RT - PCR: návrh primerů
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Amplifikace specifického úseku DNA - princip replikace in vivo
- Denaturace DNA
- Připojení primerů na protilehlé řetězce DNA: 3'-OH-konce proti sobě
- Syntéza komplementárního řetězce podle templátu (ssDNA)
-teplotně stabilní DNA polymeráza Taq       Thermus aquaticus Tth        Thermus thermophilus Tma      Thermotoga maritima Pfu       Pyrococcus furiosus Pwo      Pyrococcus woesei
-dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí
-Mg2+ ionty ovlivňují aktivitu enzymu a zvyšují hodnotu Tm u dsDNA (koncentrace 1 mM - 5 mM)
Third
cycle
Vlastní reakce:
1) Počáteční denaturace DNA templátu 2 - 5 min / 95 °C.
2) Denaturační krok (separace řetězců) 94 - 95 °C / 20 - 45 s -umožňuje přístup primerů
3) Připojení primerů 55 - 65 °C / 30 - 90 s
- teplota závisí na Tm primeru a templátu, pro oba primery by měla být Tm podobná.
4) Prodlužování primeru (polymerační reakce) 72 °C / 45 - 90 s
-Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA rychlostí cca 60 bází / s.
Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus.
PCR : Polymerase Chain Reaction
1 rnrrrTTTnTriTTT^^
s| i *- ^ i . -, y+mm"
. v I I \. ' II
30 - 40 cycles of 3 steps :
Step 1 : detiatu ration
1 minm 94 °C
3'   Step 2 : anneal in
45 seconds 54 ÜC
forward and reverse
primers
111
,  !fm y Step 3 : extensio
5
v
I,
ÜI
/
2 minutes 72 °C only dNTP's
(Andy ViasLrasK UW}
RT-PCR = Reverzní transkripce + PCR - analýza exprese
Transkripce — mRNA
Reverzní transkripce - mRNA — cDNA (na principu virové RT)
- Reverzní transkriptáza (RdDp)
- primery - poly T (mRNA) nebo náhodné nebo specifické
- nukleotidy
Kvantitativní PCR (qPCR)
PCR sledovaná v reálném čase (real-time PCR) - detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu
Přístroj umožňuje:
cyklické střídání teplot
detekci fluorescence
monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR-
produkty elektroforeticky
Návrh primerů
Optimálně: -18-25 bází
- bez vnitřních sekundárních struktur g -G+C 40-60%
- rovnoměrná distribuce oblastí bohatých na G/CaA/T páry
- bez vzájemné komplementarity na 3'-koncích - nevytváří navzájem nebo samy se sebou duplexy
- bez falešných vazebných míst na matricové DNA
- Tm teplotu 55 - 65 °C
RT-PCR
Primery komplementární k sekvenci na spojení exon/exon (neamplifikují genomovou DNA)
AGCTGAC TÁGA
PRIMER: TCGACTGATCT
Návrh primerů
1. Vyhledání sekvence genu
2. Návrh sekvence
3. Kontrola - specifity
- tvorby dimerů a sekundárních struktur (AG° <10 kcal/mol)
- Tm - snižující se směrem k 3'konci
4. Určení délky produktu, Ta - závislost na iontové síle (Mg)
Využití programů a databází - např:
Primer3 Oligo Analyzer 3.0 Oligonucleotide Properties Calculator
Oligo (demo for Windows) Jiný OligoCalc WebPrimer Electronic PCR (serviece at NCBI) Virtual PCR PCRlinks.com
Návrh primerů - příklad
1. Vyhledat sekvenci genu - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
Návrh primerů - příklad
Reset page   Save search parameters
PCR Template
Enter accession, gi, or FASTA sequence (A refseq record is Range
HH_013633.2			
			
Or, upload FASTA file		Browse...	
From
Forward primer Reverse primer
Primer Parameters
Use my own forward primer (5"->3- on plus strand) Use my own reverse primer P"->3" on minus strand)
PCR product size = of primers to return
C lenil
Clear
Mill
100
20 Mill
50.0
Max
400
Opt
55.0
Max
Max Tm difference
63.0
To
Primer melting temperatures
fTm)
Please note the recent change in default Tm calculation
A retseq rnKNA sequence as HCK template input is required tor options in the section
Exon/intron selection Exon junction span
Exon junction match
Primer must span an exon-exon junction
Exon at 5" side    Exon at 3" side
Návrh primerů - příklad
1. Vyhledat sekvenci genu - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
2. Návrh primem - NCBI pick primers nebo samostatné programy
3. Kontrola primerů - Oligo Analyzer 3.0 (na webu) nebo programy (Oligo)
^ OLIGO - Sox2
File   Edit   Analyze   Search   Select   Change   View   Window Help
príklady struktur vytvářených primery
• Chybně navržená dvojice primerů, která vytváří stabilní duplex na 3'-konci:
5'ATTCAACCGTTCAAACAAGCCC 3'
3' GTTCGGCCTACCTTTATTTCTC 5'
• Správně navržená dvojice primerů, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5'-konci; na 3'-konci je G nebo C zaručující stabilní párování s templátem:
5' CGAAATAAGACTAGTAAAGC 3' I I    I    I I    I I 3' CCTTACTCCACGCCTAATACAATCC 5'
• Chybně navržený primer, vytvářející vlásenku:
5'TTTTTCAAGG-III C
3'AAAAGAGAT-^
Návrh primerů - příklad
3. Kontrola primerů - Oligo Analyzer 3.0 (na webu) nebo programy (Oligo)
-Chybové hlášení
Návrh primerů - příklad
1. Vyhledat sekvenci genu - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
2. Návrh primeru - NCBI pick primers nebo samostatné programy
3. Kontrola primerů - Oligo Analyzer 3.0 (na webu) nebo programy (Oligo)
4. Zjištění optimální Ta a délky produktu - program Oligo