Exprese a pur if i kače rekombinantních Inducer (!PTG or lactose) E. coli genome prnt^i inn Inducer (IPTG or lactose) T7 UNA polymerase lac I gene Radka Dopito vá, 2010 Rekombinantní proteiny Rekombintní DNA je arteficiální DNA sekvence, která vznikla novou kombinací různých DNA sekvencí. Rekombinantní proteiny jsou proteiny získané vnesením rekombinantní DNA do heterologního hostitele (mikroorganismus, kvasinky), ve kterém dojde k produkci genu. Využití rekombinantních proteinu Nadprodukce a purifikace rekombinantních proteinů j sou nezbytným předpokladem pro: -biochemickou funkční charakteristiku proteinu (určení přesných kinetických parametrů Km, kcat pro enzymy se substrátem,]^ pro enzymy s inhibitorem, Kd pro protein protein interakce či ligand protein interakce) - strukturní analýzu (NMR, krystalografie) - v průmyslovém měřítku jsou produkovány léky, vakcíny a potravinové doplňky Cíl: vysoký výtěžek homogenního proteinu zachování biologické aktivity Proč vyrábět rekom binantní proteiny? Přirozený zdroj: • Obtížně získatelný - tkáně, orgány • Obtížně kultivovatelný - bakterie, viry, tkáňové kultury • Limitovaná exprese v přirozeném zdroj • i TABLE 1.2. Examples of low-abundance proteins and peptides Isolated from natural biological sources Protein Source Yield MHWB|B Exprese GFP fúzovaných proteinů v E. coli 2. část: Purifikace rel vombii ían tních proteinů V , y 3 £ 3+1 Purifikace GFP fúzovaných proteinů pomocí hydrofóbní matrice Produkce heterologních proteinů v E. Coli VÝHODY: • vysoká produkce rekombinantních proteinů • dobře prostudovaný genom a proteom-usnadnění genových manipulací • design řady vektorů usnadňuje klonování a expresi cizích genů • rychlý růst v poměrně levném médiu • přizpůsobivost systému Produkce heterologních proteinů v E. Coli NEVÝHODY: • potřeba cDNA zkoumaného proteinu • absence eukaryotických posttranslačních systémů (posttranslační modifikace) • tvorba nerozpustných inkluzních tělísek • omezená schopnost tvorby disulfidických vazeb • chybí sekreční mechanismus pro účinné uvolňování proteinu do kultivačního média Expresní systém pro produkci rekombinantních proteinu v E+coli Vektor Hostitelský kmen Podmínky kultivace Expresní vektor = klonovací vektor, který obsahuje nezbytné regulační sekvence k tomu, aby podporoval expresi inzertů cizích genů. pET-ľAaf+) sequence landmarks T7 promote] T7 transcription start His» Tag coding sequence T7» Tag coding sequence Multiple cloning sites (Bbďn-AftDi] His» Tag coding sequence T7 terminator ladcoding, sequence pBR3ľľ origin Kan coding sequence fi origin 370-3«S 27Ü-2S7 207-239 15S-2Ü3 140-157 26-72 773-1852 32SG 3995-4 a07 4903-5355 The maps for pET-28b(+) and pET-28c [+) are the same as pET-28a(+) (shown) with the following exceptions: pET-28b(+) is a 53G8bp plasm id: subtract lbp from each site beyond BamH I at ISA. pET-28c(+) is a 5367bp plasm Id: subtract 2bp from each site beyond BamH I at IG6. Dra 11(5127) Xho kí«:] Wot 1(180) Eag In m) Hind Hin 73) Sal 1(179) Sac lo sój ECOR 1(192) BamH In saj Nhe 1(231) Nc!& 1(236) NGO 1(256) Xl]3 1(335} Bgl 11(401} TSgrA l<442) 3ph 1(598} Srna I(43dd) Cla !(■+1 it> sj f ^ NrU 1(4083) EC057 1(3772) AiwN 1(3640) BSSS l[33B7) BspLU11 1(3224) Sap 1(31081 Bst11 07 1(28951 Tth111 1(2660} PshA IfiiBfl) Bgl 1(21371 FSP 1(2205) Psp5 1(2230 Struktura vektoru pro efektivní expresi rekombinantních proteinů v E+coli pET-2taj+} sequence landiiärks T7 promoter 370-386 TT transcription start sea H is* Tag cod ing sequ etrce 2T0-2S7 T7* Tag coding sequence 207-239 Multiple cloning sites (flamHI -Aftol] 158-203 His* Tag coding sequence 140-157 T7 terminator 26-72 /ac/coding sequence 773-1852 pBR32Z origin 328G Kan coding sequence 3995-4807 fl origin 4903-5358 i Bpu1102l(«]] XhO l{19«) Not 1(168) Eag 1(166) Hind 111(173) Sal 1(179) Sao ki 90) EcoR l(isa BamHI(iBS) Nllt 1(231) N cle I (23í) Nco 1(296) MJJ li.JibJ ■► Klonovací místo The maps for pET-:8b(+) and pET-28c(+) are the same as pET-28a(+) (shewn) with tlie following exceptions: pET-28b(+) is a 53G8bp plasm id: subtract lbp from each site beyond BamH I at 198. pET-28c(+) is a 5367bp plasm id: subtract 2bp from each site beyond BamH I at 198. Sma Ims Cla 1(411 Nru IM03 promotor í ^Gen pro rezistenci k antibiotiku EC057 1(3772) AlWfJ 1(1640) Operátor vazebné místo pro represor BSSS 1(3397) BspLU11 1(3324) Sap' pETupsiream p rimer *aa211- AGA I ĽICGAI17CĽGCG T7 promoter prirrre.riraa-34a-3 Id c operator T7 promoter AM IAAIALGAL ICÄC1ÄIAGGG ' ■ "3 3AGCGGA1AAĽAA1K "ĽCi:I A3AAAIŮAI1 I IGI ŕVJel Nhe-l T7*Tí a i .