Chromatografické metody Zdeněk Glatz Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a mobilní.“ Chromatografie Chromatografie • Mobilní fáze - kapalina – LC plyn – GC • Eluce - Izokratická – stejná eluční síla Gradientová – rostoucí eluční síla • Použití - analytická preparativní Kapalinová chromatografie LC • Mobilní fáze - kapalina • Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina Provedení LC • Papírová PC • Tenkovrstvá TLC • Kolonová CC Teoretické aspekty chromatografie Teorie „Ideální lineární chromatografie“ Martin, Synge Teorie „Ideální lineární chromatografie“ • Nekonečně rychlé ustavení rovnovah • Pístový tok mobilní fáze • Nulová difuse • Lineární sorpční isoterma Chromatografie Chromatogram Retenční – eluční čas t[r] • Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Mrtvý objem Kapacitní faktor k’ Selektivita Retenční faktor a Účinnost kolony počet teoretických pater N Účinnost kolony výškový ekvivalent teoretického patra H Účinnost kolony Rozlišení Vliv jednotlivých faktorů na rozlišení „Dynamická difuzní teorie“ Van Deemter Van Deemterova difuzní teorie • Difuse turbulentní • Difuse molekulová • Odpor proti převodu hmoty Difuse turbulentní A Difuse molekulová B Odpor proti převodu hmoty C Van Deemterova rovnice Síly a efekty využívané při separaci • Iontové síly • Polární síly • Nepolární síly • Sterické interakce • Efekt velikosti molekul Rozdělovací chromatografie Rozdělovací chromatografie Adsorpční chromatografie Adsorpční chromatografie Adsorpční chromatografie • Stacionární fáze – polární Silikagel SiO[2] . n H[2]O Oxid hlinitý Al[2]O[3], AlO(OH), Al(OH)[3] [ ] Hydroxyapatit [Ca[5](PO[4])[3]OH] Adsorpční chromatografie • Mobilní fáze – nepolární • Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíky 2-3 Mez stanovitelnosti S/N > 10 Lineární rozsah detektoru Vyhodnocení • Zapisovače • Integratory • Integrační software + PC Zjištění plochy píků u zapisovačů vážením Zjištění plochy píků u zapisovačů planimetrem Zjištění plochy píků u zapisovačů výpočtem Integrator Provedení • Analytické • Preparativní Analýza kvalitativní • Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů • „spiking“ – přidání standardu do vzoru ® nárůst výšky píků • Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická • MS Analýza kvantitativní ¯ Plocha (výška) píku • Metoda externího standardu • Metoda vnitřního standardu • Metoda standardního přídavku LC analýza Plynová chromatografie • Mobilní fáze - plyn • Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina Výhody • Nižší viskozita mobilní fáze • Rychlejší difuze Schéma plynového chromatografu Plynový chromatograf Zdroj nosného plynu Elektrické měření průtoku Nosné plyny Příprava vzorků pro GC • Plyny, kapaliny - přímo • Pevné látky - po derivatizaci Objemy dávkovaných vzorků • Plyny - 0.5 – 5 ml • Kapaliny - 0.1 – 10 ml Způsoby dávkovaní vzorků • Přes septum • Ventilem • Termální desorpcí Stříkačkou Dávkovací stříkačka Rychlost dávkování Způsob dávkování Automatické dávkovače Ventilem Ventil Dávkování termální desorpcí Termostatování Kolony • Náplňové – ݙ OD – ocel, sklo délka • Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen, ocel, sklo délka –10 - 100 metrů Kolony Kolony Náplňová kolona Kapilární kolona Kapilární kolona Eluce Eluce • Izotermální • Gradientová – zvyšování teploty – 400 ^oC Eluce Detektory Destruktivní x Nedestruktivní Universální x Selektivní Teplotně vodivostní detektor TCD • Universální detektor • Nedestruktivní detektor ^• Lineární rozsah – 10^6 • Princip – změna tepelné vodivosti eluentu Teplotně vodivostní detektor TCD Teplotně vodivostní detektor TCD Plamenově ionizační detektor FID • Specifický • Destruktivní • Lineární rozsah – 10^7 • Princip – ionty vznikající spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudu Plamenově ionizační detektor FID Plamenově ionizační detektor FID Detektor elektronového záchytu ECD • Specifický • Nedestruktivní • Linearní rozsah - 10^4 • Princip – interakce b^- částic se vzorkem vyvolává pokles proudu Detektor elektronového záchytu ECD Detektor elektronového záchytu ECD GC MS permeační interface GC MS přímé spojení GC analysa Superkritická fluidní chromatografie • Mobilní fáze - superkritická kapalina • Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina Superkritická kapalina Superkritická kapalina Superkritická fluidní chromatografie Superkritická fluidní chromatografie Superkritická fluidní chromatografie SFC analysa Superkritická fluidní extrakce Superkritická fluidní extrakce [• ]Používané kapaliny - CO[2] [ ]- levný, - netoxický - nízká kritická teplota • Požívané modifikátory - HCl – kyselé prostředí - NH[3] – bazické prostředí FFF Field Flow Fractionation Field Flow Fractionation princip Field Flow Fractionation instrumentace Používaná pole • Sedimetační • Termální • Hydraulické • Elektrické Preparativní FFF