Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Ekotoxikologické biotesty s producenty
(Úvod do bloku přednášek)
B. Maršálek
Terminologická poznámka:
• Ekotoxikologické biotesty využívající producenty
(fotoautotrofní organismy) lze označit také jako
testy fytotoxicity.
• fytotoxiny jsou toxiny produkované rostlinami
(alkaloidy, glykosidy, antibiotika atd.). Tato
terminologie je mezinárodně ustálená, takže
stejně jsou chápány mykotoxiny (toxiny
produkované plísněmi a houbami), cyanotoxiny
(toxiny produkované sinicemi) apod.
Přehled základních typů organismů
používaných pro ekotoxikologické biotesty
s producenty
•  Sinice (fotosyntetizující gramnegativní
eubakterie) koloniální (Microcystis), vláknité
(Anabaena, Nostoc) a pikocyanobakteria
jednobuněčné (Synechocystis). Dusík fixující
sinice jsou velmi citlivé na toxické látky a inhibice
nitrogenázy patří mezi vhodné endpointy.
Přehled základních typů organismů používaných
pro ekotoxikologické biotesty s producenty
• Řasy – jednobuněčné, cenobiální, vláknité,
sladkovodní, mořské
• Řasové testy trofie a toxicity
• Kromě klasických biotestů s jednou řasou, jsou
používány tzv. Multispecies algal asays
(paralelní kultivace zástupců zelených řas, sinic
a rozsivek dle podmínek zkoumané lokality
• fyziologické testy (hodnocení fotosyntetické
aktivity, enzymatické aktivity,
• Kompetice a reprodukce přírodních populací
fytoplanktonu a fytobentosu.
Přehled základních typů organismů používaných
pro ekotoxikologické biotesty s producenty
•  Mechy a lišejníky •
bioindikační postupy s přirozenými společenstvy
lišejníků, nebo s tzv. transplantovanými druhy,
u kterých známe stáří a historii.
• V případě mechů nejsou propracovány
metodiky ekotoxikologického hodnocení tak
podrobně jako v případě lišejníků, ale např.
vodní mech Fontinalis je využíván jako
producent s vysokým potenciálem pro
bioakumulaci kovů.
Přehled základních typů organismů používaných
pro ekotoxikologické biotesty s producenty
•  Okřehek a submerzní vegetace•
OECD 221 Lemna sp. Growth Inhibition
Test (Draft New Guideline, ). V některých
laboratořích je také používána Spirodela
polyrhyza, ale dle našich zkušeností je Lemna
minor citlivější, než Spirodela. Dále je
využívána Elodea canadensis a Myriophyllum
sp. Jejich nevýhodou je sezónnost použití,
která je omezena na květen až říjen, v zimním
období neposkytují použitelné výsledky.
Přehled základních typů organismů používaných
pro ekotoxikologické biotesty s producenty
• Testy s cévnatými rostlinami – jsou
typickými testy pro hodnocení
terestrických ekosystémů (orná půda,
lesní půdy, hodnocení kompostů, tuhých
odpadů, pesticidů apod.).
Testy toxicity s cévnatými rostlinami 1
Testy s bylinami (nejčastěji jednoleté,
do 30 dnů po vyklíčení), nebo dřevinami
(lesní kultury, aktivita mykorhyzy,
genetické změny schopnosti syntetizovat
kutikulu – obrana před imisemi,
genotoxické efekty)
Testy toxicity s cévnatými rostlinami 2
• Testy s plevelnými druhy zde
rozlišujeme tzv target species – tedy ty,
které mají být např. herbicidy omezeny
(oves hluchý, metlice chundelka, svlačec
rolní, pýr plazivý apod.) a tzv. non-target
species, které mají být nepoškozeny ,
versus testy s kulturními plodinami
(kukuřice, pšenice, cukrová řepa, ovocné
sady, vinice apod.
Testy toxicity s cévnatými rostlinami 3
• Testy cílené na jednoděložné ( např.
traviny) a dvouděložné – ( řepa, konopí,
sady, listnaté lesy) – toto kriterium je
důležité např. při vývoji herbicidů.
Testy toxicity s cévnatými rostlinami 4
• Dle zdroje matečného testovacího
organismu dělíme testy s cévnatými
rostlinami na testy využívající semena
(nejčastější způsob), dále využívající
cibule a hlízy (např. ASTM test s Alium
cepa) a metody využívající vegetativně
množený matečný materiál (Lemna,
Elodea).
Testy toxicity s cévnatými rostlinami 5
• Dle způsobu experimentálního
uspořádání dělíme na testy využívající
extrakt na filtračním papíru v petriho
misce (nejméně přirozený, ale často
používaný způsob), dále přímý kontakt
sedimentu, odpadu, nebo zeminy s klíčící
rostlinou v petriho misce či květináči
v prvních 2-6 týdnech po vyklíčení, a
konečně nádobové pokusy postihující
celý životní cyklus rostliny
Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s
producenty 1
• Řasy a sinice hodnotíme většinou
pomocí změny počtu buněk v čase
experimntu ve srovnání s kontrolou.