■■.c:.■■. : z s:,'. s:,'. s:; .\ i c ai' z ľeLGlyierSprHia H isHi 'Cr, ,;ŕ,:,'.GCiGCGGCCIGGIGrCGrGCGGCiGCrilŕlGG: IA5CAIGAC I G G I GGAC 4GC :■.:■ aHi aHi a 3-p r Sc r G I yLcuťo I ľ ro í. rqG I ySe r H i aHe l Ä I nS-pi-fle 11 hrG I yG I yG I r-G I ŕ A CGGICGCGGAICCGAAIľCGAGCTCĽGIĽGAĽAAGCI1GCGECĽGCACI C T pi. G lyArgG lyierG I jfhe-G I jLeuArgArqGIrtA laC/sG lyArql hrir His*Tng 3Ai:CE3C"3C"AAl7AAfl3CĽ: rg5ťrGIyCystnd .GGICGGGAICĽGAAI IĽCAGC I :CG ľCGÄCÍ-ACC ľ I GĽGGĽCGĽAC ľ ZG e.eW^K^K^K^^^K^KffBů. I IľlGGI IGI IAACAAAGICT pt"-2lb[-) .GlyŕršjJl^pH-roŕT.^irrSrrSrrVcIŕ^pLyaL-rLj.ľ.laŕlaAlaLfLjGlkjHi sHi sHi sHi sHi sHi stnd ■o íl* - .ggicggatccgaai icgagi ic:giľgsľaígci rGcGGmm+m**mmmmm**Mm*m*mmŔmmM*mmm*m+iimfi.t,AG.czc ■GlyArql IcArql IcArqA laPrc-Srr I hrScrL-rurrq roHi sSťrS-rr 1 hr 1 hr 1 hr 1 hr 1 hr 1 hrG K J I ■e-ArgLe^Lc^ ' rLysľro GAAAGGAAGCrCAGI I GGC ľGC ľGCĽACĽGC ľGŕGCA í. I i« T tEiminalor snirer T 7 ťtrmin-stor eCATAAtCCCl IGGGGC: I C I AAACG3G11 I 13AGSGGI pET-28a-c(+) cloning/expression region Ri božom-vazebné místo Fúzní/purifikační značka/kotva (6xHis tag) Transkripční terminátor Struktura vektoru pro efektivní expresi rekombinantních proteinů v E+coli pET-2Aaf+) sequence landmarks T7 promoter 370-38 G T7 transcription start 363 His* Tag coding sequence 270-287 T7* Tag coding sequence 207-239 Multiple cloning sites (SamHI -Xhatl 158-203 His* Tag coding sequence 140-157 T7 terminator 26-72 /acre o ding sequence 773-1852 pBR322 origin 3286 Kan coding sequence 3005-4807 fl origin 4003-5358 Dralll(5i27> XhO l{13£) Not l(1-56> Eaq ln-56> Hind 111(173) Sal 1(179) Sac I - sój ECOR l|192) Bam H 1(199} N he l{£3i) Nd& 1(236) N CO I (£96) Xl)3 1(335} Bgl 11(401} ■-■ SgrA k442) Sph 1(5931 The maps for pET2flb(-t-] and pET-ZBc(+) are tlie same as pET-28a(+) (shown) with tlie following exceptions: pET-28b(+) is a 5368bp plasniid: subtract lbp from each site beyond BamH I at 198. pET-2Sc(+) is a 5367bp plasniid: subtract 2bp from each site beyond BamH I at 198. pETup&lream primer Á9921 ---------fcr- Egl'll AGAItICGAItCCGCG Gen pro lac I represor promotor Operátor vazebné místo pro represor 5£_n- I »žcpq | Jjť | th'ombin His-Tflg A"GGGICGCGGAICCGŮAIľCGUGCľCCGICGACňAGCI1GCGGCCGCÄCI CGAG[AU[AC[AC[AC[AU:AC IGA3A1HCGGC"GC"AACAAAGCC: pL"-23c(-) r r l G I y A rgG I yS r rG I jP he-G I jL rvji rgŕ rgG I rtA I aC y a G I yA rg 1 h r A rgA I aP roP roP roP roP toLtl. A rgSe r G I yCy s t nd .GGICGGGAICCGAAIItGAGCItCGľCGACAAGCrIGtGGtCGtACrCG4GCtCrtCrtCrtCC4Cr4C13AG4iriGGIIGIIAACAAAGICC pt_-23b (-) . GlyArqAspProAsft$*r$*r$*rVHl I A-jpL y S LruA laA laA laLruG luHi ±Hi ±Hi ±Hi ±Hi ±Hi Sthd . GGICGGMCCGAMICGAGCICtGItGACAAGC1ľGCGGCtGCAC1tGAGCAtCAtCAtCAtCAtCAIIG4GAICC3GCIGCIAAIAAAGCIC pt"-2Éc(-) .1 • I • • I • • I • - ■ -.....• ■ - - . ' -_________'-• ■-...................^ I .. I :■ • .. ll... r-.. ■-.. \- a . ._______________________ SpĽ'ICI GAAAGGAAGCTGAGIIGGCľGCľGCtACtGCľGAGCAfl T7 terminator A4CCtCliGGGGCt'C1 —7 :enninii1or orirrer t6933.-3 pET-28a-c(+) cloning/eapression region Vlastnosti promotoru: - silný promotor (ptač, ptrp, A,pL, pT7) (protein zájmu by měl tvořit 10-30% a více z celkového bakteriálního proteinu) - přenositelný do různých kmenů E.coli - vykazuje minimální hladinu bazálni exprese - pokud jsou proteiny netoxické dosahuje se vysokých výtěžků proteinů růstem buněk do vysokých hustot s následnou indukcí aktivity promotoru - u toxických proteinů pro je nutná stringentní regulace promotoru - jednoduše a levně indueibilní - teplotní indukce(?ipL) - chemická indukce (ptač, ptrp, pT7): IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalaktopyranozid) Struktura vektoru pro