Biologická analýza spoločenstiev vodných organizmov - počítanie cyanobaktérií a rias v komôrke RNDr. Bohuslav Uher, Ph.D. uherius@sci.muni.cz Kvantifikácia biosestonu • Technická norma • Kvalita vody • Biologický rozbor • Stanovenie biosestónu • Cieľ: kvantitatívne vyjadrenie spoločenstva všetkých živých organizmov prítomných vo vodnom stĺpci Postup pri zisťovaní množstva organizmov • Odber vzoriek • Transport vzoriek • Laboratórne spracovanie (zahustenie vzorky, počítanie organizmov) • Vyhodnotenie výsledkov • Dôležité: presne definované objemy vzorky, čo je nevyhnutný predpoklad presnej kvantifikácie organizmov na jednotku objemu!!! Odber vzoriek • V súlade s príslušnou technickou normou • Čisté sklenené alebo plastové vzorkovnice • Napĺňanie do ݯbjemu • Transport v chladiacich fľašiach • Spracovanie najneskôr do 24 hodín • Do spracovania uchovávať pri teplote 4°C • Před analýzov temperovať při teplote okolia na 20°C Metódy zahustenia vzorky • Príliš málo organizmov • Preto zahusťujeme • 1. Sedimentácia • Organizmy fixované Lugolovým roztokom • Inverzná mikroskopia • Utermöhlova metóda • 2. Centrifugácia • 10 ml odobratej vzroky vody po dobu 5 minút pri 2000 otáčkach (polomer rotora 0,08 m) • Problematické sú planktónové sinice tvoriace vodný kvet • 3. Membránová filtrácia • 10 ml vzorky sa presaje cez filter • Pozorovanie filtra pod imerziou Mikroskopická analýza • Zahustená alebo nezahustená vzorka • Po temperovaní na teplotu 20°C • Zväčš. 200x niekedy aj väčšom • Počítacie komôrky • Bürkerova (ešte sa používa v bakteriológii) • Cyrus I • Cyrus II Cyrus I Cyrus I, schéma Mriežka počítacej komôrky Cyrus I Počítacia komôrka Cyrus I • Homogenizácia vzorky pomocou preparačnej ihly alebo pomalým viacnásobným nasatím do pipety a jej vypustením bez bublania pred prenesením na mriežku komôrky • Prykryje se krycím sklíčkom • Upevní svorkami • Prebytočná voda sa dostane do kanálikov • Tá sa vyfúkne • Nezabudnúť na čistení počítacej komôrky 70% Etanolom před a po použití!!! • Mriežka, dĺžka strany malého štvorca 125 µm Počítanie organizmov • Vychádza sa z definície jedinca • Jedinec je samostatne žijúci organizmus jednobunkový a viacbunkový • Jedinec = bunka rias, siníc, baktérií, bičíkovcov a nálevníkov, cenóbiá siníc a rias, kolónie do priemeru 60 µm • Vlákna húb, siníc a rias do dĺžky 100 µm • Spôsob počítania zvolíme podľa hustoty buniek vo vzorke (malá hustota - celá mriežka, väčšie štvorce, vysoká hustota – 3-4 pásy štvorcov) • Organizmy dotýkajúce sa spodnej a ľavej strany sa nepočítajú!!! • Prepočítanie organizmov na 1 ml Stanovenie počtu jedincov na 1 ml • Počet jedincov x v 1 ml vzorky: • x = a.K / n.z.V; • a → počet jedincov v n štvorcoch n → počet vyšetrených štvorcov z → zahustenie vzorky K → celkový počet štvorcov v komôrke V → objem komôrky v ml Pre komôrku Cyrus I • 10×10 mm, 0,01 ml, 1600 štvorcov • Pri zahustení vzorky z 10 ml na objem 0,1 ml (z=100, K=1600, V=0,01) • Vzorec: x = a.1600/n.100.0,01 x = 1600.a/n Rušivé vplyvy stanovenia • Chyby a neistoty • Homogenizácia vzorky (deštrukcia drobných druhov) • Veľkosť počítacej plochy (rozdiely v počtoch organizmov) • Ľudský faktor • Dodržiavanie správneho postupu a požiadaviek príslušných noriem Ďakujem za pozornosť