Změny cytokinetiky epiteliálních buněk kolonu indukované nutričními faktory in vitro
Interakce endogenních regulátorů a lipidových složek výživy,
molekulární mechanizmy působení
Buněčná a molekulární fyziologie lipidů
Doc. Jiřina Hofmanová

Sciampage81
LIPIDOVÉ SLOŽKY VÝŽIVY
RIZIKOVÉ FAKTORY
Zvýšený přísun kalorií (snížený výdej)
Vysoký obsah tuků
Nízký obsah vlákniny
Negenetické příčiny vzniku
kardiovaskulárních a
nádorových onemocnění

Mnohostupňový proces karcinogeneze
INICIACE
PROMOCE
PROGRESE
MUTAGENY RADIACE VIRUSY….
GENOTOXICITA
NEGENOTOXICKÉ KARCINOGENY
PRENEOPLASTICKÉZMĚNY
INICIOVANÁ BUŇKA
NORMÁLNÍ BUŇKA
MALIGNÍ NÁDOR
METASTÁZY
AKTIVACE PROTO-ONKOGENŮ
INAKTIVACE NÁDOROVĚ SUPRESOR. GENŮ INAKTIVACE ANTIMETASTAT. GENŮ
GENOTOXICKÉ
+NEGENOTOXICKÉ
FAKTORY

zvýšený příjem tuků = rizikový faktor pro karcinom kolonu, prostaty , prsu
důležité nejen množství, zejména složení tuků
Esenciální vysoce nenasycené mastné kyseliny (VNMK)
n-3 (α-linolenová k.)
n-6 (linoleová k.)
  DHA
(22:6)
  AA
(20:4)
dha arachidonic_acid
strukturální a regulační úloha s významným dopadem na
      fyziologické funkce organismu
TUKY NEJSOU POUZE ZDROJ ENERGIE !!!
ALE
důležitý
poměr
teď 1:14
(1:4)
zdroj: rostlinné oleje
(lněný, řepkový, sojový)
  rybí olej, fytoplankton
zdroj: rostlinné oleje (slunečnicový, pupalkový, kukuřičný) živočišné tuky

rostl.oleje
rybí oleje
VYSOCE NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (VNMK)
(Polyunsaturated fatty acids - PUFAs) - mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami. Esenciální
prekurzorové kyseliny řady ω-6 a ω -3

PUFA jsou inkorporovány do fosfolipidů buněčných membrán
a mohou zásadně ovlivňovat jejich vlastnosti


mRNA
RE
proteiny
inhibice
(NSAID)
membránové
fosfolipidy
jaderné receptory
transkripční faktory
(NFkB, PPAR, AP-1...)
signální
kaskáda
m. fluidita
 lipidové rafty
PUFA
vnitrobuněčné
funkce
membránové
fosfolipidy
SIGNÁL
 (např. cytokiny)
sekrece
inserce
n-6 PUFA  LA, AA
n-3 PUFA
LNA. DHA
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony,  polutanty, záření)
eikosanoidy
LOX
COX
P450
kyselina arachidonová
ROS
lipidová peroxidace
genová exprese
DNA
Složky lipidového metabolismu
v buněčných signalizacích
Mediátory a modulátory
Biofyzikální vlastnosti
membrán
Lipidový metabolismus
Aktivace fosfolipáz
Uvolňování a metabolizace AA
eikosanoidy
Oxidativní metabolismus
Transdukce signálů
(kinázy, fosfatázy)
Aktivace membrán.
i vnitrobun.
receptorů – tr. faktorů
Exprese proteinů
Exprese genů - mRNA
Změny cytokinetiky
interakce
ligand-receptor
NOS
PKC, ERK, p38
PI3K/Akt