efektivní expresi rekombinantních proteinů v E+coli pET-2taj+} sequence landiiärks T7 promoter 370-386 TT transcription start sea H is* Tag cod ing sequ etrce 2T0-2S7 T7* Tag coding sequence 207-239 Multiple cloning sites (flamHI -Aftol] 158-203 His* Tag coding sequence 140-157 T7 terminator 26-72 /ac/coding sequence 773-1852 pBR32Z origin 328G Kan coding sequence 3995-4807 fl origin 4903-5358 The maps for pET-:8b(+) and pET-28c(+) are the same as pET-28a(+) (shown) with tlie following exceptions: pET-28b(+) is a 5368hp plasm id: subtract lbp from each site beyond BamH I at 198. pET-28c(+) is a 5367bp plasm id: subtract 2bp from each site beyond BamH I at 198. Dra 111(51271 Xho 1(19«) Not 1(168) Eag 1(166) Hind 111(173) Sal 1(179) Sao ki 90) EcoR l(isa BamH 1(1 es) Nllfc 1(231) N cle I (23í) NCO 1(29«) Xba 1(22.5} Bgl lli-wi} «j- SgrA 1(442) Sph 1(598) =YU 1(4428}. ff/SS-Sgf 1(4426) -Vž/Jř Sma l(43DD) tJj f §> Cla 1(4117} Nm 1(4052:. MlU 1(1123) BCl 1(1137} [BStE 1(1304) >Apa 1(1334) EC057 1(2772) AlWfJ 1(3640) T7 promoter primer traa34B-3 pETupslream prirner*aa21l-3 ■ ag li AGA I ĽIĽGAltCCGCGAAAľIAäIAĽGAtI LAC 1A I ■tójl HINT'S BSSS l(23B7) Ribozom-vazebné místo ICLTĽCi: IA3AAAIŮAI 1 I IG I I "AALT I a i .■■■::.'. : z s:,'. s:,'. s:; .\ i; \ i; ŕ, ľeLGlyierSprHisHiaHi rtATCACftfiCAeCfiCCCIŮfiTLSCCŮCCCGGCAGCHAIAIGG: IA3CAIGA: IG3I GSArAGrAA aHi aHi a S-g r Sc r G I yLcuťo I ľ ro í. rqG IySe r H i aHe l Ä I aS#rHe 11 hrG I yG I yG I r-G I ŕ Eag I 'thlomBin Sďl Hrvidlll___AŕQÍI Xŕiol H i s^T«g A CGGICGCGGAICCGAAI ľCGAGĽTCĽGIĽGAĽAAĎC I 1 GCGGCCGCÄC rCÍAfiCACCAĽCACCACCACLAi: I GA3AKCG3C "3C"AACAAň3CC: TplGlyArgGlyiprGl jFhe-Gl jLpuí rgŕrqG Irtŕ laC/sG lyArql hrArqi I af:Toľrol:Tof:Tol:ToLffiJurg5ff rG I yCy st nd pL--23o[-) .GGICGGGAICĽGAAI IUCAGC I HC G ľ CG AC í-ACH ľ rGCGGCCGtACTCCAGCAC tACĽACĽACĽACĽAC 1 3AGA I CIGGI IGI I AACAAAGICT pt"-2Sb[-) .GlyŕrqJl^pHToŕT.^irrSrrSrrVcIŕ^pLyaLTLj.ľ.laŕlaAlaLfLjGlkjHi sHi sHi sHi sHi sHi stnd ■o íl* - .ggicggmccgaai icgag: ic:giľgíhaígci rGcGGmm+m**mmmmm**Mm*m*mmŔmmM*mmm*m+iimfi.t,AG.czc ■ GlyArql Icŕrql IcflrqMgPrc-Srr I hrScrL-rurrq roHi sSťrS-rr 1 hr 1 hr 1 hr 1 hr 1 hr 1 hrG K J I ■e-ArgLe^Lc^ ' rLyaľro GAAÍGGŕAGCIGiGI I GGC ľGC ľGCHACĽGC TGŕGCŕ í. I ŕ AC ~T :Errninalor snirer T 7t*rminfltor GCAIAACCHClIGGGGC:I C IAAACGGG11 I13AG3GGI pET-28a-c(+) cloning/expression region Transkripční terminátor Struktura vektoru pro efektivní expresi rekombinantin Jdi proteinu v E.coli R ■35 -10 TTGACA(N]17TATAAT -35 -10 UH coding sequenc START codon AUG (91%) STOP codon UAAU UGA UAG mRNA 5' UAAC3GAGQ [N)g 16SrRNA 3' hqAUUCCUCC GUG (8%) UUG (1%) Tet Ori m..........l Ribozomální vazebné mís i d SD sekvence vzdálenost mezi SD sekvencí a iniciačním AUG kodonem: 4-13 nukleotidů tato vzdálenost ovlivňuje účinnost iniciace translace (optimální vzdálenost je 4-8 nukleotidů) - oblast bohatá na AT páry Transkripciu' terminátor T7 term, rrnTl,T2 (zabraňuje okluzi promotoru, zvyšuje stabilitu m RNA) Výběr hostitelského kmene Euofi pro expresi rekombinantních proteinů Vektor / \ Hostitelský kmen Podmínky kultivace Exprese rekombinantního proteinu v hostitelském kmeni E. coli Inducer (IPTG or lactose) Inducer (IPTG or lactose) E.coli RNA W polymerase " T7RNA polymerase T7gene1 17 RNA polymerase -v/- lacl gene E. coli genome Toxicita rekombinantního proteinu pro hostitelský kmen • není omezena na pouhý fakt, zeje protein je pro buňku cizí, ale může být způsobena i tím, že je nadprodukován určitý nativní gen Pro buňku jsou letální: • rekombinantní proteiny s hydrofóbními oblastmi mají toxický účinek- asociují s membránou nebo se inkorporují do membránového systému buňky (porušení membránového potenciálu) • proteiny, které inaktivují ribozomy Výběr hostitelského kmene E.eoli Pokud je protein je pro buňku toxický • expresní kmen obsahující plazmidy pLysS nebo pLysE umožňující přísnou regulaci expresního systému využívající T7 promotor. Tyto plazmidy kódují lysozym, který se váže na T7 RNA polymerasu a inaktivuje ji a minimalizují tak bazálni expresi. BL21(DE3) firma No vagen BL21(DE3)pLysS firma No vagen • pokud je