Kvalita vody - stanovení genotoxicity vody a odpadních vod pomocí umuC testu
UMUC TEST
specifitou k různým skupinám genotoxických
• Podstatou umuC testu je indukce SOS odpovědi v důsledku poškození DNA genotoxickou látkou
• Princip testu: testované organismy jsou exponSvány testovanou látkou (vzorkem) s nebo bez metabolické aktivace
• Testovací organismus: Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium TA1535
o Používá se organismus nesoucí plazmid Sk1002 s umuC-lacZ genem a rezistentní vůči ampicilinu
o Bakterie je uchovávána v 150 ul media s 10% DMSO nebo 20% glycerolu
o Teplota -80°C
o 2 ml ampule
Reagenty
° S musňizSny sterilně za použití
o 1 mol/l HCl, 1 mol/l NaOH, C2H6SO4
o tga medium (pH 7,0 ± 0;2, uchováváno při -20°C), 10x koncentrované TGA medium
o B-pufr, fosfátový pufr, S9 mix, ONPG, stop reagent (roztok Na2CO3 ve vodě)
příprava vzorku
o Test by se měl provádět bezprostředně po odběru,
pokud ne, měly by být vzorky uchovávány při 4°C
o Vzorky by měly být analyzovány v tomto případě 48 hodin po odběru
příprava kultury
o Ampulka se zásobní kulturou se nechá roztát a 1 ml se přidá do 20 ml TGA media, centrifuguje se
o (Odlije se supernatant a resuspenduje se v 1 ml
o Nechá se inkubovat přes noc při 37°C, 12 h
o Změří se optická densita A600 (použití TGA media jako blank) a bakterie se naředí na potřebnou
Schéma pipetování
	12 3	4	5	6	7		8 9	10	11	12
A	S1 1:1,5 S1 1:1,5 S1 1:1,5	S1 1:3	S1 1:3	S1 1:3	S1 1:6	S1 1:6	S1 1:6	S1 1:12	S1 1:12	S1 1:12
B	S2 1:1,5 S2 1:1,5 S2 1:1,5	S2 1:3	S2 1:3	S2 1:3	S2 1:6	S2 1:6	S2 1:6	S2 1.12	S2 1.12	S2 1.12
C	S3 1:1,5 S3 1:1,5 S3 1:1,5	S3 1:3	S3 1:3	S3 1:3	S3 1:6	S3 1:6	S3 1:6	S3 1:12	S3 1:12	S3 1:12
D	S4 1:1,5 S4 1:1,5 S4 1:1,5	S4 1:3	S4 1:3	S4 1:3	S4 1:6	S4 1:6	S4 1:6	S4 1:12	S4 1:12	S4 1:12
E	S5 1:1,5 S5 1:1,5 S5 1:1,5	S5 1:3	S5 1:3	S5 1:3	S5 1:6	S5 1:6	S5 1:6	S5 1:12	S5 1:12	S5 1:12
F	S6 1.1,5 S6 1:1,5 S6 1:1,5	S6 1:3	S6 1:3	S6 1:3	S6 1:6	S6 1:6	S6 1:6	S6 1:12	S6 1:12	S6 1:12
G H	NC       NC NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC
	PC        PC PC	SC	SC	SC	BL	BL	BL	BL	BL	BL
o S1, S2, S3, S4, S5, S6 ... vzorky o různém ředění
o NC ... negativní kontrola
o PC ... pozitivní kontrola
o SC ...kontrola použitého rozpouštědla
o BL ...blank
	12 3	4	5	6		7	8 9	10	11	12
A	S1 1:1,5 S1 1:1,5 S1 1:1,5	S1 1:3	S1 1:3	S1 1:3	S1 1:6	S1 1:6	S1 1:6	S1 1:12	S1 1:12	S1 1:12
B	S2 1:1,5 S2 1:1,5 S2 1:1,5	S2 1:3	S2 1:3	S2 1:3	S2 1:6	S2 1:6	S2 1:6	S2 1.12	S2 1.12	S2 1.12
C	S3 1:1,5 S3 1:1,5 S3 1:1,5	S3 1:3	S3 1:3	S3 1:3	S3 1:6	S3 1:6	S3 1:6	S3 1:12	S3 1:12	S3 1:12
D	S4 1:1,5 S4 1:1,5 S4 1:1,5	S4 1:3	S4 1:3	S4 1:3	S4 1:6	S4 1:6	S4 1:6	S4 1:12	S4 1:12	S4 1:12
E	S5 1:1,5 S5 1:1,5 S5 1:1,5	S5 1:3	S5 1:3	S5 1:3	S5 1:6	S5 1:6	S5 1:6	S5 1:12	S5 1:12	S5 1:12
F	S6 1.1,5 S6 1:1,5 S6 1:1,5	S6 1:3	S6 1:3	S6 1:3	S6 1:6	S6 1:6	S6 1:6	S6 1:12	S6 1:12	S6 1:12
G H	NC       NC NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC	NC
	PC        PC PC	SC	SC	SC	BL	BL	BL	BL	BL	BL
O
o
o o o
O o o
120 ul destilované vody všude kromě A-F (1-3) a H (1-6)
360 ul vzorku do prvních tří jamek (poté se rozředí do ostatních jamek)
153 ul vody do PC a SC (H1 až H6)
27 ui 30% DMSO ve vodě do SC (H4-H6)
27 ul 4-NQO (4-Nitroquinoline N-oxide) (finální koncentrace 50 ng/ml) do PC (H1-H3)
20 ul 10x zahuštěného TGA media do všech jamek 70 ul inokula do všech jamek kromě BL 70 ul TGA media do BL
o Přidá se 30 (il ONPG a nechá se inkubovat 30 min za stálého míchání, při 28°C
o 120 (il stop reagentu
o Měří se absorbance v každé jamce při 420 nm
VÝPOČTY MĚŘENÍ
o G...růstový faktor:
G = (A600,t - A«00,b) / (A600,n
A600T absorbance vzorku A600N absorbance NK A600B absorbance BL
A600,b)
o Aktivita 6-galaktosidázy:
Ut = (A420,t - A420,b) / (A600,n - A«00,b)
o Indukční poměr:
Ir = 1/G X (A420,t - A420,b) / (A420,n - A420,b)
VALIDACE
° PT:^aSír2K dosáhne indukčního
o Minimální nárůst NK je G = 1 až 12
° Výsledky nemohou být hodnoceny, pokud G < 0,5
o Voda je genotoxická, pokud je indukční poměr vyšší než 1,5