MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE v UV a viditelné oblasti spektra 3 Kinetické metody Analyt představuje katalyzátor = aktivátor nebo inhibitor. Rychlost katalyzované reakce « koncentraci katalyzátoru = koncentraci analytu Reakce 1. řádu vzhledem k reaktantům a produktům Změna absorbance reaktantu nebo produktu s časem 1. Diferenciální technika aA + bB^P — ~ — = k0(cA ~x)a + kx{cA -x)acK dt dt ^—-^------J v ____J X = koncentrace produktu P N e kata lyžován á Katalyzovaná cK = koncentrace katalyzátoru reakce reakce cA = koncentrace složky A na . n počátku reakce v čase ° k-,^^0 limitujícím k nule Kinetické metody Počátek reakce: t —>0; (cA-x) —► cA^> A = (k0cA+k1cA-cK)-t Rychlost reakce je úměrná cK a v počátku reakce ji lze považovat za konstantní Podmínky analytického využití • Citlivé určení malého množství reakčního produktu P nebo složky A • Splnění Beer-Lambert-Bouguerova zákona • Reakční rychlost nekatalyzovane reakce musí být zanedbatelná vůči rychlosti katalyzované reakce dA dx dt dt = k0cA + kxcA í c K Kinetické metody A Vyhodnocení dat a) Metoda tangent / CK4 /CK3 ya4y /CK2 /^h/ ^ CK1 V"2^<\ ^0 yy^^^^^ •* '■* « řga = (V^+^B^) Kalibrační přímka tga tga4 tga3 ' tga2 r * tga1 |tga0 ' i ' i t (min) 'K1 CK2 CK3 cK4 (mol/L) Kinetické Vyhodnocení dat b) Metoda konstantního času A A4 / CK4 A3 / /CK3 ^^ CK1 ___^0 A2 // A0 "V^^ A t (min) t konst metody A = (k0cA + kxcA • cK) Kalibrační přímka blank cK1 c^ cK3 c (mol/L) Kinetické • Vyhodnocení dat c) Metoda fixní koncentrace reakčního produktu t4 t3 t2 t1 t (min) t0 metody Kalibrační přímka 1/I4 1/I3 ' 1/t2 ' ' 1/t-l ' 1 9/ blank c kí CK2 CK3 cK4 (mol/L) Kinetické metody 2. Integrální technika Je vhodná při nezanedbatelné změně cA a při startu katalyzované reakce se zpožděním. Integrovaná forma diferenciální rovnice 1. řádu c c \ In—-— = k-ck-t log—-— =---------k-cK-t cA-x ca~x 2.303 c Á - XA 1 — k'cK cA-x 2.303 log^^ = —------k'CK-t Platí i při souběhu katalyzované a nekatalyzované reakce. Vyhodnocení se provádí například metodou tangent Kinetické metody Příklad: Fotometrické stanovení fluoridů • Katalyticky účinek fluoridových iontů na reakci Zr(IV) v prostředí Ch s organickými barvivy • Princip: Depolymerace hydroxokomplexů Zr(IV) v přítomnosti F-- rychlá tvorba ternárních komplexů s: - Xylenolovou oranží - Methylthymolovou modří - Glycin-thymolovou modří - Arsenazo III • Polymerní Zr(IV) reaguje s barvivy pomalu, avšak v přítomnosti F- se tvoří ZrF3+, ZrF22+ a tyto rychle reagují s barvivem . Koncentrace fluoridů musí být substechiometrická vzhledem k Zr(IV). Nadbytek F-způsobuje rozklad chelátu a ztrátu zbarvení Kinetické metody Příklad: Fotometrické stanovení fluoridů • Podmínky měření - Roztok Zr(IV) musí být starší (polymerace) - Zbarvení se vyvíjí po dobu 90 minut (Xylenol. Oranž) - cHC|V