Co potřebujeme k tomu, abychom mohli studovat funkci proteinů? •Dostatek informací •Vhodné metody •Počítat s postranslační modifikací •Nespokojit se s již publikovanými informacemi •Počítat s existence více-funkčních proteinů Funkce proteinů Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. Enzymatická/enzymy/katalýza Receptorová/ alizace/ Přepravní/transportní/vazba-transport Strukturní/zpevňovací/strukturní komponenty/ Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní 91 Metody Dostatek znalostí o proteinu Funkční protein Zviditelnění proteinu Kvalita proteinu Hledání interakčního partnera Kvantifikace interakce Detailní popis interakce studia funkce proteinů Metoda Bioinformatika (analýza proteinu, práce s literaturou) Exprese a purifikace proteinů SDS-PAGE/Western blot/fluorescenční a elektronová mikroskopie/detekce aktivity enzymu na gelu/MALDI/2D-PAGE CD spektroskopie/měření turbidity/DLS Substrátová specificita/Dvojhybridní kvasinkový systém/vrstevní značení/imunoprecipitace/TAP tag technologie Měření kinetických parametrů pomocí spřažených enzymových reakcí/radioaktivně značených látek/ kosedimentace/nepřímá ELISA Krystalizace/NMR analýza/cílená mutageneze/ řízená evoluce/modifikace proteinů (fosforylace, nitrosylace, glykosylace)/molekulární modelování proteinů. Postranslační modifikace proteinu i(S,T,Y,H,D,K,R) Glykos (pentosy, deoxyhexosy, hexosaminy, hexosy, N-acetylhexosaminy, kyselina sialová) i (myristoylace, stearoylacejarnesylace, palmitoylace, geranylgeranylace, kyselina lipoová). • Nitrosylace (C) i (C) - disulfidové můstky Methylace, formylace, acetylace •Deamidace (Q,N)/carboxylace (E/D) -p •Biotinylace •Pyroglutamová kyselina (QQ) -p Chemická stabilita fosforylovaných aminokyselin Stabilita - prostředí Fosfoaminokyseliny Kyselé Zásadité Fosfoserine + _ Fosfothreonine + ± Fosfotyrosine + + Fosfoarginine - - Fosfohistidine - + Fosfolysin - + Fosfát kyseliny asparagové - - Klumpp, S.; Krieglstein, J. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 1067. Table i: Selected examples of catalytic promiscuity in a single enzyme. Enzyme Enzyme class Normal activity Promiscuous activity proline aminopeptidase metallohydrola5e (two C— N hydrolysis in proline amides P— F hydrolysis in diisopropyl fluorophosphate Mni+ centers) Lirrincpeptidjse metullchydrolase (two C—M hydrolysis in amides P—O hydrolysis in bi s -p -n itr c ph e n y 1 ph c s ph ate Zni+ centers) pyruvate kinase metalloenzyme [ivin-1, pho5phoryl transfer from phosphoe- sulfuryl transfer from suIfoenolpyruvate; also K+, Mg2"1" centers] nol pyruvate pho5phoryl transfer to fluoride, hydroxylamine, or a-hydroxycarboxylic acids D-5uccinylbenzoate syn- metalloenzyme (Mn2* dehydration of 2-hydroxy-G-succinyl- racemization of W-acylamino acids thase center) 2,4 -cy cl oh ex ad i en e car boxy 1 ate methane monooxyge- non-heme diiron hydroxylation of methane epoxidation, N-oxid e formation, dehalogenation, na5e desaturation of benzylic substrates plant 5teroyl acyl carrier non-heme diiron de5atu ration of the C9—CIO link in sulfoxidation of 9-thia or 10-thia analogues of protein A. desaturase stearic acid to give oleic acid 5tearate and the hydroxylation of 9-flu or o analogues cephalosporin C synthase metalloenzyme (non-heme Fe center, 2-oxo-gl u tar at e-d epe n d ant) oxidative ring expansion of the five-membered ring to a six-membered, hydroxylation of a methyl group one of the two normal activities lipase, esterase serine hydrolase ester hydrolysis fj-lactam hydrolysis lipase, chymotryp5Ín serine hydrolase triglyceride or peptide hydrolysis aldol addition or Michael addition s u bti 1 i s i n serine hydrolase peptide hydrolysis 5ulfinamide hydrolysis lipase, trypsin serine