27.5.2009 11:27:00 bakalarska_prace.doc /51
1. Princip
Izotachoforéza (ITP) je elektromigrační separační metoda, která umožňuje
dělení aniontů (popř. kationtů) na základě jejich rozdílné efektivní pohyblivosti uef
ve stejnosměrném elektrickém poli o vysokém napětí. Pracuje se při konstantním
proudu, řádově se jedná o několik desítek A.
Efektivní pohyblivost je rychlost pohybu nabitých částic v jednotkovém
elektrickém poli odpovídající jejímu stupni disociace . Je ovlivněna hodnotou pH
prostředí.
Hlavní rozdíl mezi izotachoforézou a jinými elektroforetickými metodami je,
že izotachoforéza pracuje se dvěma elektrolyty ­ vedoucím LE (jeho hodnota
efektivní vodivosti je nejvyšší) a koncovým TE (jeho ionty mají nejnižší efektivní
pohyblivost). Vzorek analytu se dávkuje na rozhraní mezi vedoucím a koncovým
elektrolytem. Pro aniony A, B, C přítomné v analytu platí:
LECBATE uuuuu  (1)
Správná volba elektrolytů a jejich pH rozhoduje o rozdělení iontů do zón a
proto je velmi důležitá pro správné provedení analýzy [1].
Během jednoho stanovení lze separovat buď pouze anionty nebo pouze
kationty, nikdy obojí dohromady.
Výsledný záznam izotachoforézy se nazývá izotachoforegram a tvoří jej
jednotlivé zóny, které obsahují vždy jeden druh iontů. Tyto zóny procházejí
kapilárou stejnou rychlostí až do místa detekce. Jejich délka odpovídá koncentraci
samostatných iontů a je důležitou složkou, jak pro kvalitativní analýzu (určení
pomocí její výšky), tak pro kvantitativní analýzu (určení pomocí její délky ­ čím
delší zóna, tím koncentrovanější roztok).
Ostré oddělení jednotlivých zón lze vysvětlit pomocí tzv. samozaostřujícího
efektu: opustí-li ion analytu A svoji zónu v důsledku difúze a přejde do zóny
ITP stanovení aminopolykarboxylových kyselin
vedoucího elektrolytu LE, dostane se do oblasti menší intenzity pole. V poli se sníží
jeho rychlost a ion se vrátí zpět do své vrstvy. Stejně tomu je i v případě přechodu
iontu analytu do zóny koncového elektrolytu TE. Zde dojde k urychlení iontu A,
protože v zóně TE je vyšší intenzita elektrického pole ­ tím vznikají ostrá rozhraní
mezi zónami [2,3].
V každé zóně je intenzita elektrického pole i koncentrace každého iontu
konstantní a je určena složením koncentrací vedoucího elektrolytu. Proto platí
Kohlrauschova rozdělovací funkce [1]:
LEKALE
AKLEA
LE
A
zuuu
zuuu
c
c
)(
)(
+
+
= (2)
kde
uLE ... pohyblivost aniontu vedoucího elektrolytu
uK ... pohyblivost kationtu
uA ... pohyblivost anionu tvořícího zónu
zA, zLE ... nábojová čísla anionů v zóně a ve vedoucím elektrolytu
cA, cLE ... jejich koncentrace, pro které platí cA = cLE . konst
Správnou volbou koncentrace vedoucího elektrolytu lze prodloužit nebo zkrátit
zóny určovaných iontů, protože koncentrace látky v její zóně cA je přímo úměrná
koncentraci vedoucího elektrolytu [1].
2. Chemikálie
Vedoucí elektrolyt: 20 mM HCl + Glycin (pH 3,1)
Koncový elektrolyt: 20 mM octan amonný (pH 4,8)
EDTA
NTA
Kyselina hydroxyoctová
Vzorek Syntronu B - pevný
27.5.2009 11:27:00 bakalarska_prace.doc /51
3. Práce s přístrojem
Pracuje se s jednokolonovou technikou přístroje EA 102 Villa Labeco.
Obr.1 Jednokolonové uspořádání elektroforetického analyzátoru EA, Villa Labeco
Než začneme měřit, je potřeba promýt zásovníky vedoucího a koncového
elektrolytu destilovanou vodou. Dávkovací kohout dáme do polohy C a promyjeme
jej destilovanou vodou. Do injekční stříkačky plnícího rozvodu si natáhneme
27.5.2009 11:27:00 bakalarska_prace.doc /51
destilovanou vodu, otevřeme kohout IN column a propláchneme analytickou kolonu.
Promytou kolonu poznáme podle toho, že voda proudí pomocí hadičky do odpadu.
Na injekční stříkačku příliš netlačíme, abychom nepoškodili membránu, spíše se
snažíme kolonu pulzně plnit. Injekční stříkačku není třeba vyndávat a jakmile je
kolona promytá, pomalu uzavřeme kohout.
Obr.2 Pozice dávkovacího kohoutu
Promývání dávkovacího kohoutu provádíme při pozici C, následně jej otočíme
do polohy B (musíme mít naplněný zásobník TE) a pozorujeme odtok vody do
odpadu. V případě, že voda neodtéká, vezmeme si prázdnou injekční stříkačku,
kterou vložíme do uzávěru zásobníku TE a vytvoříme přetlak.