Rakovina tlustého střeva
§ druhým nejčastějším nádorem u mužů hned po nádoru plic a u žen po
   nádoru prsu
§ ČR – vysoká incidence, přední ve statistikách, alarmující růst
 rozvoj nádorů kolonu - vlivy genetické
                               - vlivy zevního prostředí (genotoxická činidla
                                                                             a negenotoxické
promotory)
nerovnováha
proliferace
diferenciace
apoptóza
porušení homeostázy tkáně
karcinom
(kolorektální)
http://cellbio.utmb.edu/microanatomy/digestive/Intestine.htm

APOPTOSIS (anoikis)
APOPTOSIS
(damaged cells)
      EPITEL TLUSTÉHO STŘEVA (kolonu)
u kontinuálně se obnovující buněčné populace
u
u řada zásadních fyziologických funkcí
u dynamická rovnováha mezi přírůstkem buněk na bázi krypty (proliferace) a  úbytkem
(apoptóza-anoikis) na povrchu
u regulace endogenními faktory (hormones and cytokines),  ale rovněž
složkami diety přítomnými v lumen střeva
Endogenous regulators
kmenové buňky

Přechod adenom x karcinom
fetální colon
FHC
adenomy
  AA/C1
RG/C2
adenocarcinomy
      HT-29
HCT116
lymf.
metastáza
SW-620
Buněčné línie
Účinky butyrátu

CCL-247_mg1 CRL-1831_mg1 HTB-38_mg1
Linie lidských epiteliálních buněk kolonu
FHC
HT-29
HCT-116
normální
fetální střevo
Adenokarcinom kolonu
diferencující
 neinvazívní
nediferencující
invazívní
CaCo-2
SW 620 – lymf. uzlina

ω-6 arachidonic acid or ω -3 docosahexaenoic acid
Interaction of PUFAs and butyrate
sodium butyrate
nabt
PsylliumCrop PsylliumSeed
Short-chain fatty acids
colon carcinoma cells
§ decreased proliferation
§ induction of differentiation
§ induction of apoptosis
! Influence on colon carcinogenesis !
fiber

C
N
FA
FA-CoA
FAT/CD36
AA (50μM)
plant oil
NaBt (3mM)
fiber
DHA
fish oil
Approaches
various levels of cell organisation
Cytoplasmic membrane
Lipid packing
 flow cytometry (merocyanin 540)
Lipid analyses
Phospholipids (LC-MS)
FA composition (GC-MS)
Lipid droplets in cytoplasm
flow cytometry -Nile Red
Mitochondria
ROS – flow cytometry (DHR-123)
 MMP – flow cytometry (TMRE)
Bcl-2 family (Western blotting)
Nucleus
Transcription factors, gene expression
>
Mitochondria
PPRE
PPAR
Nucleus
Proliferation Differentiation   Apoptosis
Plasma
membrane
Cytoplasm
Endogenous regulators
TRAIL, anti-Fas
Death
receptors
DR4, DR5
CD95

FACSCalibur
METODOLOGIE
CYTOKINETIKA
Detekce proliferace- regulace buněčného cyklu a zapojených proteinů,
diferenciace -buněčná morfologie, aktivita specifických enzymů, exprese specifických proteinů
 apoptózy -detekce charakteristických změn na úrovni jádra, mitochondrií, membrán, cytoskeletu,
exprese regulačních proteinů, štěpení specifických enzymů a substrátů
ZMĚNY LIPIDOVÉHO METABOLISMU A VLASTNOSTÍ BUNĚČNÝCH MEMBRÁN
-změny spektra MK v bun. lipidech, „lipid packing“ v membránách,  akumulace triglyceridů, detekce
kardiolipinu, membránový potenciál
ZMĚNY OXIDATIVNÍHO METABOLISMU
- produkce reaktivních metabolitů kyslíku (ROS) a dusíku, lipidová peroxidace, účinky antioxidantů
Využití moderních metod průtokové cytometrie, fluorescenční mikroskopie, fluorimetrie,
spektroskopie, metod molekulární biologie…

foodpyramid