9. Kombinace chromatografických metod s hmotnostní spektrometrií II. KapalinovKapalinováá chromatografie (LC/MS)chromatografie (LC/MS) Technika LC/MS Analýza látek s většími M, větší polaritou nebo menší T stabilitou, než látky analyzované prostřednictvím GC (dnes hlavně bioanalytická chemie ­ velké M) vzorek roztok separace na koloně hmotn. detekce ! Rozdíl tlaků mezi LC a MS je podstatně větší než u GC/MS ! 0,5 - 5 cm3 min-1 ( l fáze ) 100 ­ 3000 cm3 min-1 (g fáze) srovnej GC: 5-20 cm3 atm min-1 Srovnání průtokových množství aplikovaných u metody GC a LC: Historie vývoje technik LC/MS Systém přerušovaného dávkování: HledHledáánníí co nejvhodnco nejvhodněějjšíšího zpho způůsobu zohledsobu zohledňňujujííccííhoho vysokvysokéé ppřřetlaky (jejich petlaky (jejich přříípadnpadnáá eliminace)eliminace) Následující způsob je nepřímý evakuováno a zahřáto (70-120 C) => odchod rozpouštědla rotační vývěva Technika umožňuje provádět také techniku EI Bohužel existuje časová prodleva analýz (3-5 min) => nezachytí se všechny eluované zóny Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. Následující techniky patří do přímých metod Tzv. DLI (direct liquid introduction) ­ 1970 Typické rysy: Převážně CI od rozpouštědla nebo pro zamezení nutnost odstranění nosného média (např. jako u nepřímé metody) Kromě CI lze využít také možnost ionizace FAB CI je schopna pracovat s průtoky 5-50 l min-1 Technika split: klasické průtoky 1-2 ml min-1 splitless: mikrochromatografie (l min-1) Přímé spojení za použití splitru eluátu: Prochází jen část eluátu => klesá citlivost (analyt včetně média) = 5-15 m Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. Ochlazení eluátu pro zamezení odpařování rozpouštědla a ucpávání otvůrku vzorkem Přímé spojení s odčerpáváním par rozpouštědla: V závislosti na obsahu rozpouštědla je získána kromě CI eventuelně také (EI) Desolvatace probíhá pod vakuem Interface řešitelný také např. vyhřívanou trubičkou, fungující jako desolvatační komůrka, a dovnitř IZ pak prochází v parách vše pomocné vakuum Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. (nečerpaná a ukončená tryskou) Spojení kapalinové chromatografie a dávkování roztoků s ionizací FAB: (přímé nevyhřívané spojení) dopad do středu na eluát průtok = 2-10 l min-1 eluát obsahuje pro zajištění optimální citlivosti 10-15% glycerinu Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. Spojení nerezovou fritou pro ionizaci FAB: Okamžité odpaření rozpouštědla Přídavek glycerinu (15%) průtok = 0,5 l min-1 Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. zůstane analyt rozpuštěný v glycerinu Rozprašovač (rozmlžovač): průtok = až do 2 ml min-1 = 100 m Rozprašovač může být zaveden přímo do IZ nebo funguje jako součást tryskového separátoru GC/MS (odstranění nosného plynu a rozpouštědla) Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. Následující techniky založeny na použití "dopravníku" Představují snad nejdokonalejší způsob, ale! Typické rysy: První metoda s použitím drátku, procházejícího vaničkou s eluátem; následovala dvoukomorová desolvatace a těsně před prostorem IZ byla zóna zahřáta a látka odpařena do IZ (využito ca 1% eluátu) Další vývoj: kovový pásek (šířka ca 3 mm a přikapávání eluátu) Technika vhodná pouze pro termicky odolné látky Existence paměťového efektu ­ nevýhoda => nutnost čištění pásku Technika umožňuje EI, CI (i jinými médii), FAB apod. (zatím nejuniverzálnější použití pro využití všech typů ionizací) Pohybující se pás: Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. Odstranění rozpouštědla Zde již zasunuto do IZ Spojení kovového pohybujícího se pásu s desorpcí pulsním laserem: Historie vývoje technik LC/MS - pokrač. Současné (komerční) techniky LC/MS Využívají spoluúčasti nebo eliminace rozpouštědla Při zahrnutí celého objemu (rozpouštědlo, pufry, analyt) je pro ionizaci využito typických efektů v IZ Hlavní druhy interface: Particle Beam (! jediný interface, nevyžadující modifikaci IZ !) Termosprej (TS) Elektrosprej (ES) Speciální odvozené techniky (ionsprej, nanosprej, apod.) APCI (MALDI/TOF) Particle Beam (proud částic) součásti:- zmlžovač (sítko) - vyhřívaná desolvatační komora (40-70 C, p 50kPa) - dvoustupňový separátor - dvoustupňové vývěvy (2x) média: - mobilní fáze s rozpuštěným vzorkem (0,2-1 ml min-1) - zmlžující plyn He (1-2 l min-1) srovnej GC - řádově ml min-1 Schematické znázornění spojení LC/MS (Particle Beam): 1 mbar => prostřednictvím vysokokapacitní vývěvy odstraněno dalších 90%He a solventu 10 mbar => prostřednictvím nízkokapacitní vývěvy odstraněno 90%He a solventu 500 mbar (50 kPa) Výhody: - bez modifikace IZ - získání spekter v módu EI a CI - použití běžných rozpouštědel jako mobilní fáze (voda, methanol, acetoniltril, hexan ap.) - použití pro slabě a středně polární látky do 1000 a.m.u.