protein membránový, nebo by se mohl vázat na membránu, exprese v mutantních kmenech C41 (DE3) and C43 (DE3) může zlepšit produkci. Různé úrovně minimalizace bazálni exprese BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS/E BL21 IPTG Induction E. coli RNA W polymerase T IPTG Induction T7 RNA T polymerase Target gene lac repressor lad gene E. coli genome HOST CELL - cca 10 % hladina bazálni exprese (před indukcí exprese) klono váného genu Různé úrovně minimalizace bazálni exprese ŕ BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS/E BL21 IPTG Induction £. coli RNA W polymerase ' T7 gene 1 T7 RNA polymerase IPTG Induction T7 RNA T polymerase Target gene ~V~ INACTIVE lac repressor lac] gene — t T7 lysosyme I I T7 lysozyme-gene E. coli genome HOST CELL - cca 1-3% hladina bazálni (před indukcí exprese) exprese klonovaného genu Různé úrovně minimalizace bazálni exprese BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS/E BL21 IPTG Induction E. coli RNA W polymerase T IPTG Induction T7 RNA T polymerase Target gene lac repressor lad gene Nejvyšší úroveň repress^! E. coli genome HOST CELL - indukce exprese infekcí bakteriofágem CEG (gen pro T7 RNA polymerasu) Využívání kodonu E.coli (codon usage) Využívání kodonu E. coli se vyznačuje těmito znaky: • sklon k využívání 1-2 kodonu u téměř všech degenerovaných kodonových rodin • Určité kodony jsou nejvíce využívány ve všech genech nehledě na četnost vznikajícího produktu (např. CCG je preferovaný triplet pro prolin) • Silně exprimované geny vykazují větší množství kodonových odchylek než slabě exprimované geny • Frekvence využití synonymních kodonu obvykle odráží zastoupení jejich tRNA v cytoplazmě Málo preferované kodony Kcoli Codon(s) Amino acid AGA, AGG. CGA. CGG..............................................................Arg UGU.UGC.....................................................................................Cvs GGA.GGG.....................................................................................GÍv AUA.................................................................................................He CUA,CUC......................................................................................Leu OCC CCU. CCA............................................................................Pro UCA, AGU.UCG. UCC..............................................................Ser ACA.................................................................................................Thr Exprese heterologní genů obsahujících málo preferované kodony vede k translačním chybách ! - předčasné ukončení translace (zkrácený produkt) - posunutí čtecího rámce (posun až o 2 AK v místě AGA kodonu) - záměna aminokyseliny (často bývá zaměněn arginin za lyzin v místě kodonu AGA) * pro proteiny obsahující velké množství kodonu, které jsou málo využívané E.COÜ, je možné použít buňky, které produkují tRNA málo užívaných kodonů E.coli •BL21 (DE3) CodonPlus-RIL •AGG/AGA (arginine), AUA (isoleucine) and CUA (leucine) firma Stratagene •BL21 (DE3) CodonPlus-RP •AGG/AGA (arginine) and CCC (proline) firma Stratagene •Rosetta or Rosetta (DE3) •AGG/AGA (arginine), CGG (arginine), AUA (isoleucine) CUA (leucine)CCC (proline), and GGA (glycine) firma Novagen Degradace proteinu Bakteriální proteolytický systém: -E. coli obsahuje velké množství proteas, nejvíce v cytoplazmě - selektivně odstraňuje „abnormální" proteiny: • nekompletní polypeptidy • proteiny se zaměněnými AK • nadměrně syntetizované podjednotky multimerních proteinů • proteiny poškozené oxidací nebo volnými radikály • cizí rekombinantní proteiny (problémem jsou proteiny <10kDa) Kmeny defieientní na proteasy - mutace, eliminující produkci proteas a tím proteolytickou degradaci rekombinantních proteinů BL21 expresní kmeny jsou defieientní na: cytoplazmatickou proteasu Ion periplazmatickou proteasu ompT Aminokyseliny redukující stabilitu heterologního proteinu 1. N-koncové pravidlo Aminokyseliny redukující stabilitu proteinu: Arg, Lys, Leu, Phe, Tyr a Trp Stabilizující aminokyseliny: His, Gin, Glu, Phe, Met 2. lysin ve vnitřní sekvenci