Úvod
□ Vychází z postupů zkoušek doporučených ISO a OECD
□ kontaktní test
□ Vhodné pro testování vlivu chem. látek přidaných k umělým půdám i přírodní půdy neznámé kvality
□ Vhodné pro rozpustné látky (ve vodě či org. rozpouštědlech) i nerozpustné látky
□ Nevhodné pro těkavé (H>1) a nestabilní látky
Biologický materiál
□ Doporučený druh je Enchytraeus albidus - Roupice bělavá (15 - 40mm) z řádu Oligochaeta, kmene Annelida
□ Je možno využít i jiné roupice (kratší doba testu, méně potravy, horší manipulace)
□ Používají se dospělci s viditelným opaskem
□ Synchronizace není nutná
□ Nutná je aklimatizace v artificiální půdě
□ Potrava: autoklávované drcené ovesné vločky
Podstata zkoušky
□ Dospělí jedinci jsou vystaveni rozsahu koncentrací zkoušené látky, kterou přijímají pokožkou a zažívacím traktem — ovlivnění reprodukce, smrt
□ Zkouška se dá rozdělit na:
□ 1) Krátkodobá - orientační
□ U látky s neznámou toxicitou
□ Pro správný návrh určovací zkoušky
□ 2) Určovací zkouška
□ Vlastní zkouška, 6 týdnů (u Enchytraeus albidus)
□ pro zjištění mortality, reprodukce, NOEC a Ecx
1) Krátkodobá orientační zkouška
□ 14 dní
□ pro zjištění koncentrací způsobující 100% a 0% mortalitu
□ V artificiální půdě přesného složení
□ Nádoby po 20g sušiny
□ Připraví se koncentrační řada:
□ 0,1; 1; 10; 100; 1000 mg/kg sušiny
□ Pro každou koncentraci se doporučuje jedna zkušební a jedna kontrolní nádoba
□ Do každé nádoby přijde 10 dospělých jedinců
1) Krátkodobá orientační zkouška
□ Po 2 týdnech se stanoví mortalita, zhruba určí LC50
□ Předpoklad: NOEC a EC10 je asi 10x nižší
□ Pokud není pozorován vliv ani při 1000mg/kg, navrhneme určovací zkoušku jako srovnání 8 kontrol a 8 zkušebních nádob s koncentrací 1000mg/kg
2) Určovací zkouška
□ Doporučuje se jedno z následujících provedení:
□ Stanovujeme NOEC:
■ Min 5 koncentrací v geometrické řadě
■ 4 opakování pro každou koncentraci
■ 8 opakování pro kontrolu
□ Stanovujeme ECx:
■ 12 koncentrací v řadě
■ 2 opakování pro každou koncentraci
■ 6 opakování pro kontrolu
□ Stanovujeme NOEC i ECx:
■ 6-8 koncentrací v řadě
■ 4 opakování pro každou koncentraci
■ 8opakování pro kontrolu
2) Určovací zkouška
□ 6 týdnů
□ Nádoby po 10 dospělcích
□ Roupice jsou krmeny každý týden (poprvé 50mg, pak 25mg ovesných vloček)
□ Po 21 dnech se pomocí háčku nebo kličky odeberou a spočítají dospělé roupice, zjistí se mortalita
□ Po dalších 21 dnech se již např. pomocí barvení
spočítají jedinci z druhé generace a určí se ovlivnění reprodukce
Zkušební substrát
□ 10% rašeliny, 20% kaolinitového jílu, 69% křemenného písku, do 1% CaCo3 pro pH ±6
□ Půda se důkladně promísí a 2 dny nechá odstát pro
vyrovnání kyselosti
□ Stanoví se max WHC a pH
□ Půda se ovlhčí na 40-60% WHC souběžně s aplikací testované látky
□ Při správném ovlhčení by se stlačením půdy mezi
prsty měly objevit malé kapičky vody
Barvení bengálskou červení
□ Pro snadné počítání nedospělých jedinců
□ Do každé nádoby se přidá:
□ 5ml ethanolu
□ Voda do výšky 1 -2cm
□ Pár kapek bengálské červeně
□ Po 12 hodinách jsou roupice zcela obarveny
□ Dále je možné využít extrakci vodou (prosít roupice
přes síto)
□ Flotace: vynesení roupic na hladinu pomocí ludoxu
Na co dát pozor?
□ Plíseň:
□ Krmení je potřeba přizpůsobit příjmu
□ Přes vločky je dobré přehrnout vrstvičku půdy
□ pH:
□ Změna pH v průběhu testu může významně ovlivnit
výsledky
□ Vlhkost:
□ Je třeba zabránit odpařování vody nebo ji doblňovat
pomocí hmotnostních úbytků
□ Jemná manipulace s roupicemi
Validita testu
□ Musí být známy ekologické požadavky použitého druhu (musí být v souladu s testovanou látkou)
□ Kontrolní půda musí být pedologicky srovnatelná se vzorkem (neznečištěná přírodní, dobře charakterizovaná přírodní, umělá standardní)
□ U E. albidus mortalita v kontrole max 10% a 25 juvenilů po 3 týdnech
□ U E. crypticus mortalita v kontrole max 10% a 50
juvenilů po 3 týdnech