Buněčná diferenciace a struktura chromatinu Buněčná diferenciace je proces při kterém buňky získávají nový fenotyp, který je spojen se specifickou buněčnou funkcí. Pro daný buněčný typ Je charakteristická aktivace skupiny genů, které jsou zodpovědné za terminálni diferenciaci. Epithelial cell Nerve cell Muscle cell Quiescent cell i- "i « S phase Proliferation Cell Cycle G1(G0) phase G£ phase M phase Cell Growth and Differentiation Cell Differentiation Cell Growth TIME INTERPHASE DNA/Histo- D I N _ ť '- si E - 3 C £ V - U ÍC '- - Ěh 0 NaBt 24h GO/1 - 71.1% S = 15.6% G2-M = 13.3% V. aj BO SO Cannels (FL2-A) 150 Cannels (FL2-A) sub-Gl NaBt72h GO/1 - 83. S =4. G2/M = 12 0% 4% 6% r 120 Cannels (FL2-A) ■n 1E0 Al Al a 3 S 2 a V* es ./^~*^ CONTROL ■ NaBt 72 h í ^*fcta. sĚWSU CONTROL Gl = 57.2% S = 17.8% G2-M = 25.0% B2 NaBt 72 hours Gl = 75.1% S = 18.2% G2-M = 6.7% 30 60 90 120 150 Channels (FL2-A) 90 120 150 Channels (FL2-A) 6h 24 h 48 h 72 h n *** *. * " p27KTP1 (27 kDa) Cycli Dl (34 kDa) Total protein level C NaBt C NaBt C NaBt C NaBt CONTROL it- 7? N alii 24h n ?a SjiISi 72h n-53 C-MYC transcript HSA8/C-MYC gene OVERLAY RNAP II / c-myc 9 Nucleoli/c-myc ^^^^m v ^^H] SC35 / c-myc PML / c-myc hESCs hESCs/RA i . -h- / ■ * » - r í HUES-9 HUES-1 MEFs C RA C RA C RA • - OCT3/4 (45 kDa) Endo-A (50 kDa) Total protein level (Bártová et al., Differentiation, 2008) (Bártová et al., Developmental Dynamics, 2008) H3Kna-w f. ve:»>*wcí» R.,vn.,,.l Bimmi/iCCBS CornroÖOfil Thymus f" \ © \ hůsT«s«i -í «- umo Pbtf**r, Peripheral blood Fit I, I hmir. of blood «IK thrir Ar** Morphology of human leukemic promyelocytic cell line HL60 and neutrophilic granulocyte Sex Chromatin MultMobed Nucleus Azurophilic Granules Bone marrow "-.'•- ľ.,- ■ £Ö Myeloblast WaooctMOB •S- Promyelocyt Baso phi f Monoblast Metamyelocyte r*, *(jS Reocukxyiefv Band form t EryB'OCyio PWPhwalbteod Segmented form Monocyte v. Degenerate form Lymphatic system Gomrmtojl «fmcea i MflOBtar>na-w f. ve:»>*wcí» R.,vn.,,.l Bimmi/iCCBS CornroÖOfil Thymus f" \ © \ hůsT«s«i -í «- umo Pbtf**r, Peripheral blood Fit I, I hmir. of blood «IK thrir Ar** Beta-like globin gene cluster PAC 4396 (180 Kb) I—//-BAC 4396-44 (100 Kb) ,_ 5'HS: 5 4 3 2 1 , -18 -10,9 5 H^: 1 -214 -14,7 -6,1 +21,8 1 < 1 , I £ GY AT f P 5 P I T7-*-h«-SP8 V s- Arrayed on chromosome 11, encodes one embryonic (e) and two fetal (Gy, Ay) and two adult (8, ß) globin chains. Expression of ß-like genes undergoes a developmental related switching mechanism: 8: expressed in early embryo fetal y: fetal life. 8, ß: adulthood. Changes in ß-like gene expression acompany erythoid cell differentiation D B3A2 28S rRNA 6000 bp 18S rRNA ^1 i 500 bp E o .