Materiály a činidla
® Planktonní sladkovodní řasy
• Scenedesmus subspicatus Chodat (86.81 SAG)
• Selenastrum capricornutum Printz (ATCC 22662 nebo CCAP 278/4)
® Voda
mu
ž Zásobní roztoky živin
• makrosložky živin
• Fe - EDTA
• stopové prvky
• NaHCO3
2
Přístroje a pomůcky
® Klimatizovaný box se stálým osvětlením bílou zářivkou ® Přístroje pro měření množství buněk řas (spektrofotometr)
• Přístroj musí být schopen přesně změřit nejnižší hustotu buněk 1000 v 1 H ml
® Kultivační nádoby
® Filtrační aparát pro membránové filtry ® Autokláv ® pH-metr
3
Postup zkoušky
® Příprava zásobního roztoku živin ® Příprava inokula
• Řasové buňky odebrané ze zásobní exponenciálně rostoucí řasové kultury + zásobní roztok živin + voda
• Hustota buněk 10000 v 1 ml
• 3 denní předkultivace za podmínek průběhu zkoušky
® Volba koncentrací zkoušené látky
• Koncentrace zkoušené látky se volí v geometrické řadě [mg/l]
• Několik (4-5) koncentračních úrovní, v rozmezí od 10% do 90% inhibice růstu kultury
4
Postup zkoušky
® Přípra\/a zásobních roztoků zkoušené lát ky
Roztok z koušené láíky se naředí ve vodě tak, aby vznikla série zásobních roztoků, pokrývající celý rozsah zkoušky
• Obvykle bez úpravy pH
® Příprava zkušebních roztoků
• Zásobní roztok zkoušené látky + voda + koncentrovaný roztok živin + inokulum
• Objem inokula tak, aby počáteční hustota buněk ve zkoušených roztocích byla kolem 10000 v 1 ml.
5
Postup zkoušky
® Inkubace
Za stálého osvitu bílým světlem o intenzitě od 60 |wE/(m2.s) do 120 |wE/(m2.s) při měření v rozsahu PAR (400-700nm)
4 W - 7,3 W zářivky univerzálního bílého světla ve vzdálenosti 0,35 m od média s řasovou kulturou
Řasové buňky se udržují v suspenzi třepáním, mícháním nebo provzdušňováním tak, aby byla zajištěna výměna plynů a aby se zamezilo změnám pH ve zkoušených vzorcích
® Měření
• Každých 24h v objemech 5 ml
• Zkouška trvá 72h
• Na konci zkoušky se měří pH vzorků
6
•
Kritéria platnosti
® Zkouška se považuje za neplatnou, pokud není dosaženo podmínek:
• Hustota buněk u kontrolního vzorku se musí zvýšit více než 16x za 72h.
• pH v kontrolním vzorku se nemá změnit během zkoušky o více než 1,5 jednotky
7
Vyjadřování výsledků
Vyměření růstových křivek
hodnoty změřených hustot buněk se zaznamenávají spolu s koncentracemi zkoušené látky a dobou měření
Pro každou koncentraci a kontrolní vzorek se sestrojí růstová křivka v podobě grafu logaritmu střední hustoty buněk v závislosti na čase.
® Výpočet inhibice v procentech
• Plocha pod růstovou křivkou (integrál biomasy)
• Růstová rychlost
®
Vyjadřování výsledků - výpočet inhibice
I ® Plocha A pod růstovou křivkou (integrál biomasy)
Vyjadřování výsledků - výpočet inhibice
Vyjadřování výsledků
® Určení EC50
• Z hodnot inhibice při dané koncentrace proti odpovídajícím koncentracím se sestaví graf
• Zkoušená koncentrace - odpovídající 50% inhibici - se vynese na logaritmické stupnici
® Určení NOEC
11
Výklad výsledků
® Hodnoty EC5a NOEC jsou toxikologická data, odvozená z laboratorního pokusu, provedeného za definovaných podmínek. Prokazují potenciální riziko, avšak nemohou být přímo použity pro předpověď účinků v přirozeném prostředí
® Při jejich výkladu se přihlíží k tvaru růstových křivek.