esterase triglyceride or peptide hydrolysis oligomerization of (Si[CHj)2(OEt)j), dimeriza-tion of Si(CH,)jOCHi pepsin aspartate hydrolase amide hydrolysis sulfite hydrolysis asparaginase Thr-Ly5-A5p triad C—N hydrolysis in asparagine to give aspartate C=N hydrolysis in ß-cyanoalanine to give aspartate epoxide hydrolase A5p-HÍ5-A5p triad hydrolysis of epoxides with inversion of configuration hydrolysis of epoxides with retention of configuration oxynitrila5e Ser-HÍ5-A5p triad addition of cyanide to aldehydes addition of cyanide to imines aldolase catalytic anti- Lys aldol reaction Kemp elimination body serine hydroxy m ethyl- py ri doxal -d ependent transfer of C, of serin e to tetr ah yd rop- threonine retroaldol reaction, decarboxylation of tran5fera5e ier oyl glut am ate aminomalonate, racemization of alanine, transamination of alanine and pyruvate pyruvate decarboxylase th i am i n e-d epe n d ent decarboxylation of pyruvate acyloin condensation of acetaldehyde and ben- zaldehyde Funkce proteinů Enzymatická/ / Receptorová/ Přepravní/ ransportní/ Strukturní/zpevňovací/í Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitr regulace Zásobní n/ti IV. Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. 91 Skupina EC1.x.x.x Oxidoreduktázy EC2.X.X.X Transferázy EC3.X.X.X Hydrolázy EC4.X.X.X Lyázy EC5.X.X.X Isomerázy EC6.X.X.X Ligázy Katalyzovaná reakce Katalyzují reakci oxidační/redukční; přenáší atom H nebo O z jedné sloučeniny na druhou. Přenáší funkční skupinu z jedné sloučeniny na druhou. Skupina může být methyl-, acyl-, amino- nebo fosfátová skupina Vytváří hydrolýzou ze substrátu dva produkty. Nehydrolytické přidání a nebo odstranění skupiny ze substrátu. C-C, C-N, C-0 or C-S mohou být štěpeny Přeskupení uvnitř molekuly - isomerizace. Spojení dvou molekul spolu pomocí syntézy vazeb C-O, C-S, C-N or C-C s paralelním uvolněním ATP Typická reakce AH + B^A+BH (redukce) A+O ^AO (oxidace) Příklady enzymů s triviálními názvy Dehydrogenázy/ oxidázy AB + C^A+BC AB + H20 AOH + BH Transamináza/ kináza Lipáza, amyláza, peptidáza RCOCOOH -► RCOH + C02 Dekarboxyláza AB^BA Isomeráza/mutáza X + Y+ ATP -► XY + ADP + Pi Syntetáza ß-glukosidaza Zm-p60.1 EC 3.2.1.21 Quercetin, Naringenin, Daidzein, Resveratrol, Luteolin Nová metoda pro studium kinetických parametrů vzácných glukozidů Velmi rychlá procedura (doba měření 3s) Citlivost 100 nAA glukóza Mala spotřeba vzorku (reakční objem 150 jáJ) Amplex Red Re&orufin ^oh Peroxidase ho^^^^o r xw (^ C CH, ľ\ ■*> , H202 CH2OH ) O HO -O -*r Glucose Oxidase hó oh C H „OH "H Comparison of metods for determining catalytic rates 200 400 600 800 1000 3000 10000 c PNPG (uM) Pavel Mazura 'rogram Origin 4- 3- co 1 - 0 Vyhodnocení kinetických parametrů hydrolýzy zeatin-O-glukozidu E + P • Km = Michaelisova konstan í • Kcat = rychlost katalýzy (číslo přeměny) Kcat/Km = konstanta specificity Model: Km,kcat ChiA2/DoF = 0.06605 RA2 = 0.95738 Km 697.4338 ±41.30139 kcat 4.58546 ±0.08916 tel T T T ---1----'-- 0 2000 4000 6000 IE = enzym S = substrát ( C ZOG (JVI) ES = enzyme-substrát komplex (přechodný stav) P = produkt 8000 —l— 10000 Pavel Mazura P2 (F193A, F200K, W373K, F461L) P3 (F193A, F200K, W373K, F461L, T189V, D256S, M258A, A462D) P4 (F193A, F200K, W373K, F461L, T189V, D256S, M258A, A462D, Q188W, R331F, P372A, E466A) F193A, F200K, W373K, F461L Jiří Damborský a Pavel Mazura Vícenásobná mutantní analýza enzymu 185 230 215 230 wavelength |nm] 245 Vzdálená-UV spektra cirkulárního dichroismu divokého typu a jeho mutant P2, P3andP4. 