^ in ON > 5 B3A2 O >d > -j N! B RT-PCR (B3A2) 2 3 4 5 6 ö > 3 &5 ß- actin 447 bp 305 bp 239 bp 2 s H w O n r cyi Ul 2: ON ON ON > O N> K> 595 bp 544 bp 447 bp 305 bp 239 bp n o H O r öd r i H O O Ö 2 n ft acetyl H3 (K9) di-mH3 (K4) di-mH3 (K9) o o H O F n o H O F n o H O F Bártova et al., Figure 5 210 kDa 135 kDa 65 kDa 45 kDa 1 2 3 4 5 6 — — • «i • m\ «—» « •» -• «• w H O *o O C/5 3 n o X! > Bcr-Abl c-Abl Lamin B Cleavage "*** fragment Total protein level E Acetyl H3 (K9) ÉM* H - Lamin B m Cleavage fragment di-meH3(K9) m—mm «M as *3 Total protein level > o ^d BD H H O ■o O in 3 Bártova et al., Figure 7 ZAVER Diferenciace je charakteristická nejenom specifickými změnami na úrovni morfologie buněk, ale významně se mění i struktura chromatinu. Tyto změny v genomu mají velký význam z hlediska aktivity genů a množství jejich proteinů. Tyto všechny uvedené buněčné faktory určují vznik daného buněčného typu. RNA interference = RNA interferencia (RNAi) Princíp: biologický proces, v ktorom molekuly ssRNA o veľkosti 20-25 nukleotidov sa zúčastňujú pri post - transkripčných génových reguláciách a v procese formovania štruktúry chromatínovej História: 1990 - skupina Richarda Jorgensena experiment za účelom zvýraznenia purpurovej farby petúnie - po vnesení extra kópií zodpovedného génu pozorovali opačný jav, ktorý nevedeli vysvetliť 1998 - Andrew Z. Fire a Craig C. Mello dsRNA injektovaná do Caenorhabditis elegans spôsobovala „umlčanie" súhlasných génov 1999 - Benitecs Graham ukázala všeobecnosť javu RNAi a vytvorila DNA konstrukty, ktoré spúšťajú proces RNAi v ľudských a živočíšnych bunkách 2006 - Andrew Z. Fire a Craig C. Mello získali Nobelovu cenu objavenie,že dsRNA vyvoláva supresiu génovej aktivity, spôsobom homologickej závislosti v procese RNA interferencie dsRNA viral replication precursor miRNA <— ——O I dicer dicer effector complex: RITS RISC RISC ^ 1 \ genome n£>. mRNA HKJA TTT TTT___^^RNA 5- TTT_____________JT£_ y DNA/histone methylation mRNA degradation translation block RNA interference in mammalian sysfems ■ i bantounas find others 21-base target site Target mRNA sequence a. b' . « < ACAftRAUUCfiAftGTlQCG13PSCUAGUACCAftOCCUAUUUUCftüü. ^3* i Double mi deed de a verhäng Sense strand (21 ba&») b 04P-CaJGCCÜUCCU,A?UACCÄACTT-OH I ] I I I I I I I I I I I I I I I I I 3, HO-TTGACGGAA£]GAi;CÄUGGtIÜG-P04 A n t i sense strand (21 bas«) Double dT overturns Essential 5* phosphate group (comp! Bftientary to the bednning of the target itq uwice1 n riRJN A) Hairpin loop sense Antisense ... GFP cassett 3'LTR amp K Puc ori 552 I BAffTOUNAS and others ■ RNA interference in ms m marts n systems (A) Si ■- \nliiTiLjp Vinili ^^j Ijidf, S|rall) 3 Tin UUUUĽ (B) ,„ ,,, ífenw AnlhHbr «*irHI Strand UÍ* HI sr„M 31J J I ■ » 1 iimr Grafická predstava Adenovirus carrying shRNA vector Encapsulated & modified siRNA Lipofection Hydrodynamic tail vein Sa? ym^ 7^ / siRNA complcxed with RISC ty^fh Degraded mRNAs Plasmid vector carrying shR