poblíž N-konce 3. PEST hypotéza Oblasti bohaté na Pro, Glu, Ser, Thr Cílená exprese proteinu Možnosti: Cytoplazmatická exprese Periplazmatická exprese Extracelulární exprese Cytoplazmatická exprese Výhody - vyšší proteinový výtěžek - jednodušší plazmidové konstrukty - inkluzní tělíska Nevýhody - inkluzní tělíska - redukční prostředí - proteolýza - více komplexní purifikace I n kluzn í tělíska Co způsobuje jejich tvorbu? - intramolekulární asociace hydro fóbních domén během foldingu - nesprávná tvorba disulfidických vazeb v redukujícím prostředí cytoplazmy - nejsou známy přesné fyzikálně chemické parametry proteinu, které vedou k tvorbě inkluzních tělísek I nkluzní tělíska Výhody > snadná izolace ve vysoké čistotě > ochrana před proteasami > pro produkci proteinů, jejichž aktivita je pro buňku letální Nevýhody > proteinová nerozpustnost > refolding pro opětné získání aktivity > refolding nemusí vést k zaktivování proteinu > redukce výtěžku proteinu > zvyšují se náklady Možnosti minimalizäi t v orby inkluzních tělísek Exprese Rozpustný protein rekombinantního proteinu v E. coli Refolding Modifikace expresních podmínek Inkluzní tělíska • Snížení teploty růstu bakteriální kultury • Koprodukce chaperonů • Použití fúzního partnera zlepšujícího solubilizaci (thioredixin) • Růst a indukce buněk za osmotického stresu (sorbitol, glycyl betain) • Změna pH kultivačního média • Selekce různých kmenů E.coli kmenů- např. bakteriální kmene deflcientní na thioredoxin reduktasu Možnosti minimalizace tvorby inkluzních tělísek Výběr hostitelského kmene E.coli • pokud protein obsahuje jeden nebo více disulfidických vazeb, správné poskládání proteinu je stimulováno v hostiteli s více oxidujícím prostředí cytoplazmy •AD494 •mutace v genu pro thioredoxinreduktasu (trxB) • Novagen •Origami •Dvojitá mutace v genu pro thioredoxin reduktasu (trxB) and glutathionreduktasu (gor) • Novagen Periplazmatická exprese - periplazma obsahuje jen 4% všech buněčných proteinů (ccs 1100 proteinů) - prokaryotické signální peptidy úspěšně použité v E.coli (OmpA,OmpT z E.coli, protein A z S. Aureus, endoglucanase z B.subtilis) Výhody - jednodušší purifikace - není zde tak rozsáhlá proteolýza - zlepšení tvorby disulfidických můstků Nevýhody - signální peptid nezajistí vždy transport do periplazmy - mohou se také tvořit inkluzní tělíska Extracelulární exprese • sekrece proteinů do kultivačního média • E.coli sekretuje velmi málo proteinů • zatím spíše neúspěšná manipulace s různými transportními cestami, které by usnadňovaly sekreci cizího proteinu Výhody - minimální kontaminace ostatními proteiny (jednodušší purifikace) - nejmenší hladina proteolýzy - zlepšení foldingu Nevýhody - často nízká sekrece - hodně zředěný protein Modifikace růstových podmínek Vektor Hostitelský kmen Podmínky kultivace Modifikace růstových podmínek Možnosti zvýšení produkce rozpustného proteinu pomocí: - vysoká hustota buněčné kultury - složení média (pH, přídavek substrátů, kofaktorů, složení živin) - snížení teploty růstu bakterií a teploty na indukci exprese - koncentrace IPTG na indukci, délka indukce exprese Modifikace růs Vliv různých podmínek exprese n ß-glukosidasy F461L. - pH LB média - Přítomnost substrátu (celobiosa) ;tových podmínek a aktivitu mutantní formy kukuřičné podmínky Specifická aktivita (nkat/mg) kontrola 1,9 LB médium pH 6 2,0 LB médium pH 7 4,2 LB médium pH 8 2,8 1% celobiosa (na indukci exprese) 2,7 Specifická aktivita byla po expresi za uvedených podmínek měřena v nativních lyzátech použitím substrátu PNPG. Exprese AHP proteinů v E. coli - test rozpustnosti 1. Médium: LB médium, bakteriální kmen BL21(DE3)pLysS Růst (OD600-0.5-0.6) Indukce 0,4 mMIPTG/3hodiny 22°C 22°C (3) 37°C 22°C (2) 37°C 28°C(1) 2. Příprava proteinových lyzátů za silně denaturačních podmínek (celková produkce proteinu= rozpustná+nerozpustná forma) a za nativních podmínek (rozpustná forma proteinu) |Pj ^ ^ 3. SDS PAGE denaturačních a nativních proteinových lyzátů s následnou analýzou western blotingem rozpustná forma AHP1 4. Detekce proteinu pomocí protilátek a kvantifikace signálů pomocí programu