Elektromigrační metody Podstata "Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli" Historický přehled 1880 - první elektroforetické separace Smirnow,Hardy 1897 - regulační frunkce Kohlrausch 1930 - volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) 1962 - izoelektrická fokusace Vesterberg, Svensson * - kapilární elektroforéza v rotující 1 - 3 mm křemenné kapiláře Hjerten 1970 - SDS PAGE Laemmli 1975 - 2D-elektroforéza O´Farrell 1976 - isotachoforéza Everaerts, Mikkers Teoretické aspekty elektromigračních metod Mobilita Elektrická síla F[e ] Sekundární jevy * Jouleovo teplo * Elektroosmóza Jouleovo teplo Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok Původ elektroosmotického toku Elektroforéza "Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit" Elektroforéza * Volná * Zónová Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Stabilizace * Rotací * Gradienty hustoty * Porézními medii * Kapilárou Požadavky na porézní media * Homogenita * Inertnost - nespecifické interakce - nulový EOF * Reprodukovatelná a snadná příprava * Mechanická pevnost * transparentnost Upořádání Upořádání Chromatografický papír Složení -- celulosa - Nehomogenní - Přítomnost ionogenních skupin - Špatně se chladí -- pálí se Použití : téměř už se nepoužívá Agar a agarosa Složení -- kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy - Přítomnost ionogenních skupin -- silný EOF + Velké pory + Snadná příprava Použití : imunoelektroforetické metody elektroforéza NK Acetát celulosy Složení -- acetát celulosy + Komerčně dostupný + Dobré mechanické vlastnosti Použití : imunoelektroforetické metody klinické aplikace Škrob Složení -- hydrolyzovaný škrob + poprvé se uplatňuje efekt molekulového síta - Špatné mechanické vlastnosti - Komplikovaná a nereprodukovatelná příprava - Není transparetní Použití : izoenzymová analýza Sypané vrstvy Složení -- Sephadex -- zesíťovaný dextran + uplatňuje efekt molekulového síta Použití : preparativní Polyakrylamid Složení -- kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid Polyakrylamid - příprava Radikálová polymerace * Katalyzátor -- tetramethylethylendiamin TEMED * Iniciátor - chemicky -- (NH[4])[2]S[2]O[8] - fotochemicky -- ribloflavin + UV Polyakrylamid - složení Fergussonova rovnice Uplatnění Fergussonovy rovnice Provedení PAGE vertikální x horizontální deskové x trubičkové homogenní x gradientové kontinuální x diskontinuální Provedení PAGE Provedení PAGE Diskontinuální PAGE Orstein, Davis SDS PAGE SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy Použití SDS PAGE * Stanovení Mr * Analýza komplexních směsí * Sledování purifikace bílkovin * Stanovení podjednotkového složení PAGE - sekvenace DNA Kapilární zónová elektroforéza CZE Módy CZE Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře Výsledná mobilita částic při CZE Separace aniontů pomocí CZE Princip MEKC Micelární elektrokinetická chromatografie Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC Kapilární gelová elektroforéza CGE fragmentů dsDNA Instrumentace CZE Schéma zařízení pro CZE Napájecí zdroj * stabilizovaný +/- 30 kV 300 ěA * konstantní napětí nebo proud * obojí polarita * ochrana obsluhy Kapilára * křemenná - 25 -100 ěm i.d - 350 ěm o.d. * délka až 100 cm délka * polyimidové vnější pokrytí Dávkování - hydrodynamické Dávkování - elektrokinetické Detekce spektrofotometrická Detekce fluorescenční Izoelektrická fokusace "Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI" Tvorba gradientu Anoda (+) H[3]O^+ 6H[2]O(r)O[2] + 4H[3]O^+ + 4 e^- Katoda (-) OH^- 4H[2]O(r)2H[2] + 4OH^- - 4 e^- Izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace Kapilární izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace analytická * Provedení - v gelech -- PAGE, agarosa * Použití - sledování komplexních směsí - izoenzymové složení - stanovení pI -- rozřezání a eluce -- mpH elektrody -- pI standardy Izoelektrická fokusace analytická Izoelektrická fokusace analytická Izoelektrická fokusace analytická - standardy Izoelektrická fokusace preparativní * Provedení - v sypaných vrstvách -- Sephadex - v gradientech hustoty -- sacharoza - rotací -- Rotofor (BioRad) * Použití -- izolace bílkovin Dvourozměrné metody * Metoda titračních křivek * Dvourozměrná elektroforéza Metoda titračních křivek Dvojrozměrná elektroforéza Dvojrozměrná elektroforéza Dvojrozměrná elektroforéza Izotachoforéza "Vzorek je umístěn mezi dva elektrolyty : vedoucí L (leading) s nejvyšší mobilitou a - uzavírající T (terminating) s nejmenší mobilitou" Izotachoforéza Izotachoforéza Izotachoforéza Kohlrauschova regulační funkce Analytická ITP Analytická ITP instrumentace * Napájení - stejnosměrné 30 kV 0,2 -- 0,5mA * Kapilára 0,1 -- 2 mm * Dávkování - dávkovací ventil * Detekce - universální -- konduktometrická -- potencialně gradientová - selektivní -- UV-VIS Analytická ITP Metoda spojování kapilár Izotachoforetický záznam kvantita Izotachoforetický záznam kvalita Preparativní ITP Preparativní ITP Detekce po elektroforéze a izoelektrické fokusaci Nespecifická detekce Nespecifická detekce Nespecifická detekce Fluorescenční detekce Specifická detekce Autoradiografie Specifická detekce Detekce glykoproteinů Detekce na základě biologické aktivity Detekce na základě biologické aktivity Blotting * Southern -- DNA * Nothern -- RNA * Western - bílkoviny Difuzní blotting Vakuový blotting Kapilární blotting Tankový elektroblotting Tankový elektroblotting Tankový elektroblotting Mini Protean Trans Blot Cell "Semi dry" blotting "Semi dry" blotting Kapkovací dot blotting