230 P2 (F193A, F200K, W373K, F461L) P3 (F193A, F200K, W373K, F461L, T189V, D256S, M258A, A462D) P4 (F193A, F200K, W373K, F461L, F189V, D256S, M258A, A462D, Q188W, R331F, P372A, E466A) Radka Fohlerová íodelování enzym-substrát komplexu R331 W373 Pohled do aktivního místa mutantu F193A (a) s vazbou substrátu (v tomto případě se jedná o MUG). a (b) Petr Jeřábek inetické parametery původní ß-glukosidazy a jejích mutantů pNPGlc Enzyme Kry ^cat kcat/K, cať J^-m WT 0.68 ±0.03 42.80 ±0.56 63.0 F200K 3.50 ±0.22 2.43 ± 0.05 0.7 W373K 2.10 ±0.21 0.63 ± 0.02 0.3 F461L 0.65 ±0.05 49.27± 1.15 75.8 F193A F193V F193I F193Y F193W 0.045±0.0035 0 1.76±0.06 1.29±0.01 1.61±0.17 0.22 ±0.003 0 0.84 17.3 31 4.9 0 0.48 13.6 19.5 MUG WT 0.148 ±0.013 53.60 ±1.09 362.16 F200K 1.510 ±0.101 1.87 ±0.05 1.24 relative efficiency 100.0 This work 1.1 This work 0.5 This work 120.3 This work 7.8 0 1 21.5 30.9 This work Verdoucq et al. 2003 Zouhar et al. 2001 Zouhar et al. 2001 Zouhar et al. 2001 100.000 This work 0.342 This work W373K 1.736± 0.125 0.22 ±0.01 0.127 0.035 This work F461L 0.164± 0.019 70.88 ±2.16 432.19 119.337 This work F193A 0.120 ±0.012 1.29 ±0.04 10.75 2.968 This work F193V 0.23±0.1 3.4±0.8 14.8 4.1 Verdoucq et al. 2003 F193I 1.23±0.08 23.2±0.86 18.9 5.2 Rotrekl et al, unpublished result F193Y 1.22±0.24 68.4±4.9 56.1 15.5 Rotrekl et al, unpublished result F193W 1.34±0.015 34±1.78 25.4 7.0 Rotrekl et al, unpublished result IPTG lOOuM Pavel Mazura Detekce aktivity enzymu na gelu — Dimer-modifikace? — Monomer-nemodifikovaný? Divoký typ a mutanty byly analyzovány na dvou paralelních gelech 10% nativním PAGE. První gel (A) byl barven pomocí Commassie modře. Radka Fohlerová Je to dimer????? Activity in gel staining 10% NATIVE PAGE Native western blot in »»vi ir'idiii Mr 5 kPa (hypoxie pod 3,5 kPa). Bohrův efekt je soubor jevů vycházející ze skutečnosti, že oxyhemoglobin je silnější kyselina(pKA=6,2), než deoxyhemoglobin (pKA=7,8)JVe tkáních vlivem buněčného dýchání vzniká větší množství oxidu uhličitého, který reaguje s vodou (za přítomnosti karbonát-dehydrogenasy) na kyselinu uhličitou. Kyselina uhličitá dále disociuje na hydrogenkarbonátovy anion a vodíkový katión (proton). Tím se snižuje pH v tkáních (= roste počet H+ iontů). • C02 + H20 -► H2C03 -► HCO3- + H+ ixpozice Hb oxidu uhelnatému Při otravě oxidem uhelnatým (CO) vzniká karbonylhemoglobin Expozice Hb nitrosloučeninám Nitrosloučeniny (např. ředidla, dusičnany v potravě nebo v pitné vodě) způsobují oxidaci Fe2+ na Fe3+ a vzniká tak modrý methemoglobin. Expozice Hb glukóze Glykovaný hemoglobin (HbA1c) vzniká neenzymovou glykací bílkovinného části hemoglobinu na aminokyselinách N-terminálním valinu a lysinových zbytcích. Expozice Hb ve vysoké nadmořské výšce Pro přenos kyslíku je důležitý jeho parciální tlak ve vdechovaném vzduchu (normálně 21 kPa ve vzduchu, 13 kPa v alveolách). Klesne-li tlak 02 pod kritickou hodnotu 3,5 kPa, dojde k hypoxii a následně k poruchám funkce mozku. Srpková anémie Srpková anémie je jedna z dědičných chorob, při níž je na 6. pozici v ß-řetězci valin místo glutamové kyseliny (vzniká HbS). HbS má oproti HbA rigidní tvar, a tudíž nemůže dobře procházet skrz úzké kapiláry, které následně ucpává. Srpkovitá anémie postihuje převážně černošskou populaci, protože nositelé jsou chráněni proti nebezpečným formám malárie. IV. Funkce proteinů Enzymatická/ / Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ _ mponenty/ Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. 91 G-actin minus end plus end F-actin ;?;■■ ;;,;:■ actin molecule fl^k minus end k Í 1L * ; . L* vJ J • ' " * c W I " B 37 nm 1 J ^F plus end 50 nm IUI 1 Actin filament ■ Füscin cross linker ■ 36 nm Organizace skladaní IF •dimer •antiparalelní tetramer •protofilamenta •dvojice proto filament laterálně asociují protofibrilů. •čtyři protofibrily vytvářejí spolu filamenta ři*4*í^ ^i&tfjtf** Polar coiled-coil dimer (0.05 um length) Intermediate filament (10 nm diameter) Intermediarm fílamenta: Vimentin Rod domain 1A tri____1E^ RKH B C- Cytoskeleton Plectin Intermediate fiiaments Microtubules Actin filaments <*fr ~ -*» Myosin filaments Plectin GN *?