• Alternace:
– koncentrace pigmentů (např. chlorofylu a),
– fyziologické aktivity (příjmu živin) a
metabolické aktivity (fotosyntetické aktivity,
enzymatické aktivity )
Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s
producenty 2
• Lišejníky hodnotíme dle:
– struktury přirozených společenstev BI
– metabolické aktivity přírodních a
exponovaných (transplantovaných) druhů EB
– dle morfologických – fytopatologických změn
na stélce BI
– dle bioindikačních hodnot (citlivých a
toxitolerantních taxonů) BI.
Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s
producenty 3
• Okřehek a submerzní vegetace–
počet nových lístků,
– hmotnost,
– defekty tvorby chlorofylu, nepřirozené tvary a
celou škálu biochemických paramerů
(esterázy, dehydrogenázy, SOD, glutation,
RUBISCO, až po metody využívající
zobrazování a kinetiku fluorescence chlorofylu
pomocí CCD- FLIA
Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s
producenty 4 – cévnaté rostliny
• měřením délky kořene, hypokotyle, popřípadě
nadzemní části rostliny a plochy listů. – běžné, ale ne
nejcitlivější.
• hmotnost žívá/ sušina nadzemní biomasy, kořene a
její sušinu,
• defekty chlorofylu, nekrózy a další pozorované
abnormality.
• aktivity dehydrogenáz, fosfatáz, oxidáz nebo
peroxidáz, popř. syntézy glutationu.
Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s
producenty -cévnaté rostliny
• V případě nádobových pokusů hodnotíme
– dobu nutnou k dosažení fenologických fází (např. odnožování,
sloupkování, metání, kvetení, zrání semen,
– klíčivost semen ,
– odolnost proti chorobám a škůdcům ve srovnání s kontrolou
apod.
• V případě lesních dřevin hodnotíme
– přírůstky,
– odolnost proti chorobám a škůdcům,
– fotosyntetickou aktivitu,
– ovlivnění syntézy kutikuly,
– přítomnost a aktivitu mykorhyzy atd.
Možnosti využití producenů pro různé typy
ekotoxikologických testů
• Stanovení toxických efektů – letalita, inhibice růstu, nebo
fyziologických procesů.
• Genotoxicita, mutagenita. Možnost použít řasy a cévnaté rostliny pro
detekci chromozomových zlomů, tvorby mikrojadérek, iniciace nádorů na
kořenech, poruchy tvorby kutikuly, mutace na úrovni intaktní rostliny,
tvorba DNA aduktů atd.
• Hodnocení detoxifikační aktivity, přítomnost a aktivita detoxifikačních
systémů ( PCR, ELFO, LC-MS, formy glutationu, SOD apod.
• Hodnocení vlivu toxikantů na rezistenci k patogenním organismům
• Využití fototrofních organismů pro hodnocení biokumulací a
biokoncentrací toxikantů v přírodním prostředí.
• Hodnocení podílu autotrofních organismů na detoxifikaci/ imobilizaci
toxických látek v životním postředí (bioremediace pomocí cévnatých
rostlin, nebo cyanobakterií)
Test inhibice růstu Lemna minor
ČSN EN ISO 20079 (2007) - Stanovení toxických účinků složek vody
a odpadní vody na okřehek (Lemna minor) - Zkouška inhibice růstu
okřehku
Testovací organismus:
Lemna minor, Lemna gibba, tvořeny 2-5 lístky,
Podmínky testu:
24±°C., expozice 7 dní, 100 ml vody v 150ml kádinkách 10
lístků/opakování, (9-12 -- všude stejně)
6-10 000 lux, statický, pH 6,5, v průběhu testu kontrolujeme pH,
teplotu
Vyhodnocení:
Rychlost růstu, hmotnost biomasy, počet lístků,
Validace
Výsledky testu jsou považovány za platné, když:
• Průměrný počet lístků v kontrole vzrostl 8x
• pH se nezměnilo po dobu testu více než o 1,5
Test inhibice růstu kořene Sinapis alba dle MP MŽP
č.4/2007 - Metodický pokyn hodnocení odpadů
OECD 208 Terrestrial (non target) Plant test
Testovací organismus
Sinapis alba, Lactuca sativa, Lepidium sativum, Hordeum vulgare, Zea mays
Kulturní, plevelné
Jednoděložné dvouděložné Klíčivost 90%
Podmínky testu:
20± °C, 5ml/ PM 10-14 cm, 30 semen/ PM, expozice 72 h, 2-3 paralelní testy,
inkubace ve tmě - termostat, filtrační papír.
Vyhodnocení: podle normy
• délka kořene, počet vyklíčených semen o alternativně
• délka, tvar a hmotnost kořene a hypokotylu, defekty tvorby chlorofylu na
světle, množství chlorofylu, aktivity enzymů, aktivita PSII.
Validace Výsledky testu jsou považovány za platné, když:
• klíčivost v kontrole je alespoň 90%
• Zjištěná koncentrace LC 50 je v souladu se standardy
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována
Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem
České republiky