pro analýzu 1-D gelů (př. Quantity One- BioRad, Quanti Scan-přístupný na internetu) deprese AHP proteinů v £. coli -optimalizace teploty růstu bakterií a indukce exprese Procenta produkce AHP proteinů v rozpustné formě t(V) růst/indukce AHP1 AHP2 AHP3 AHP4 AHP5 AHP6 37°C/28°C 8% 85% 100% 0 76% 0 37°C/22°C 82% 73% 100% 0 81 % 51 % 22°C/22°C 71 % 78% 100% 30% 81 % 73% 2. Purifikace rekombinantních proteinů Purifikace proteinu z komplexní směsi makromolekul přítomných v biologickém vzorku (buněčný nebo tkáňový extrakt) Mr„ xlO3 " 116-97- — ea-55 - 36-31 - -• ařv-í 14 -G- i 10 Acidic p" Basic Analýza buněčného extraktu 2D elektroforézou - několik tisíc proteinů z různými vlastnostmi (-5000-8000) a v různých množstvích (aktin ~ 10%, unikátní trankripční faktor < 0,001% celkového proteinu) - DNA, RNA, polysacharidy, lipidy Nez začneme.....••••.................. Proč??? Pro jaký účel ? Jttk??? Jak protein detekovat? Co??? Jaké vlastnosti má protein ? Proč? ? ? Pro j aký účel ? Aplikace množství čistota poznámka Identifikace 0,002-0,2 ug vysoká (>95%) Edmanovo odbourávání (5-10 pmol), přístupy hmotnostní spektroskopie (0,2-1 pmol) Produkce protilátek JAg-nig střední-vysoká Pro imunizaci: ~ 0,1 jig proteinu Čím větší čistota tím větší a rychlejší šance pro zisk vysoce specifické imunitní odpovědi Enzymologie 1-5 mg vysoká > 95% Množství proteinu závisí na citlivosti analýzy Čistota závisí na specificitě analýzy a ovlivnění výsledků analýzy kontaminacemi Biofyzikálni studie mg-g vysoká (>95%) CD spektroskopie, rezonance povrchových plasmonů, fluorimetrie, analytická ultracentrifugace, UV spektroskopie 3D struktura (kľystalizace, NMR) 10-20 mg vysoká (>95%) Hledání krystalizačních podmínek -1-2 mg proteinu, zisk krystalu o velikosti dostatečné pro rentgenovou difrakci 5-10 mg proteinu Pro první 1-D NMR spektra se vyžaduje ~ 0,5 umol proteinu, protein (velikost 5-20kDa) značený 15 N / 13C je nutný pro vyřešení struktury F ar mutt iťútké účely mg-kg vysoká (99,9%) Pro klinické účely nesmí proteiny obsahovat pyrogeny a bakteriální toxiny a musí být velmi stabilní kvůli dlouhodobému skladování Jak??? Jak budeme protein analyzovat? Specifická detekce: Imunodetekce (pomocí série dvou protilátek) Biologická aktivita (u enzymů např. barvení v gelu nebo stanovení specifických konstant v komplexních vzorcích pomocí chromogenních substrátů) Nespecifická detekce: Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra... Stanovení celkového proteinu Nejvíce využívané metody: dle Bradfordové, Lowryho metoda,.... Co??? Jaké vlastnosti má protein ? Informace o proteinu zájmu a příbuzných proteinů z databází nebo z pilotních experimentů: - velikost proteinu (SDS PAGE, gelová filtrace nebo analytická centrifugace) - izoelektrický bod (izoelektrická fokusace) - Stabilita (pH, teplota, přítomnost solí, proteas, additiv zajišťujících solubilitu proteinu) 2D a nativní PAGE - komplexita vzorku, vlastnosti proteinu zájmu a i ostatních kontaminujících proteinů Informace o proteinu zájmu a o příbuzných proteinech z literatury: - strategie purifikace (metody,pufry, stabilita proteinu,.....) Molecular weight (slze) Rozpustnost precipitace síranem amonným Velikost/tvar gelová filtrace pi (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie Hydrofobicita reverzně fázová chromatografie Specifická vazba afinitní chromatografie Posttranslační modifikace afinitní chromatografie Stabilita teplotní precipitace Ctyrfázová purifíkacní strategie DOČIŠTĚNI Vysoká čistota cílového proteinu-odstranění drobných nečistot, proteinů podobných vlastností ALŠI PURIFIKACE Odstranění většiny nečistot -jiné ZISK CÍLOVÉHO protein proteiny, nukleové kyseliny......, další zakoncentrování cílového proteinu Obohacení vzorku cílovým proteinem, zakoncentrování a stabilizace cílového proteinu »RIPRAVA ČISTÉHO EXTRAKTU PRO CHROMATOGRAFI] Odstranění nesolubilnich podílu hrubého extraktu, lipidů, zakoncentrování vzorku (precipitace solemi nebo ultrafíltrace) piiľifikační kroky Logieká kombinaee purifikaeníeh kroků Každá separační technika je vyznačuje rovnováhou mezi čtyřmi parametry Rychlost