Pomocí prázdných injekčních stříkaček odsajeme destilovanou vodu ze
zásobníků a kolony. Zásobníky naplníme příslušnými elektrolyty (postupujeme
obdobně jako při jejich promývání) a do injekční stříkačky plnícího rozvodu
nasajeme vedoucí elektrolyt, kterým plníme kolonu. Injekční stříkačku vedoucí do
dávkovacího kohoutu naplníme vzorkem. Dbáme na to, aby v koloně nebyly žádné
vzduchové bublinky, protože ty ruší stanovení a způsobují jejich nepřesnosti.
4. Postup
a) Promyjeme přístroj ­ viz kapitola práce s přístrojem.
b) Připravíme si elektrolyty a nadávkujeme je do zásobníků podle obrázku 1.
c) Nachystáme si zásobní roztoky (10 mM) EDTA, NTA a kyseliny
hydroxyoctové.
27.5.2009 11:27:00 bakalarska_prace.doc /51
d) Zásobní roztoky zředíme a proměříme je při různých koncentrací (0,1; 0,5;
1; 1,5 a 2 mM). Pro urychlení analýzy lze stanovovat dané kyseliny vedle
sebe.
Zapneme řídící počítač a spustíme program ITP Pro. Zvolíme ikonu METHOD
a nastavíme parametry analýzy (nejvyšší napěťový limit 15000 V, měření anionů,
jednokroková analýza dlouhá 1500 s, proud 100 A, měření na spodní koloně a
zapneme vodivostní i UV detektor) podle obrázku:
Obr.3 Nastavení metody analýzy
Vzorek nasajeme do injekční stříkačky a dávkujeme do kolony, když je
dávkovací kohout v poloze C. Kolona má objem 30 l a že je neplněná poznáme
podle toho, že přebytek odtéká do odpadu. Poté dávkovací kohout pootočíme do
polohy B a jakmile vidíme, že koncový elektrolyt odtéká do kanálu (pokud se tak
neděje, použijeme prázdnou injekční stříkačku a vytvoříme přetlak), otočíme
dávkovací kohout do polohy A. Takto je systém připraven k analýze, kterou spustíme
ikonou RUN.
Během analýzy svítí na přístroji červená kontrolka HIGH VOLTAGE. Analýza
je nastavená na 1500 sekund, ale jakmile se objeví zóny, můžeme ji vypnout
tlačítkem STOP. Konec analýzy poznáme podle klesajícího napětí (zóna koncového
elektrolytu se ubírá pozvolna dolů). Před každým dávkováním injekční stříkačku
propláchneme vodou a kolonu promyjeme vedoucím elektrolytem. Dávkovací
kohout máme v poloze C. Nastříkneme další vzorek a spustíme analýzu.
27.5.2009 11:27:00 bakalarska_prace.doc /51
Takto proměříme všechny roztoky kyselin a sestrojíme kalibrační přímky
(závislost délky zóny na koncentraci).
e) Proměříme vzorek Syntronu B. Připravíme si 1 mM roztok vzorku (hlavní
složkou v Syntronu B je Na4EDTA, takže za molární hmotnost dosadíme
při výpočtu molární hmotnost Na4EDTA, tj. 380,2) a postupujeme jako při
měření roztoků kyselin.
f) Po skončení analýzy vypneme počítač a přístroj promyjeme destilovanou
vodou (viz kapitola práce s přístrojem). Odpad z nádobky WASTE
vylejeme.
5. Vyhodnocení
Po skončení analýzy otevřeme okno LOWER detector a vybereme naměřený
soubor. V nabídce ANALYZE zvolíme Zone Table, kde se nám zobrazí délky zón
vzorků, které vynesene do kalibračních grafů.
Obr.4 ITP záznam analýzy Syntronu B (* neznámá látka, pravděpodobně ze syntézy)
Při vyhodnocení vzorku Syntronu, zjišťuje která zóna patří které kyselině podle
odkazu OVERLAP, kde zvolíme Add, pomocí kterého přidáme do
NTA
EDTA
*
kyselina hydroxyoctová
27.5.2009 11:27:00 bakalarska_prace.doc /51
izotachoforegramu jednotlivé kyseliny.
6. Výpočet obsahu kyselin ve vzorku Syntronu B
Výpočet provedeme metodou kalibrační přímky (závislost délky zóny na
koncentraci kyseliny), z jejich rovnic regrese. Tím zjistíme koncentraci kyseliny ve
vzorku a z takto vypočítané koncentrace lze určit hmotnostní procento dané látky
podle vztahu [4]:
m
fMVc
w zř 100
%
××××
= (3)
7. Závěr
Do závěru uvedeme obsahy kyselin v Syntronu a porovnáme s bezpečnostním
listem (EDTA 70 ­ 80 %, NTA max. 6,5 %).
Použitá literatura
[1] Pěnčíková H. (2003). Analytická chemie a chemická laboratorní cvičení, SPŠCH,
Brno
[2] Čůta, K. a kol.(1986). Instrumentální analýza. SNTL, Praha.
[3] Brodová M. (2007). Možnosti zkoncentrování a frakcionace amfolytů na přístroji
EA 102 (Villa Labeco, SR) s off-line detekcí, Diplomová práce, Masarykova
univerzita v Brně, Brno
[4] Pěnčíková H. (1997). Chemické výpočty, Cerm, Akademické nakladetelství Brno