(steroidy, aflatoxiny, pesticidy ap.) Nevýhody: - omezení na nepufrované prostředí - nelze použít pro těkavé látky (odsátí) - polární a vysokomolekulární látky se obtížně zplyňují Analýza 6-benzylaminopurinu metodou HPLC/LINC/MS (1mg/ml, 20l do MeOH:H2O=1:1, pHe=0,3MPa, LINC 50 C) hmotnostní chromatogram (m/z = 224 - 226) TIC Porovnání spektra 6-benzylaminopurinu s knihovnou NIST Analýza kys. benzoové metodou HPLC/LINC/MS (2mg/ml, 20l do MeOH:H2O=1:1, pHe=0.4MPa, LINC 50 C) Porovnání spektra kys. benzoové s knihovnou NIST Thermospray (TS) Princip:Princip: Eluát zaveden přes vyhřívanou kapiláru (ca 150 C) přímo do IZ (tvorba "nadzvukového" proudu par s kapičkami a částicemi) Dochází k postupné desolvataci kapiček Vznik vysokého potenciálového spádu na povrchu kapiček povrchový náboj (107 V m-1), který vzrůstá se zmenšující se velikostí při jejich odpařování (odpařování rozpouštědla) ­ dáno přenosem náboje mezi ionty solí a analytem 3 spolupůsobící druhy ionizace: - desorpce polem (potenciálový spád na povrchu kapiček) - CI (pufry ­ octan sodný apod.) - EI (při použití pomocné katody ­ u látek, kde selhávají předešlé druhy nebo k provedení dodatečné fragmentace) fragmentační elektroda (prudké odpaření eluátu) Thermospray - pokrač. Kombinace ionizačních technik umožňuje aplikaci širokého spektra mobilních fází s různými průtoky Tlak v IZ je 500 ­ 2000 Pa Velikost kapiček ca 1m Častá tvorba aduktů MH+ a MX+ z pufrů (Na, K, NH4 + apod.) U řady polárních látek vznikají se snižující se hodnotou pH často více protonované ionty (2, 3, 4 apod.) Při použití rozpouštědel jako metanol a etanol nepozorován téměř žádný mechanismus ionizace polem (FI) ­ zvýšení až po přídavku vody Běžná koncentrace pufru Ac-NH4 + = 0,1M Frangmentační elektroda může vést i k CI z pufrů u látek, které nebyly ochotny podlehnout CI (nepolární látky) Schematické znázornění spojení LC/MS (Themospray): AcNH4 iridiové vlákno Výkonné vývěvy = velké průtoky repelentní elektrodatzv. plasmaspray Schematické znázornění tvorby iontů během procesu v termospreji (vypařování iontů): ionty solí analyt ionty solí Další interface založeny na ionizaci za atmosférického tlaku - APIAPI ESIESI (elektrosprej a jeho modifikace) APCI (viz. již dříve u metody CI) Schematické znázornění rozhraní API: (podrobný rozbor metody a technik ­ viz. dále) Electrospray (ES) Princip:Princip: Proces probíhá za atmosférického tlaku Eluát zaveden přes trysku (velice úzká kapilára) přímo do IZ Dochází ke vzniku "nadzvukového" proudu kapaliny Mezi ústí kapiláry a zaostřovací clony vloženo napětí (5 kV) Do prostředí IZ zaváděn sušící plyn (N2) Vzájemné působení tlaku kapaliny, povrchové tenze a vysokého pole na povrchu kapaliny na konci kapiláry vznikají nabité kapičky Kapičky roztoku rozstřikovány proti proudu N2 ­ rychlé odpaření rozpouštědla Důležité: technika šetrná pro termicky labilní látky Electrospray - pokrač. Způsob ionizace: - Coulombická exploze (při převýšení kohézních síl Coulombickými) Většinou dochází k řetězové explozi => vznik několikanásobně nabitých iontů Typické průtoky 5-15 l min-1 Technika aplikovatelná i na látky, neochotně tvořící ionty (pak vznik aduktů s Na, K apod.) typické => aplikovatelnaplikovatelnéé pro studiumpro studium biomolekulbiomolekul (velké snížení m/z) Schematické znázornění spojení LC/MS (Electrospray): 5 kV Schematické znázornění techniky Electrospray a Coulombických explozí: Electrospray - pokrač. Odvozené techniky: IonsprayIonspray ­ místo trysky použit rozmlžovač => vyšší průtokové rychlosti (jako u TS) ­ běžně 50-200 l min-1 a při použití stínících