snímek 1 Srážecí metody ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 2 Srážení ˇ Nezaměňovat s denaturací ­ bílkoviny zůstávají v nativním stavu ˇ První metody používané pro separaci bílkovin ­ EtOH, (NH4)2SO4 ˇ Filtrace nahrazena centrifugací ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 3 Rozpustnost bílkoviny ˇ Vlastnostmi bílkoviny ­ distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny + + + - - ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 4 Rozpustnost bílkoviny ˇ Vlastnostmi roztoku ­ pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 5 Izoelektrická precipitace pH rozpustnost pI + - + - - -- - + ++ + ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 6 Srážení neutrálními solemi I rozpustnost vsolování vysolování ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 7 Vsolování - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 8 Vysolování ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 9 Praktické aspekty ˇ Hofmeistrova řada Anionty SCN-, J-, ClO4 -, NO3 -, Br-, Cl-, Ac-, SO4 2-, PO4 3- Kationty Na+, K+, NH4 + ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 10 (NH4)2SO4 ˇ Rozpustnost se málo mění s teplotou ˇ Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) ˇ Levný ˇ Stabilizuje bílkoviny ˇ Relativně čistý ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 11 Srážení - dvojstupňově 0 20 40 60 80 100 % saturace % Bílkovina Aktivita ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 12 Přidané množství ˇ Tabulky ˇ Vzorce 2 12 3.0100 )(533 / S SS lg - - = ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 13 Provedení El. míchačka Chlazení Míchání 10-30' Centrifugace pevný (NH4)2SO4 nebo saturovaný roztok (NH4)2SO4 úprava pH NH4OH ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 14 Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou ˇ Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 15 Výběr rozpouštědla ˇ Kompletně mísitelné s vodou ˇ Nereaguje s bílkovinou ˇ Musí mít dobrý precipitační efekt EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 16 Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou ˇ COHN ­ separace plazmatických bílkovin EtOH ˇ Nutno provádět při T < 0 oC, při větší teplotě dochází k denaturaci ˇ Dvojstupňově ˇ Přídavky z tabulky nebo podle vzorce ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 17 Srážení org.polymery Princip identický s rozpouštědly ˇ DEAE dextran ˇ PEG ˇ Polyakrylová kyselina ˇ Rivanol ˇ Kaprylová kyselina ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 18 Srážení selektivní denaturací ˇ Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. ˇ Denaturační vlivy ­ T, pH, org. rozpouštědla ˇ Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 19 Tepelná denaturace 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 teplota % Bílkovina 1 Bílkovina 2 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 20 Tepelná denaturace ˇ Doba inkubace je důležitá pouze pro reprodukovatelnost ­ denaturační křivka se tím posouvá po teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů ˇ Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 21 ˇ pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno ˇ Při vyšší teplotě běží více proteolýza ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 22 pH denaturace ˇ Provádět za definované teploty ˇ Změny pH dělat co nejrychleji ˇ Pro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 23 pH 5 HAc pH 8 Tris pH 4 k.mléčná pH 9 DEA pH 2 H3PO4, H2SO4 pH 11 NaOH ˇ Extrémy pH ­ bílkovina silně ionizovaná a zůstává v rozpuštěném stavu nutná zpětná úprava pH ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 24 ˇ Pří srážení organickými rozpouštědly ­ T < 0 oC ˇ Pří denaturaci organickými rozpouštědly ­ T = 20 ­ 30 oC ˇ Alkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv ˇ T a pH musí být přesně definovány EtOH, MetOH, aceton Denaturace org.rozpouštědly ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________