Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Testy trofie a toxicity na řasách BM pro MU Základní přehled řasových testů: • Testy se sladkovodními i mořskými řasami • Testy statické, semistatické a průtočné • Vsádkové („bach cultures“) a kontinuální kultivace • Testy jednodruhové, dvou/třídruhové a vícedruhové • Baterie testů se zástupci skupin (rozsivky, zelené řasy jednobuněčné, cenobiální a vláknité, sinice) Uchovávání matečných kultur • Klasicky: – zkumavky-šikmé agary, – E-baňky- agar, tekutá media, „bi-fáz“ • Alternativy – Imobilizace živin – Speciální media – Lyofilizace – Kryo- cesta – Imobilizace buněk do agaru a alginátu, molitanu, PUpěny, experlitu Deimobilizace řas a sinic z • Z agaru - mechanicky • Z alginátu – princip – Ca-Na kompetice – Uhličitan draselný – Hydrogen uhličitan sodný – EDTA – Hexametafosforečnan sodný – Citronan sodný – Vinan draselno sodný – Jantaran sodný Sbírky a kultivace řas Uchováváni matečných kultur Klasické kultury Kontinuální kultivace Sbírka BU AV ČR Řasy a sinice jako testovací organismy Taxony používané pro EB s řasami: (dle novelizace ISO 8692/2003 a OECD 201 – nový návrh) • Desmodesmus subspicatus 5 x 10 4 • Pseudokirchneriella subcapitata 5 x 10 3 • Anabaena flos-aquae 10 4 • Synechococcus leopoliensis 10 4 • Navicula pelliculosa 10 4 Zdroj – sbírky, vlastní kultury Koncentrace inokula dle organismu a detekce Další použitelné organismy • Chlorella kessleri FOTT et NOVÁK., kmen LARG/1; • c) Desmodesmus subspicatus CHOD., kmen LAPAILEUR/Camb. 276-20; • d) Desmodesmus quadricauda (TURP.)BRÉB., kmen GREIFSWALD/15; • e) Chlamydomonas reinhardtii. DANG., kmen UTEX 2246 137c mt+. • Srovnání organismů viz [5]Dvořáková a kol. 1999, [6]Rojíčková a Maršálek, 1999. Předkultivace!!!!! • Řasové inokulum pro zkoušku se odebírá z exponenciálně rostoucí inokulační kultury. Inokulační kultura se nasadí k předkultivaci 3 dny před začátkem zkoušky takto: • Do Erlenmeyerovy baňky na 150 ml se odměří živný roztok a přidá se inokulum tak, aby hustota buněk ve finální kultuře dosahovala předepsaných 10 000 v 1 ml. • Inokulační kultura se 3 dny provzdušňuje a udržuje při světelné intenzitě 30 W/m2 (6000 lx) a teplotě (26+2) C. . • Koncentrace inokula na počátku testu by měla být co nejnižší, aby se do testu zaneslo co nejméně živin a co nejvíce buněk se rozmnožilo pod vlivem zkoušené látky, ale v praxi se řídí také detekčním limitem přístrojů používaných pro vyhodnocování testu. Experimentální uspořádání řasových testů toxicity 1- nádoby • Standardní: – E-baňky 250ml 100ml media, kontinuální třepání/bublání, ISO/OECD medium, 22+2 °C • Alternativy: – Zkumavky – třepané, bublané, stacionární – Kyvety 5-10 cm – Mikrodestičky – pevné/tekuté půdy, semikontinuální – Biosenzor s IMA Experimentální uspořádání řasových testů toxicity 2 – kultivační podmínky • Světlo –60-120mE/m2/s (6-9.000 lx) • Důležité – PhAR, periodicita • Teplota 22-26°C (teplotní optimum 27°C) • Udržování pH – nepřesáhne 8.5 …. • Složení media – N/P poměr – Koncentrace mikroprvků – Koncentrace chelatačních látek – Speciální media pro studie limitace živinami Vyhodnocení řasových testů 1 • Přímé metody – Počítání buněk • pod mikroskopem, • počítač částic • Průtokový cytometr – „cell packing volume“ – Hodnota spalného tepla v mikrokalorimetru – C/H/N analýza – (pozor na EP) Vyhodnocení řasových testů 2 • Nepřímé metody – OD 663, 680, 750 nm – Fluorescence ex 465 em 680nm – Změna pH – Inhibice fotosyntézy • O2, CO2, RUBISCO, CCD-FLIA – Efekty na membránách – Inhibice příjmu makronutrientů Výpočet EC 50 A) dle integrálu biomasy ).