rozmezí 0.3 - 0.45 mol/L - Am = 530 nm, £ = 2.0x105 L-moM cnr1 • Meze detekce ICH3- 1CH3 ug -mĽ1 • Rychlost a opakovatelnost reakce závisí na: - Teplotě - Iontové síle - Reakčním prostředí (doprovázející ionty) • Nízká selektivita, nutnost maskování nebo separace rušících iontů (anionty P,As,S,Ox,Citr.) Kinetické metody Příklady fotometrických stanovení: katalýza oxidačních procesů Prvek Reakce c (ng/mL) ^max (nm) Cr(VI) Oxidace ortho-di-anisidinu H202 v HCl 1 -100 450 Fe(lll) Oxidace para-phene-tidinuH2O2s1,10-fenantrolinem jako aktivátorem 1 -100 536 Co(ll) Oxidace alizarinové červeni H202,alkal. p. 0.1 -1 555 Kinetické metody Příklady fotometrických stanovení: katalýza oxidačních procesů Prvek Reakce c (ng/mL) \nax (nm) Mo(VI) Oxidace kys. rubea-novodíkové H202 v HCl od 0.5 400 Cu(ll) Oxidace kyseliny sulfanilové H202 5-50 370 Ni(ll) Oxidace půs. H202 pyrokatechin -3,5—di-sulfonové kyseliny 1 -10 420 Kinetické metody Příklady fotometrických stanovení: katalýza oxidačních procesů Prvek Reakce c (ng/mL) \nax (nm) Ag(l) Oxidace kyseliny sulfanilové peroxodisíranem 1 -35 535 V(V) Oxidace kys. galové peroxodisíranem 0.1 -0.8 425 Kinetické metody Enzymově katalyzované reakce • Stanovení: - Enzymové aktivity - Koncentrace substrátu E + S (k1+, k-,.) X (k2+) -> P + E Enzym Substrát Meziprodukt Produkt Enzym [E]0 počáteční koncentrace enzymu [S]0 počáteční koncentrace substrátu [E] = [E]0 - [X] ; [S] = [S]0 - [X] = [S]0 ; [X] < [E]0 ; [E]0 < [S]0 Ustálený stav: ^=*,.-[«H4-M)-*i--M-U*]=o at Kinetické metody Enzymově katalyzovane reakce Počáteční rychlost reakce v0 v0 = _ d[p] _ dt =*2+ M=- _ d[S] dt [El;[sl V o / [E]3 I [E]2 / [E], A [s]0 Kinetické metody Enzymově katalyzované reakce Vyhodnocení koncentrace enzymu metodou: 1. tangent 2. fixního času - Enzymy- vysoká selektivita, m.d. 10_8-10"10 mol/L při 10-6 mol/L substrátu, skladování<5°C, inaktivace >30 °C, inaktivace pH<5, pH>9, denaturace org. rozp., stabilizace vysokými konc. inertních solí. - Spektrofotometrické stanovení vybraných enzymů Kinetické metody Enzymově katalyzovane reakce Enzvm Substrát Produkt (měří se nebo reaguje s indikátorem) Indikátor (koenzym) Lipáza Hydroláza Esteráza Estery fluoresceinu Fluorescein Cholin esteráza Indofenylacetát Butyrylthiochinolin Indofenol -i Thiochinolin j aDithiobis-(nitrobenzoát) (LDH) Laktát-dehydrogenáza Kyselina mléčná Kyselina pyro hroznová NADH* Transamináza (GOT)glutamát-oxaloctové kys. K. asparagová +k. a-ketoglutarová Oxaloctová kys. NADH* *Dihydrogen nikotinamid adenin dinukleotid difosfát aTvorba 2-nitro-5-merkaptobenzoátu (400-420 nm) Kinetické metody Enzymově katalyzovane reakce Enzvm Substrát Produkt (měří se nebo reaguje s indikátorem) Indikátor (koenzym) Transamináza glutamát-pyro hroznové kyseliny (GPT) Kyselina a-ketoglutarová + 1-alanin Kys. pyrohroznová NADH*