snímek 1 Chromatografické metody ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 2 Podstata ,,Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze ­ stacionární a mobilní." ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 3 Chromatografie ˇ Mobilní fáze - kapalina ­ LC plyn ­ GC ˇ Eluce - Izokratická ­ stejná eluční síla Gradientová ­ rostoucí eluční síla ˇ Použití - analytická preparativní ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 4 Kapalinová chromatografie LC| ˇ Mobilní fáze - kapalina ˇ Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 5 Provedení LC ˇ Papírová PC ˇ Tenkovrstvá TLC ˇ Kolonová CC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 6 Teoretické aspekty chromatografie ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 7 Chromatografie ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 8 Chromatogram Vm Vr' Vr ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 9 Retenční ­ eluční čas tr ˇ Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční ­ eluční objem Vr ˇ Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky mrr FtV = Fm ­ objemová rychlost mobilní fáze ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 10 Mrtvý objem 'rmr VVV += Vr ­ zdánlivý retenční objem Vr'- redukovaný (skutečný) retenční objem Vm- mrtvý objem ­ mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 11 Kapacitní faktor k' M S D m r m mr V V K V V V VV k == - = ' ' M S D c c K = Vs ­ objem stacionární fáze VM ­ objem mobilní fáze cs ­ rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM ­ rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi Distribuční koeficient k'= 1 ­ 10 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 12 Účinnost kolony počet teoretických pater N Yr Yr 2 16 ¸ = r r Y t N 2 545.5 ¸ ¨ § = r r Y t N 1/2 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 13 Účinnost kolony výškový ekvivalent teoretického patra H l N H = l ­ délka kolony ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 14 Účinnost kolony ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 15 Rozlišení tr1 tr1 Yr1 Yr2 21 12 12 )(2 rr rr YY tt R + - = R12=1.5 ­ nulové překrytí R12=1.0 ­ překrytí 2 % Yr1 Yr2 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 16 Síly a efekty využívané při separaci ˇ Iontové síly ˇ Polární síly ˇ Nepolární síly ˇ Sterické interakce ˇ Efekt velikosti molekul ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 17 Rozdělovací chromatografie ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 18 Rozdělovací chromatografie cS cM M S D c c K = Použití ­ analytická PC, TLC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 19 Adsorpční chromatografie ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 20 Adsorpční chromatografie cS cM M M S ca ca c + = 1 1Mca1 Mca ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 21 Adsorpční chromatografie ˇ Stacionární fáze ­ polární Silikagel SiO2 . n H2O Oxid hlinitý Al2O3, AlO(OH), Al(OH)3 Hydroxyapatit [Ca5(PO4)3OH] ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 22 Adsorpční chromatografie ˇ Mobilní fáze ­ nepolární ˇ Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíkyMrB>MrC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 52 Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Totální permeace Selektivní permeace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 53 Gelová permeační chromatografie ˇ Nanášení vzorku ­ objem vzorku < 2% objemu kolony ˇ Eluce ­ izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 54 PC a TLC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 55 PC a TLC ˇ 1944 ­ Martin, Snyge - PC aminokyselin (Nobelova cena) ˇ 1952 ­ TLC nahrazuje PC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 56 Instrumentace PC a TLC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 57 Chromatografický papír ˇ Nemodifikovaný ˇ Modifikovaný ­ ionexy, acylace f. Watman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 58 TLC ˇ Vlastní příprava - sypané, nalévané ˇ Komerčně dostupné - Siluful (Cz) Watman ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 59 PC a TLC - mody ˇ rozdělovací ˇ adsorpční ˇ ionexová ˇ hydrofobní ­ RP a HIC ˇ gelová permeační ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 60 Nanášení vzorku ˇ Pipety ˇ Kapiláry ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 61 Provedení ˇ Vzestupné ˇ Sestupné ˇ Kruhové ˇ Dvojrozměrné ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 62 Vzestupné ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 63 Sestupné ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 64 Kruhové ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 65 Vyvíjení ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 66 Dvojrozměrné ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 67 Provedení ˇ Analytické ˇ Preparativní ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 68 Analýza kvalitativní standardy vzorky larozpouštěd čelo skvrny střed fR = ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 69 Analýza kvantitativní ˇ Planimetrie