MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE v UV a viditelné oblasti spektra 3 Kinetické metody • Analyt představuje katalyzátor = aktivátor nebo inhibitor. • Rychlost katalyzované reakce ≈ koncentraci katalyzátoru = koncentraci analytu • Reakce 1. řádu vzhledem k reaktantům a produktům • Změna absorbance reaktantu nebo produktu s časem • Diferenciální technika Kinetické metody Kinetické metody • Vyhodnocení dat • Metoda tangent Kinetické metody • Vyhodnocení dat • Metoda konstantního času Kinetické metody • Vyhodnocení dat • Metoda fixní koncentrace reakčního produktu Kinetické metody Kinetické metody Příklad: Fotometrické stanovení fluoridů • Katalytický účinek fluoridových iontů na reakci Zr(IV) v prostředí Cl^- s organickými barvivy • Princip: Depolymerace hydroxokomplexů Zr(IV) v přítomnosti F^- - rychlá tvorba ternárních komplexů s: – Xylenolovou oranží – Methylthymolovou modří – Glycin-thymolovou modří – Arsenazo III • Polymerní Zr(IV) reaguje s barvivy pomalu, avšak v přítomnosti F^- se tvoří ZrF^3+, ZrF[2]^2+ a tyto rychle reagují s barvivem . Koncentrace fluoridů musí být substechiometrická vzhledem k Zr(IV). Nadbytek F^- způsobuje rozklad chelátu a ztrátu zbarvení Kinetické metody Příklad: Fotometrické stanovení fluoridů • Podmínky měření – Roztok Zr(IV) musí být starší (polymerace) – Zbarvení se vyvíjí po dobu 90 minut (Xylenol. Oranž) – c[HCl ]v rozmezí 0.3 – 0.45 mol/L – λ[m ]= 530 nm, ε = 2.0x10^5 L·mol^-1 ·cm^-1 • Meze detekce 10^-3- 10^-6 μg ·mL^-1 • Rychlost a opakovatelnost reakce závisí na: – Teplotě – Iontové síle – Reakčním prostředí (doprovázející ionty) • Nízká selektivita, nutnost maskování nebo separace rušících iontů (anionty P,As,S,Ox,Citr.) Kinetické metody Příklady fotometrických stanovení: katalýza oxidačních procesů Kinetické metody Příklady fotometrických stanovení: katalýza oxidačních procesů Kinetické metody Příklady fotometrických stanovení: katalýza oxidačních procesů Kinetické metody Enzymově katalyzované reakce • Stanovení: – Enzymové aktivity – Koncentrace substrátu E + S « (k[1+] , k[1-]) X (k[2+])  P + E[] Kinetické metody Enzymově katalyzované reakce Počáteční rychlost reakce v[0] Kinetické metody Enzymově katalyzované reakce • Vyhodnocení koncentrace enzymu metodou: • tangent • fixního času – Enzymy - vysoká selektivita, m.d. 10^-8-10^-10 mol/L při 10^-6 mol/L substrátu, skladování<5°C, inaktivace >30 °C, inaktivace pH<5, pH>9, denaturace org. rozp., stabilizace vysokými konc. inertních solí. – Spektrofotometrické stanovení vybraných enzymů Kinetické metody Enzymově katalyzované reakce Kinetické metody Enzymově katalyzované reakce