Instrumentální biochemické metody Literatura • Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky • Ferenčík : Biochemická laboratorní technika • Morris, Morris : Separation Methods in Biochemistry Instrumentální biochemické metody • Vychází z klasických metod chemické analýzy • Uplatňují se zde i speciální metody Separace kvalitativní • Analytické kvantitativní • Preparativní Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK …. Problémy se vzorkem • Komplexnost • Malá množství • Labilita Zásady pro práci s biologickým materiálem • Teplota • pH + iontová síla • Koncentrace bílkoviny • Pěnění • Lokální přebytky • Proteázy Plánování separace bílkovin Cíl izolace • Získání homogenní bílkoviny • Zachování biologické aktivity • Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí Volba vstupního materiálu • Preparát z daného organismu • Preparát s největším obsahem dané bílkoviny • Preparát s nejmenším obsahem nečistot Volba a kombinace separačních metod • Rozlišovací schopnost • Selektivita • Kapacita • Zpětný výtěžek • Náklady – materiál, přístroje, člověk • Stupeň zřeďování a koncentrace • Slučitelnost mezi metodami Základní zásady • Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením ® velké množství levného vstupního materiálu • Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce • Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly • Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími • Metody nepoužívat opakovaně Sledování průběhu separace Stanovení koncentrace bílkoviny Kjeldahlova metoda – stanovení N[2] • Mineralizace vzorku – převedení organického dusíku na NH[4]^+ • Stanovení NH[4]^+ - titrace, fotometrie, selektivní elektrody UV spektrofotometrie • 280 nm – aromatické AMK interference nukleotidů • 180 - 230 nm – peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace VIS spektrofotometrie • Přídavek činidla ® barevný derivát • Destruktivní metoda • Nutná kalibrační závislost Biuretová metoda Princip : Cu^2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu^2+ Měření : 540 – 560 nm 310 nm Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu na bílkovinu ® měření vzniklé fluorescence - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny Polarografie Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co^2+ katalytické reakce na Hg elektrodě ® proud Nejčastěji používané metody Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd. Vlastní separace Obecné schéma Vstupní materiál Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává Živočišné tkáně • Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci • Jateční zvířata – orgány • Člověk – tělní tekutiny Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek Manipulace s biologickým materiálem • Pokud možno zpracovat co nejdříve • Zmražení – při – 60 - 80 ^oC • Rozmrazování – co nejrychleji Rozbití a extrakce Bakterie • Záleží na lokalizaci Balotina Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit French (X) press Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk Ultrazvuk Princip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H[2]O – bakterie popraskají Další • Alumina Al[2]O[3 ]– roztírání v třecí misce [• ]Opakované zmrazování a rozmrazování[] [ ] Kvasinky Toluenová autolýza Princip – toluen extrahuje při 35 –40 ^oC fosfolipidy buněčné stěny ® osmotický šok  enzymová autolýza Balotina, French press, Živočišné tkáně • Třecí miska s pískem • Ruční homogenizatory – Potter – Elvehjemův • Mixery • Osmotická lyse - erytrocyty Rostlinné tkáně • Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, • Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Optimalizace extrakce • Teplota – 4 - 6 ^oC chlazení • pH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech • I – v prostředí o definované iontové síle • Přídavky látek – EDTA, b-merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas Separace subcelulárních organel Enzymy - markery Membránově vázané bílkoviny Izolace membránových bílkovin • Chemicky – detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla, • Fyzikálně - homogenizace, sonikace • Enzymaticky – fosfolipasy, lipasy, proteasy Centrifugace • Odstranění hrubých částic z roztoku Sediment (pelet) – supernatant • Izolace organel nebo biomakromolekul • Stanovení základních parametrů – MW, hustota, sedimentační koeficient Použití Rozdělení centrifug Otáčky ® g Preparativní centrifugace Metody nanášení vzorku Preparativní centrifuga Preparativní centrifuga Preparativní ultracentrifuga Rotory • Úhlový – diferenciální centrifugace • Výkyvné – zonální centrifugace • Zonální – bez kyvet, vzorek je uvnitř rotoru Úhlový rotor Výkyvný rotor Gradientová centrifugace média • Sacharosa • Glycerol • Ficoll - dextran • Percoll – SiO[2] • CsCl Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Zonální rotor Centrifugace se zonálním rotorem Analytická ultracentrifuga Analytická ultracentrifuga Kyveta Analytická ultracentrifugace Analytická centrifugace Metoda sedimentační rovnováhy Metoda sedimentační rychlosti Fázové separace Odstranění H[2]O rotační vakuová odparka Odstranění H[2]O lyofilizace Odstranění H[2]O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Odstranění H[2]O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Odstranění H[2]O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza Stanovení interakčním konstant Rovnovážná dialýza Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit Ultrafiltrace míchané cely Ultrafiltrace centrifugační přípravky Ultrafiltrace Hollow fiber – dutá vlákna Ultrafiltrace Hollow fiber – dutá vlákna Příprava laboratorní vody Nečistoty ve vodě • Soli – těžké kovy - denaturace • Organické látky – HPLC, GC • Hrubší částice – mikroorganismy • Koloidní částice - biomakromolekuly Kriteria čistoty • Vodivost – 18 MW/cm • Těžké kovy – AAS • Pyrogenita Postupy čistění destilace • Destilace – teoreticky odstraní všechny složky, prakticky jsou strhávány těžké kovy z elektrod (Cu, Zn, Fe) • Redestilace – křemenné aparatury Nevýhoda – náklady na vodu a elektrickou energii Postupy čistění reverzní osmoza • Nevýhoda – malá kapacita, nevyčistí úplně Postupy čistění deionizace • Kolony se směsnými ionexy – katex + anex Postupy čistění elektrodeionizace Postupy čistění odstraňování org. látek • Speciální patrony s aktivním uhlím a jinými sorbenty • UV – 180 nm + 254 nm - oxidace org. látek, - likvidace bakterií Postupy čistění filtrace • Membránová – vetší póry – bakterie • Ultrafiltrace – malé póry - koloidní částice Kaskádový systém kombinace Kaskádový systém kombinace Millipore