clon (splitter), zamezujících kondenzaci kapiček při vysokých průtokových rychlostech, až 2 ml min-1 a vznik mlhy méně závislé na povaze kapalné fáze NanosprayNanospray ­ nl množství => snížení citlivosti na atomární úroveň (fmoly, attomoly) MikroIonsprayMikroIonspray ­ ionspay s nízkými průtoky PhotosprayPhotospray ­ použití zdroje UV záření pro ionizaci látky fotony Schematické znázornění spojení LC/MS (Ionspray): Schematické znázornění teorie iontového vypařování u techniky Ionspray: Schematické znázornění spojení LC/MS (Nanospray): Schematické znázornění spojení LC/MS (MicroIonspray): Electrospray - pokrač. Dekonvoluce: pro vyhodnocení struktury komplikovaných biopolymerních látek (proteiny = bílkoviny, glykoproteiny - enzymy, hormony apod.) a jejich směsí využito: - vysokého náboje iontů (molekula + fragmenty) a - rozsáhlých knihoven spekter + statistických metod Statistické rozdělení na vícemocné ionty => počítačovou dekonvolucí lze zjistit M +ˇ (aplikace programových algoritmů) Pozn.: funguje zatím pouze pro jednoduché směsi Určení molekulové hmotnosti (M) myoglobinu: Určení M myoglobinu: - pokrač. Určení molekulové hmotnosti (M) tří proteinů ve směsi: Spektrum směsi cytochromu C, myoglobinu a lysozimu Určení M tří proteinů ve směsi: - pokrač. Počítačová dekonvoluce výchozího spektra směsi Určení M tří proteinů ve směsi: - pokrač. Automaticky počítačově vypočítané M tří sloučenin Potvrzení syntézy peptidu prostřednictvím ES: Peptid KGGVFWDPNCVTA s molekulovou hmotností 1362 Da Peptid obsahuje jedno a dvojmocně nabité ionty a fragmenty API - opakování (viz. již přednáška č.4) ESI (velice podobné uspořádání iontových zdrojů) APCI (elektrosprej) (realizovatelnost díky výkonným vývěvám) (pro kladné i záporné ionty) (podobná citlivost) Princip: ionizace prostřednictvím koronárního výboje APCI nebo zářiče Výsledek: vznik aduktů s molekulami mobilní fáze soli - [M+1]+ => H, [M+23]+ => Na, [M+39]+ => K, [M+18]+ => NH4 apod.) ! voda, metanol, aceton apod. mohou také ionizovat ! (na konci kapiláry dochází ale obecně k odpaření rozpouštědla) u CI- vzniká často [M-1]Metoda umožňuje určení molekulové hmotnosti až do 200 kDa ! Na rozdíl od ES - vznik vícemocně nabitých iontů eliminován ! Schematické znázornění zdroje pro APCI: Pozn.: v jiných literárních zdrojích je uváděna teplota 300 ­ 600C Schematické znázornění zdroje pro APCI: - pokračování Analýza látek prostřednictvím APCI: Kolizí indukovaná disociace (CID) PomocnPomocnéé mméédium nebodium nebo fragmentafragmentaččnníí elektrodaelektroda nebo obojnebo obojíí Příklad aplikace techniky CID: Příklad aplikace techniky CID: - pokrač. Srovnání techniky MS/CID/MS a LC/CID/MS: (He, Ar, Xe, N2 ) Schematické znázornění techniky trojitého quadrupólu: Srovnání citlivosti jednoduchého a násobného dělení (jediný a dvojitý quadrupólový analyzátor): Schematický obrázek přístroje od firmy Perkin Elmer (skupina AppliedApplied BiosystemsBiosystems): Komerční přístroje pro LC/MS (CID) Schematický obrázek přístroje od firmy Perkin Elmer (skupina AppliedApplied BiosystemsBiosystems): Matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) coupled with (TOF) analyser Princip:Princip: Na podložku na které je nanesen vzorek v prostředí matrice (pomocné médium) je zaměřen pulsní laserový paprsek Část matrice se vzorkem je odpařena a ionizována (spolupůsobení pomocného ionizujícího média). Pozn. soli neinterferují se vzorkem Technika je relativně energeticky šetrná (závislost na Epaprsku) Nedochází ke vzniku několikanásobně nabitých iontů jako u eletrospreje a je velice omezena fragmentace Ionizační technika kombinována s analyzátorem doby letu (TOF), který je schopen velice rychle indikovat ionty až do ca 100 kDa Důležité: technika šetrná pro termicky labilní látky a velice účinná pro analýzu biomolekul (glycerol, Li soli, slabé arom. kyseliny) (ovlivnění výsledného spektra) Schematické znázornění spojení MALDI/TOF: Hmotnostní spektrum albuminu z hovězího séra v matrici kyseliny sinapinové získané technikou MALDI/TOF (kyselina 3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicové) Shrnutí Aplikovatelnost techniky LC/MS v závislosti na molekulární hmotnosti látek a jejich polaritě