ˇ Denzitometrie Plocha skvrn ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 70 Denzitometrie ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 71 Denzitometrie ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 72 Preparace ˇ PC ­ vystřižení a eluce skvrny ˇ TLC ­ vyškrábání a eluce skvrny ­ odsání a eluce skvrny ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 73 Chromatografie ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 74 Chromatografie ˇ Cvet ­ separace chlorofylů na Al2O3 1906 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 75 Kapalinová chromatografie rozdělení ˇ Nízkotlaká (atmosferický tlak) ­ LPC ˇ Střednětlaká (4 Mpa) ­ FPLC ˇ Vysokotlaká (40 Mpa) ­ HPLC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 76 Kapalinová chromatografie využití ˇ LPC ­ semipreparativní ˇ FPLC ­ semipreparativní a analytická ˇ HPLC ­ analytická ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 77 Kapalinová chromatografie doba trvání ˇ LPC ­ hodiny ˇ FPLC ­ desítky minut ˇ HPLC ­ minuty ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 78 Zařízení pro LPC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 79 Instrumentace pro LPC ˇ Pumpa ­ peristaltická nebo gravitace ˇ Gradient ­ mísič gradientu ˇ Dávkování ­ přímo pumpou na kolonu ˇ Kolony ­ skleněné ˇ Detekce ­ spektrofotometrická 254, 280 nm ˇ Vyhodnocování ­ zapisovač ˇ Sběrač frakcí ­ programovatelný ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 80 Instrumentace pro FPLC a HPLC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 81 Zařízení pro HPLC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 82 Pumpy ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 83 Tlaková pumpa ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 84 Lineární dávkovače ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 85 Pumpa jednopístová ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 86 Pumpa dvoupístová ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 87 Pumpa dvoupístová ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 88 Pumpa dvoupístová ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 89 Tlumení pulsů ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 90 Tlumení pulsů ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 91 Gradient nízkotlaký ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 92 Gradient vysokotlaký ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 93 Dávkování ­ dávkovací ventil ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 94 Dávkovací ventil ­ ,,Load" ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 95 Dávkovací ventil ­ ,,Inject" ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 96 Kolona ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 97 Částice sorbentu ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 98 Detektory ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 99 Refraktometrický detektor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 100 Refraktometrický detektor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 101 Refraktometrický detektor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 102 UV ­ VIS detektor detekční cela ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 103 UV ­ VIS detektor s fixní vlnovou délkou ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 104 UV ­ VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 105 UV ­ VIS detektor s diodovým polem ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 106 Fluorescenční detektor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 107 Elektrochemický detektor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 108 Konduktometrický detektor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 109 LC-MS ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 110 ,,Termospray" ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 111 ,,Electrospray" ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 112 Ionizace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 113 Derivatizace ˇ ,,pre-column" - před vlastní analýzou ˇ ,,post-column" ­ za kolonou po analýze ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 114 Šum a drift detektoru Mez detekce S/N > 2-3 Mez stanovitelnosti S/N > 10 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 115 Vyhodnocení ˇ Zapisovače ˇ Integratory ˇ Integrační software + PC ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 116 Provedení ˇ Analytické ˇ Preparativní ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 117 Analýza kvalitativní ˇ Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů ˇ ,,spiking" ­ přidání standardu do vzoru nárůst výšky píků ˇ Specifická detekce ­ UV-VIS, fluorescence, elektrochemická ˇ MS ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 118 Analýza kvantitativní Plocha (výška) píku ˇ Metoda externího standardu ˇ Metoda vnitřního standardu ˇ Metoda standardního přídavku ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 119 LC analýza ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________