> rod HT> RDs Linker Module 6 25 5 PlecMouse 'aaaqsskgyyspysvsgsgstagsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgpsaslggpesava1 piecHamst aaaqsskgyyspysvsgsgsttgsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgppaslggpesava PlecHuman aaaqstkgyyspysvsgsgsttgsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryassppaslggpesava Kd of Plectin (Ex 1 -24) for actin 320 nM Kd of Plectin (R5)forvimentin (IF) 100nM Kd of Plectin (Ex 2-8) for integrin beta 4 170 nM (Ex 2-8) 25uM Kd for microtubules in case of MAP2 1 -3 uM rstevné značení (overlay assay ) plektinových konstruktů s tubulinem a s/bez MAPs (microtubule associated proteins) Tubulin +GnHCI Tubulin s MAP +GnHCI Coomassie blue barvení m a> o i— fN ej fn ro 13 13 U m - \ K™ki L^í molw^blntling süss on MT )fc?f ^^ Tau. MAPJtf MAP? Tvpe-m -----F-V2------s^^ Natura Reviews I Molecular Celt Biology Analýza IF domény Plektinu - bioinformatika Plectin N-terminal domain rod C-terminal domain 315 ABD MTB D 848-905 M1 domain 1392 Tau1 Tau2 Tau3 MAP2/1 MAP2/2 MAP2/3 Pled c 2518 4589 2739 3067 IFBD 4ja^HH> HT> RDs Linker Module 6 25 5 PlecMouse 'aaaqsskgyyspysvsgsgstagsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgpsaslggpesava1 piecHamst aaaqsskgyyspysvsgsgsttgsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgppaslggpesava PlecHuman aaaqstkgyyspysvsgsgsttgsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryassppaslggpesava Kd of Plectin (Ex 1 -24) for actin 320 nM Kd of Plectin (R5)forvimentin (IF) 100nM Kd of Plectin (Ex 2-8) for integrin beta 4 170 nM (Ex 2-8) 25uM Kd for microtubules in case of MAP2 1 -3 uM " tí lim s sf? j ši r \iß\in ľí™í! w n? * t i C-koncová doména Plektinu • šest modulů C-koncové domény Plektinu, které jsou spojeny méně konzervativním spojovací sekvencí modul samotný je tvořen 38 aminokyselinami (2x19) opakovaně pět krát. Cytoskeleton Plectin Intermediate fiiaments Microtubules Actin filaments <*fr ~ -*» Myosin filaments Electronova mikroskopie: Vimentin+R5/ 1000:1 Electronova mikroskopie : Vimentin+R5/ 100:1 Electronova mikroskopie : Vimentin+R5/ 1:1 Ütt ^RHNIH] 10 12 Bound [nl\ Nitrosylace NO (konzervativní sekvence: -2: G,S,T,C,Y,N,Q; -1: K,R,H,D,E; 0: C; +1: D,E) IV. Funkce proteinů Enzymatická/ / Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ ity/ Aktivní pohyb/kontrakční/ proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. 91 Kinesin se pohybuje striktně podél mikrotubulu směrem k periferii buňky (anterográdní směr). Dynein má tendenci se otáčet kolem mikrotubulu po povrchu směrem od periferie buňky (retrográdní směr). V í_______________/ I (a) Kinesin r ' ■ (KIF5) '>'.;'""V-. ' ',"■*;.■ '"■'■' r-"Ji».*;-Í' ■ •• 'i •■ v- ,-;^~*..--'ý', ■ ; Jf*^r|i*** WM 3-^p íníU t^s B Klf'iFl liiiwflln KFT kjf^ q .v: »t 'i.'-*"- '"■■/. iff- £ DENDRITE AXON "^ Aktivní pohyb/kontrakční/mo proteiny RFIA MiioíWfMlrlfl i : v CGN Ců*gl tg* ► irti IV. Funkce proteinů Enzymatická/ / Receptorová/ Přepravní/ ransportní/ Stru ktu rn í/zpevňovací/ Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. Glykosylace protilátek Man Va1,3FuG IV. Funkce proteinů Enzymatická/ / Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ ity/ Aktivní pohyb/kontrakční/ proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. 91 Kasein - funkce zásobní? »Vápník sám o sobě vytváří nerozpustný precipitát neschopný dalšího zpracování. »Vysoký obsah vápníku je svým způsobem nebezpečný. Hydrophobic core kappa casein surface hydrophobic casein subrnicelles Ca (POJ .cluster kappa casein subrnicelles