krokuje důležitá zejména kvůli možné degradaci cílového proteinu působením proteas v komplexním vzorku rozlišení rychlost Rozlišení je rozsah separace mezi dvěma chromatografickými píky (bez dostatečného rozlišení nedochází k separaci proteinů) kapacita výtěžek Výtěžek-minimalizace ztráty proteinu během purifikace Kapacita (max.) je maximální množství vzorku, které může být navázáno na chromatografickou kolonu. Zisk cílového proteinu z extraktu afínitní chromatografíe iontoměničová chromatografíe hydrofóbní chromatografíe rozlišení rozlišení rychlost kapacita výtěžek rychlost kapacita výtěžek Další purifikace iontoměničová chromatografíe hydrofóbní chromatografíe gelová filtrace rozlišení Dočistení gelová filtrace reverzně fázová chromatografíe rychlost kapacita výtěžek Logieké pořadí purifikaeníeh kroků Analýza 100 úspěšných purifíkací ÖO 80 * • "*' Hornogenization ^ '■_ —D-Precipitation o 70 ■ —C>— Ion-exchange = ft 60 '. -o-Affinity (J « -. -ú- Size-exclusion S g 50 * * ff * o ü 40 j\ o z $Z 30 u * 20 10 y/ / ^-^ jí_________Q---------- —O- j^L Sj-------------O----------^ 0 ^ i /r^^ i'--- #.... i-...« i —D j , Stepi Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Step ů Step 7 Stage in purification scheme Zákla ilní zásady pro pořadí purifikačních kroků • na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením —> velké množství levného vstupního materiálu • později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná —> ve vzorku již investovaná práce, množství proteinu je menší • pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (výměna pufrů mezi různými separačními technikami např. dialýza nebo ultrafiltrace -> snížení výtěžku) příklad: po precipitaci síranem amonným nebo iontoměničové chromatografii (protein je eluován z kolony za vysokých koncenracích solí) zařadit hydrofóbní chromatografii (vzorek dávkován na kolonu ve vysoké koncentraci soli) • jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat • čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu Sledování čistoty proteinu SDS PAGE TI < c° Q) < N O Q) Q. 3 3 CD < ■D N O O —^ CD 3 m Q) c o < co s- 2. I Nativní PAGE Q) Q- N O S M Q sr CD Q. 0 TT 3* 3 *< FUZNI PROTEINY Translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a a) krátký peptid [př. (His)n, (Asp)n, (Arg)n ... ] - uniformita purifikace b) přirozený Oligopeptid [př. MBP, GST, thioredoxin ...] - pozitivní změny kvality a kvantity exprese (často zvýšení solubility rekombinantního proteinu) - uniformita purifikace - detekce, sekrece - fúzního partnera lze obvykle selektivně odštěpit fúzní partner velikost umístění využití His-tag 6, 8, or 10 aa N-, C-, internal purifikace thioredoxin 109aa(11.7kDa) N-,C- purifikace, zvýšení produkce His-patch thioredoxin 109aa(11.7kDa) N-,C- purifikace, zvýšení produkce chloramfenikol acetyltransferasa 24kDa N- sekrece, purifikace, detekce avidin/streptavidin Strep-tag purifikace, sekrece glutathion-iS-transferasa-GST 26kDa N- purifikace maltosu vázající protein (MBP) 40kDa N-,C- purifikace, sekrece zeleně fluoreskuj ící protein (GFP) 220 aa N-,C- detekce polyasparagová kyselina 5-16 aa C- purifikace ompT /ompA 22 aa/21 aa N- sekrece REKOMBINANTNI PROTEINY S FUZNI KOTVIČKOU Kotvička (tag) Typ chromatografíe Princip separační techniky poly [His] afinitní vazba na kov IgG vazná doména afinitní vazba na protilátku Poly [Asp] iontoměničová vazba na anion vázající matrici Poly [Phe] hydrofóbní vazba na hydrofóbní matrici Strep-tag afinitní vazba na streptavidin Poly [Arg] iontoměničová vazba na kation vázající matrici rozlišení Separační techniky charakteristické rovnováhou všech parametrů rychlost His-Tag jako N či C-koncové prodloužení proteinu Rozpoznávací sekvence pro Vazné místo pro kov proteasu thrombin í \ í \ MGSSHHHHHHSSGLVPRGS FaktorXa IEGR/X Enterokinasa DDDDK/X 3Cproteasa LEVLFQ/GP TEV proteasa ENLYFQ/G - r. 1975- uveřejnil Porath a kol. metodu frakcionace sérových proteinů - konstrukce umělých oligohistidinových domén fúzovaných k N- nebo C- konci proteinu metodami mol. biologie - nyní jeden ze základních purifikačních postupů rekombinantních proteinů •i.:- ■ aphy Hisn protease cleavage site PROTEIN + charged metal chelate resin pH [imidazole] [EDTA] protease Efekt kovového iontu navázaného na POROS MC/M matrici Funkční skupina- imidodioctová kyselina M (kDa) ,------------------------------------------------------------, Zn2+ Ni2+ Co2+ Cu2+ Síla vazby: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ~ Co2+ Jednokrokova yurifikace za nativních a denaturačních podmínek Protokol i ľ konkrétního proteinu j e zčásti nepřenosný na j iné proteiny! Obecně lze navrhnout: pufry o pH 7-8 pro vazbu rek. proteinu s kovovým iontem pufry s vysokou koncentrací solí (např. 0,5-1 mol/l NaCl) nižší koncentrace imidazolu nebo snížení pH pro odstranění balastních proteinů eluce použitím gradientu imidazolu (0-1 mol/l), výrazným snížením pH nebo využitím EDTA Jednokrokova yurifikace za nativních a denaturačních podmínek l — purifíkace proteinů v ínkluzních tělíscích purifíkace za vysokých koncentrací močoviny nebo guanidinium chloridu ------► čistý protein, ale porušení kvartérní struktury (postačí však např. na imunizace) Zisk nativního konformem: - nutné pro měření enzymové kinetiky, rtg analýza,... - eluce proteinu z kolony a jeho renaturace dialýzou nebo výrazným zředěním v renaturačních pufrech - renaturace enzymu vázaného na matrici: gradient z denaturačních do renaturačních pufrů pulzní renaturace 210307AHP5Superdex75 - Purification of AHP5 - improvement of the protein yield Comparison of the yield of purified protein expressed in LB and TB medium Expression in LB medium 1eTWlfi^1Jó^^é0s^§räto§limhíty chromatography) ge| filtration Purity: 96% Concentration of the protein: 22 mg/ml Yield: 3,3 mg/ 4 I of bacterial culture Expression in TB medium Purification: metal chelate affinity chromatography, gel filtration riiy^95% Concentraffiüfhotthe protein: 23mg/ml Yield: 11,3 mg/4l of bacferiaLculture 500 ml Základní doporučení pro uskladnění proteinu po purifikaci Doba skladování: pár dnů až více než rok - záleží na přirozených vlastnostech proteinu a podmínkách, ve kterých je protein skladován 1. Teplota Podmínky skladování Podmínky Roztok na 4°C Roztok na -20°C v 25-50% glycerolu -80°C, tekutý dusík Lyofilizovaný vzorek, zamrazený Doba skladování 1 měsíc 1 rok roky roky Požadavek sterilního prostředí nebo přídavek antibakteriálního additiva ano Obvykle ano ne ne Kolikrát může být takto skladovaný vzorek použitý? mnohokrát mnohokrát 1 x, opakované zamražování a rozmrazování obecně vede k degradaci proteinu lx, Základní doporučení pro uskladnění proteinu po purifikaci 2. Koncentrace proteinu - rozředěním proteinu na < 50 ug/ml dochází často k jeho inaktivaci nebo ztrátě proteinu - disociují podjednotky multimerních proteinů - ztráta proteinu kvůli signifikantní adsorpci na různé povrchy Protein by měl být skladován při koncentraci nejméně 1 mg/ml nebo se může protein stabilizovat přídavkem jiného proteinu např. BS A nebo přídavkem additiva 3. Přídavek additiv zajišťujících stabilitu proteinu během skladování - 25-50% glycerol nebo etylenglykol - 0,02-0,05 % NaN3 - inhibitor proteas - l-5mMEDTA - l-5mM DTT, merkaptoetanol Doporučená literatura Makrides SV (1996) Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli. Microb.Review 60, (512-538). Simpson RJ; Adams PD; Golemis E Basic methods in protein purification and analysis: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009, 436 s., ISBN 978-0-87969-868-3 Navazující předměty Výukový modul: Příprava a charakterizace proteinů Příprava a charakterizace proteinů I - Exprese a purifíkace proteinů (v češtině) Příprava a charakterizace proteinů II - Biokatalýza a enzymová technologie (v angličtině) Příprava a charakterizace proteinů III - Proteinem zprostředkované interakce (v angličtině) Technologie rekombinantnich proteinů l Select gene of interest Insert cDNA in an expression system ,ÄftS3ŕ£ s fe£* sSjšä rjaíí£^L $$&# " % genomic data Nuclear magnetic resonance Spectroscopy Grow large volumes of protein in culture Purify protein by affinity chromatography or other methods ar^ l. Crystallize protein X-ray diffraction