Zkouška inhibice růstu
Pseudomonas putida
. Zkouška jakosti vody
. podle evropské normy EN ISO 10712:1995
Předmět zkoušky
•
•
vliv povrchové, podzemní a odpadní vody na Pseudomonas putida
metoda vhodná pro látky rozpuštěné ve vodě není vhodná pro silně zbarvené roztoky, s nerozpuštěnými nebo těkavými látkami a také látky, které reagují s živným roztokem výsledkem testu je IC10 a IC50
Zkušební organismus
•
Gramnegativní aerobní bakterie z čeledi Pseudomonadaceae Mobilní tyčinky s polárními
bičíky
Vyskytuje se běžně v půdě a povrchových vodách Opt. T růstu 25-30 stupňůC V ČR lze získat vhodnou kulturu v České sbírce
mikroorganismů (MU)
Zásobní kultura se uchovává na šikmém agaru
•
Chemikálie a vybavení
Hcl/NaOH na případnou regulaci pH
Živné roztoky: roztok1 (NaNO3, K2HPO4, KH2PO4, kvasniční extrakt),
roztok2 (NaNO3, K2HPO4, KH2PO4), roztok3 (roztok glukózy), roztok4
(síran horečnatý a citronan sodný), roztoky se sterilizují
Živné médium (zásobní kultura): ve vodě se rozpustí 18g agaru a přidá se 50ml roztoku1, 125ml roztoku3, 100ml roztoku4 a doplní se do 1000ml vodou Média se rozdělí do zkumavek, vysterilizují a nechají ztuhnout v šikmé poloze
spektrofotometr/turbidimetr
Mikroskop s min.zvětšením 100x PH metr, autokláv, kultivační láhve Místnost s regulovatelnou stálou teplotou
Zpracování vzork ů
•
•
Zpracování v testu co nejdříve po odebrání Je-li to nutné, lze vzorky konzervovat:
Chlazením (na 2-4 stupně, do dvou dnů) Mražením (na -18 stupňů, do dvou týdnů)
Před přípravou zkušebního média se vzorek
protřepe a případně homogenizuje
Pokud má vzorek extrémní pH, upraví se v dodatečné zkoušce na 7,4
Postup zkoušky
•
•
Předkultivační médium: do 900ml vody se přidá 25ml
roztoků 1-3 a 50ml roztoku 4
Inokulum: buňky se spláchnou ze šikmého agaru a
ředěním se upraví hustota buněk na 10 ZF
(formazinová jednotka zákalu)
Inokulum se inkubuje v kultivačních lahvích po 5 hodin
za teploty testu
Buňky musí být v exponenciální fázi růstu a nesmí být přítomno řetězzení
Po skončení inkubace se bakteriální suspenze zředí do
požadované hustoty
Postup zkoušky II
•
•
Zkušební kultura: 10ml inokula, 5ml roztoku3 a 2,5 ml roztoků 1a2, 80 ml zkušebního roztoku/ředící vody na 100ml
Kontrola s 80ml ředící vody
Max. koncentrace zkoušeného roztoku v dávce je 80%
Každá z koncentrací ve třech opakováních Inkubace v temnu při 23 +-1°C
Bakterie se udržují v suspenzi
Po 16ti hodinách +- 1hodina se měří po homogenizaci protřepáním zákal na spektrofotometru při 436nm
•
Platnost zkoušky a výpočet
V kontrole se buňky pomnoží faktorem nejméně 60 EC50 referenční látky 3,5-dichlorfenolu je 10-30mg/l
Procentuální inhibice růstu: I=(Bc-Bn)/(Bc-Bo)*100
I - inhibice růstu buněk v procentech
Bn - zákal biomasy v měření na konci testu
Bc - zákal biomasy v kontrole na konci testu
Bo - počáteční zákal biomasy v čase 0
IC 10 a 50 se vypočte z grafu inhibice růstu proti
odpovídajícímu ředění vzorku
Děkuji za pozornost :-)