.1 iľ:i lhj.j.K.lť! UpcivefclDmPl ílilígŕpiŕJä ik'Iiii :■ k.i..F:i, í hnil IJSn r^liknnH Hostitelská buňka Escherichia coli (G-, Enterobacteriaceae) vhodný modelový organismus protože: - je dobře znám jeho genom - nenáročně se kultivuje, rychle roste, produkuje početné potomstvo - obsahuje F-faktor (konjugativní plazmid o velikosti 100 Kb, který odpovídá za přenos genetické informace z F+ do F- buňky), v buňce je ve 2 formách (plazmid a Hfr) r+ F- f-------"■{ /------N ŕ-------■■•.?-------\ ^____s V____J V—\ F+ F+ /-----\ ŕ-----"^ \___A___J V___J V.___> Příprava DNA sondy • nejprve izolace DNA z příslušného BAC nebo PAC vektoru pomnoženého v E. coli • izolace klasickou metodou s vlastními roztoky nebo izolačním kitem • izolace kitem je výhodnější (větší výtěžek, odstranění bakteriální DNA) Schéma izolace DNA pomocí QIAGEN Large Construct Kit - lyzační pufry rozruší buňky - isopropanol vysráží DNA - etanol přesráží DNA - kolonky odstraní bateriální DNA a RNA - následuje měření velikosti a čistoty DNA pomocí gelové elektroforézy a spektrofotometrie QIAGEN Large-Construct Kit Proceduře Pelleted bacteria i Alkaline lysáte I CT9 Clear lysáte isopropanol precipitate £t^ Collect DNA by centrifuga t ion 1 Exonuclease digestion Bind DNA Wash Elute Y I Isopropanol precipitate Collect DNA by centrifugation * Genomic DNA-free ultra pure pi asm id DNA Nick-translace • vlastní příprava sondy inkorporací např. digoxigeninu do DNA • nick-translační kit obsahuje 2 enzymy: - DNáza I - E. coli polymeráza I • každý 20.-25. nukleotid je modifikován DIG-dUTP • vznik fragmentů o velikosti 200-500 bp DNA po izolaci (pBeloBACH) — bakteriální DNA 1 plazmidová DNA 200-500 bp Cot-1 DNA • v lidském genomu jsou rozptýlené repetitivní sekvence SINEs, LINEs (např. Alu-elementy, L1-elementy) • tyto repetice jsou obsaženy i v DNA sondě • competitor DNA - lidská placentální DNA obohacená repetitivními sekvencemi • repetitivní elementy sondy hybridizují s přebytkem repetic na COT-1 DNA • nejvíce specifická místa na sondě zůstanou volná (jednořetězcová) pro hybridizaci na cílovou DNA • potlačuje hybridizaci sondy na repetitivní sekvence Dři FISH a zvýší se tak specifičnost (přesnost) lybridizace Stručný návod k použití Cot-1 DNA ke 120 ng značené DNA přidat 6 ug Cot-1 doplnit salmon sperm DNA do mn. 20 ug přidat 1/10 objemu 3M octanu sodného a 2 objemy 96% etanolu (-20*0) promíchat, inkubovat 30 min při -ľO'C centrifugovat 15min/13000 rpm, slit supernatant promýt DNA 400 ul 70% etanolu (-20*0) centrifugovat 5min/13000 rpm, slit supernatant sušit pelet a rozpustit ve 20 ul hybrizolu (50% formamid a 2xSSC) FISH (Fluorescenční In Situ Hybridizace) • metoda stanovení lokalizace specifických sekvencí DNA nebo i celých chromozomů v buněčných preparátech • princip spočívá v navázání značené denaturované DNA sondy na komplementární místo cílové denaturované DNA • druhy DNA sond: místně specifické (genové), celochromozomove, telomerické, centromerické • typy DNA sond: - oligonukleotidove (chemicky syntetizované) - jednořetězcové (RT-PCR, PCR) - dvouřetězcové (BAC, PAC, YAC klony) - RNA sondy • přímé a nepřímé fluorescenční značení • duální barvení, SKY (spectral karyotyping), multicolour FISH, opakovaná hybridizace • rozsáhlé klinické využití (prenatální diagnostika, cytogenetika nádorů) DOP-PCR semi-degenerate oligonucleotides (CGACTCGAGNNNNNNATGTGG) that bind at a low annealing temperature. N:A,T,G, C R:A,G, Y:C,T M: A, C K: G, T S: G, C W: A,T V: G, A, C D: G, A, T H: A, T, C B:G,T,C fragments that are in average 400-500 bp, with a maximum size of 3 kb, although Kittler and coworkers reported a DOP-PCR method that was able to produce fragments up to 10 kb. nepřímé značení - protilátka Nej častej i používané látky • nepřímé značení DNA sondy: ligandy typu digoxigenin, biotin • protilátky: Rhodamin-anti-DIG, Fluorescein-avidin, FITC-avidin • barvení jádra: DAPI (4',6-diamidin-2'-fenylindol), TO-PRO®-3 iodide, PI (propidium iodide) • přímé značení DNA sondy: Spectrum Orange, Green, Red,Cy3, Cy5 ... SKY tec "i HilH'tUOlJI e 7 e 9 id 11 iz tl 1! il (l ft M % U 14 1!> lq 1/ lb »1 91 •• «t U 19 20 21 22 ;í www.genome.gov Duální barvení ^^r^ W " i umístění ß-globinoveho genu (červené signály) v rámci chromozomálního teritoria chromozomu 11 (zelené signály) u lidských leukemických buněk K562 Opakovaná DNA/DNA hybrídízace lastr globinových genů chromozóm 11 centromera chromozómu 1 Pacific jellyfish, Aequoria victoria Sad Sac II RSV-LTRM supF ^^^t ^^k Ncol CMV ^^ Sací / Hindlll Xmnl T7 \í /xbal -^^ícoRI Sacll ' amp . oři intron \ ¥ pCMV-GFP-LpA ' 1 51 77 nt i GFP Ě SV40 W$*^ LpA J0 T3 >^jr Kpnl Khol Sail (2291) Hindlll ^^Bglll p^Pstl Ncol =^Styl Ncol Immunocytochemistry Enzyme substrate Avidin-Biotin Enzyme ßiotinylated 2° Ab Complex ■CiTai-1-link Lhr-amtJlin ianicotiori fo Sftie-o-r CKromnrin Im rnufioprncipilnl» * An*i-Hi»tůfrt * A n* i-Ira n mri p rio*i Fort o r •Mt -Mt >*' I f.-ň.ŕi-Xf, C,.-.j-,.I,, l, h»n[y DNA Oí^c^ 1 v Dritten ■"OuaMilar*** PCft RT-PCR (B3A2) > 3 BS ß- actin ^ X * H O n r í.n Ul 2Í ON ON ON > O N> t>> -I 447 bp 305 bp 239 bp