( 2 2 .....).( 2 2 . 2 1 01 12 021 1 01          nn nn tt NNN tt NNN t NN A t1, t2, tn-1, tn = časy měření N0, N1, N2, Nn-1, Nn = počty buněk v jednotlivých časech c ic ai A AA I  Inhibice Iai pro každou sledovanou koncentraci: Ac = integrál biomasy kontrolního vzorku Ai = integrál biomasy sledované koncentrace Výpočet EC 50 B) – Dle růstových rychlostí n n t NN 0lnln  mRůstová rychlost se počítá podle vzorce: Nn = počet buněk v 1 ml v závěru testu N0 = počet buněk v 1 ml na počátku testu t = délka testu Inhibice Ii pro každou sledovanou koncentraci: c ci iI m mm   mi = růstová rychlost sledované koncentrace mc = růstová rychlost kontrolního vzorku Kriteria validity testu • Růstová rychlost kontroly je 1,91/d pro Pseudokirchneriella a 1,74/d pro Desmodesmus (c.v. =24%) • pH se nezmění o více než 1,5 • Koncentrace testované látky neklesne pod 80% Stanovení trofického potenciálu • Trofický potenciál se určí odečtením sušiny biomasy v kontrolním vzorku od sušiny biomasy ve vzorku vody. • Podle tabulky 1 se určí stupeň trofie. Tabulka 1 - Klasifikační tabulka pro hodnocení trofie Hodnoty sušiny v mg/l.- přepočty dle konverzní křivky z OD 750 Stupeň trofie Autor stupnic e Kataro bní Ultraol igo Olig o Oligom ezo Mez o Mezoeu tro Eut ro Poly Hypert rofní Sládeče k 1979 5 25 50 100 50 0 3 000 Žáková 1986 5 50 100 20 0 350 50 0 1000 1 000 Zkouška na limitující živiny • Stanovení trofického potenciálu je možno doplnit o zkoušku na limitující živiny. • Vzorek vody se selektivně obohatí o P, N, P+N, popř. o další prvky, – vzorek (bez obohacení) – (konečná koncentrace fosforu 0,05 mg/l) – (konečná koncentrace dusíku 1 mg/l) – (konečná koncentrace fosforu 0,05 mg/l a dusíku 1 mg/l) • vzorek + další prvky /koncentrace • Roztoky se sterilizují v množství 2 ml v otevřených Petriho miskách 2 hodiny ve sterilizačním zařízení (viz příloha B). Sterilní roztoky se přelijí do sterilních lékovek. Protokol o zkoušce • V protokolu o zkoušce se uvede: – a) odkaz na použitou metodu; – b) identifikace vzorku nebo zkoušené látky; – c) zkušební organismus: druh, původ, kmenové referenční číslo, způsob kultivace; • podrobné údaje o zkoušce: – 1) datum zahájení a doba trvání; – 2) koncentrace zkoušené látky a ředění vzorku; – 3) složení živného roztoku; – 4) kultivační zařízení a inkubační postup; – 5) intenzita osvětlení; – 6) teplota; – 7) metoda měření hustoty buněk, použitá konverzní rovnice; Protokol o zkoušce 2 - Výsledky 1) absorbance v jamkách sérologické destičky/ebo počty buněk v každé fázi měření; 2) sušina biomasy v jamkách sérologické destičky ve stacionární fázi růstové křivky; 3) hodnoty EC50; způsob výpočtu 4) hodnoty trofického potenciálu; 5) další skutečnosti významné z hlediska užitého postupu. Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky