Včela medonosná- zkouška akutní kontaktní toxicity Metoda: k posouzení akutní kontaktní toxicity přípravků na ochranu rostlin (pesticidy) a jiných chemických látek pro dělnice včely medonosné (dospělce) pesticidy jsou zkoušeny ve formě účinné látky nebo ve formě finálně upravených přípravků - k ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se používá standard toxicity Definice: Akutní kontaktní toxicita: nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od topikální aplikace jedné dávky zkoušené látky Dávka: množství aplikované zkoušené látky, vyjadřuje se v hmotnosti (ug) zkoušené látky na jednoho testovacího živočicha LD (střední letální dávka) kontaktně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po kontaktní aplikaci způsobit úhyn 50 % jedinců Mortalita: jedinec se považuje za uhynulého, je-li zcela nepohyblivý Podstata zkušební metody: - dělnice se exponují řadě dávek zkoušené látky rozpuštěné ve vhodném nosiči přímou aplikací na torax (jako kapičky) doba expozice: 24/48/96 hodin mortalita se zaznamenává denně a porovnává se s kontrolními hodnotami výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD50 pro daný počet hodin Validita zkoušky: Má-li být zkouška platná, musí být splněny tyto podmínky: - průměrná mortalita ve všech kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 % LD50 pro standard toxicity odpovídá specifikovanému rozsahu Popis zkušební metody 1. Sběr včel: mladušky téhož plemena z dobře potravou zásobených, zdravých, chorob prostých včelstev, s kladoucí matkou, se známým původem, chovem a fyziologickým stavem sesbírány ráno v den zkoušky nebo večer před zkouškou neměly by být sbírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim (změněná fyziologie) když na jaře nebo na podzim-> mohou se vylíhnout v inkubátoru a chovat s „včelím chlebem" (na plástovém pylu) a s cukerným roztokem včely ošetřené chemickými látkami (antibiotika, atd.) by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření Popis zkušební metody 2. Podmínky chovu a krmení: snadno čistitelné a dobře větrané klícky (z korozivzdorné oceli, drátěného pletiva, plastu nebo dřevěné na jednorázové použití) velikost klícek vyhovovat počtu včel-> dostatek prostoru, skupiny po 10 včelách - přechovávány ve tmě v experimentální místnosti při teplotě 25 ±2 ° C zaznamenává se relativní vlhkost, která je obvykle 50 - 70 % zacházení se včelami, včetně exponování a pozorování, může být prováděno za (denního) světla jako potrava se používá vodný cukerný roztok, podává se za použití krmítka včel či skleněné trubičky Popis zkušební metody 3. Příprava včel: sesbírané včely mohou být za účelem aplikace zkoušené látky narkotizovány oxidem uhličitým nebo dusíkem množství anestetika v době expozice by mělo být minimalizováno hynoucí včely se před zahájením zkoušky odstraní a nahradí zdravými včelami Popis zkušební metody 4. Příprava dávek: - zkoušená látka se aplikuje jako roztok v nosiči, tj. v organickém rozpouštědle nebo jako vodný roztok se smáčedlem organické rozpouštědla: upřednostňován aceton, jinak rozpouštědla s nízkou toxicitou pro včely (např. dimethylformamid, dimethylsulfoxid) u finálně upravených přípravků dispergovaných ve vodě a u silně polárních organických látek nerozpustných v organických nosičových rozpouštědlech lze aplikaci usnadnit jejich rozpuštěním ve slabém roztoku komerčního smáčedla (např. smáčedla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween) připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí-li se k rozpuštění zkoušené látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: jedna ošetřená vodou a jedna rozpouštědlem/dispergátorem Postup 1. Zkušební a kontrolní skupiny: pro zkoušku se požaduje alespoň pět dávek tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD50 počet dávek se musí stanovit s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků vhodné dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem souběžným zkušebním skupinám o 10 včelách, tj. ve třech opakováních vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách -je-li použito organické rozpouštědlo nebo smáčedlo, musí se zařadit další tři kontrolní skupiny po 10 včelách pro rozpouštědlo a smáčedlo Postup 2. Standard toxicity: vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD 50 pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po 10 včelách upřednostňovaným standardem toxicity je dimethoát - i jiné standardy toxicity, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion) Postup 3. Expozice: a)podávání dávek u narkotizovaných včel se jednotlivě provede topikální aplikace včely se náhodně rozdělí do různých zkušebních a kontrolních skupin 1 pl roztoku obsahujícího zkoušenou látku se ve vhodné koncentraci aplikuje mikroaplikátorem na dorsální stranu thoraxu každé včely po aplikaci se včely umístí do zkušebních klícek a zásobí se cukerným roztokem b) délka trvání zkoušky 24/48/96 hodin D n 4. Pozorování: - mortalita se zaznamená po 4 h od aplikace a poté po 24 h a 48 h -je-li nezbytné dobu pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech maximálně do 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 % - zaznamenává se veškeré neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky Postup 5. Limitní zkouška: - v některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) limitní zkouška za použití 100 |jg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že hodnota LD je vyšší než tato hodnota postupuje se stejným způsobem, včetně nasazení tří souběžných zkušebních skupin pro každou zkušební dávku, tj. tří opakování, odpovídajících kontrolních skupin a použití standardu toxicity dojde-li k úhynům, měla by se provést úplná studie -jsou-li pozorovány subletální účinky , zaznamenají se