Příprava vzorků pro transmisní elektronový mikroskop
2,5% GTA v 0,2M pufru (čerstvý!!!) ............................ nejméně 4 hod
vypírací roztok (stejný pufr co byl použit pro fixáž)....... 3 x15 min
pufr (fosfátový) + 2% roztok OsO4 1:1 ......................... 2 hod
vypírací roztok ............................................................... 3 x15 min
30% aceton ................................................................... 15 min
50% aceton ................................................................... 15 min
70% aceton ................................................................... 15 min (možnost přerušit přes noc)
80% aceton .................................................................... 15 min
90% aceton .................................................................... 15 min
95% aceton .................................................................... 15 min
100% aceton ................................................................... 15 min
pryskyřice + aceton 1:2 ................................................ 1 hod
pryskyřice + aceton 1:1 .............................................. 1 hod
pryskyřice + aceton 2:1 . ............................................. 1 hod
čistá pryskyřice (exikátor) ............................................. 24 hod
zalévat do formiček a dát do termostatu ........................ 24 hod
Materiál krájet na polotenké řezy pomocí ultramikrotomu a dále na ultratenké řezy.
Polotenké řezy barvit na sklíčku pomocí toluidinové modře. Ultratenké řezy kontrastovat na
síťkách pomocí uranylacetátu a lead citrátu. Velmi malé vzorky nebo suspense zalévat před a
nebo těsně po fixaci do 2% agaru. Agar nejdříve zahřát asi na 100°C a nechat vychladnout na
62°C. Zalévat při 62°C, potom krájet na malé kousky a zpracovávat dle standardních postupů.
Obr. 1. Membránový komplex povrchového epicytu u Gregarina garnhami, interní lamina
(šipka) a pórovité struktury. Transmisní elektronová mikroskopie.
Obr. 2. Oblast protomeritu u Gregarina polymorpha. Viditelný je membránový komplex
povrchového epicytu a septum (šipky) oddělující protomerit od deutomeritu. Transmisní
elektronová mikroskopie.
Příprava vzorků pro skanovací elektronový mikroskop
Parazitovanou tkáň nakrájet na malé kousky a ponořit do fixáže. Buněčné suspenze
nakapat na kousky nalámaných z poly-L-lysinových sklíček (cca 6 mm2
). Nechat buňky
sednout a adherovat, pak celé sklíčka pomořit do fixáže.
2,5-3 % GTA v 0,2M pufru (čerstvý!!!) .................................. přes noc
vypírací roztok (stejný pufr co byl použit pro fixáž, pH 7.0)..... 3 x15 min
pufr (fosfátový) + 2% roztok OsO4 1:1 ......................... 2 hod
vypírací roztok (stejný pufr co byl použit pro fixáž, pH 7.0)..... 3 x15 min
30% aceton ................................................................... 15 min
50% aceton ................................................................... 15 min
70% aceton ................................................................... 15 min (možnost přerušit přes noc)
80% aceton .................................................................... 15 min
90% aceton .................................................................... 15 min
95% aceton .................................................................... 15 min
100% aceton ................................................................... 15 min
Vzorky vysušit při kritickém bodě použitím CO2 a pokovit.
Obr. 3. Zvlnění záhybů epicytu na povrchu deutomeritu v důsledku pohybu buňky u
Gregarina garnhami. Skenovací elektronová mikroskopie.
Obr. 4. Povrchové epicytární záhyby apikální části protomeritu na místě po zatažení
epimeritu u gamonta Gregarina garnhami. Skenovací elektronová mikroskopie.
Obr. 5. Povrchový epicyt u Gregarina garnhami. Viditelné jsou kapky mukosubstance mezi
záhyby epicytu. Skenovací elektronová mikroskopie.
Obr. 6. Gamont Gregarina polymorpha. Povrchový epicyt je oddělen od buněčné
cytoplasmy. Skenovací elektronová mikroskopie.
Mrazové lámání a hluboké mrazové leptání
Fixace vzorků v 2,5% GTA v 0,2M pufru s přidáním kryoprotektantu (glycerol). Rychlé
zmražení vzorků v tekutém dusíku, lámání vzorku a tvorba repliky pomocí přístroje Balzer,
odstranění biologického materiálu z repliky pomocí bělidla nebo kyseliny a destilované vody.
Repliky namontovat na síťku a prohlížet v TEM.
Obr. 7. Povrchový epicyt u gamonta Gregarina polymorpha. Transmisní elektronová
mikroskopie (metoda mrazového leptání)..
Obr. 8, 9. Povrchový epicyt u gamonta Gregarina polymorpha. Transmisní elektronová
mikroskopie (metoda mrazového leptání). Pórovité struktury pozorovatelné mezi jednotlivými
záhyby epicytu jsou spojeny s exkrečním váčkem, který pravděpodobně vylučuje mukus na
povrch buňky.