Moderní přístupy studia biochemických a buněčných mechanismů toxicity v ekotoxikologických biotestech Klára Hilscherová Biosféra Ekosystém I Jedinec I Soustava orgánů Orgán Tkáň Buňka Organela Biomolekula NIZKA VYSOKÁ Ekologická relevance Trvání odpovědi Dlouhodobější následky Flexibilita Schopnost určit příčinu Specifita Citlivost VYSOKÁ NIZKA BIOMARKERY • Časné varovné signály potenciálního poškození organismu i celé populace, časný marker toxicity (/ bez morfologických změn) • Cizorodými látkami způsobené změny buněčných nebo biochemických složek, struktur, nebo funkcí, které jsou měřitelné v biologickém vzorku • Citlivé, rychlé odpovědi, mohou ukazovat mechanismus účinku, předcházejí viditelným symptomům toxicity • Nejlépe prostudovány u vyšších živočichů (savců, ryb) • Možno sledovat i u druhů ze standardních akvatických biotestů (řasy, makrofyta, bezobratlí) RUSE Biochemické markery - screeningové metody s vysokou predikční schopností, alternativa vůči stávajícím metodám. - používány v základním toxikologickém, ekotoxikologickém a farmakologickém výzkumu. -některé obecně akceptovány. - řada parametrů testována jako potenciální biochemické markery. - potenciál využití jako alternativní metody pro toxikologické hodnocení nových xenobiotik. Výhoda biologických a biochemických indikátorů kontaminace: schopnost vypovídat o vlivu znečištění v celém jeho komplexu, se všemi synergistickými a antagonistickými vlivy mezi jednotlivými znečišťujícími komponenty. Biochemické markery Princip: toxické látky v subletálních koncentracích způsobují změny hodnot hematologických, biochemických, ukazatelů nespecifické imunity, vyvolávají histopatologické změny v tkáních. Po vstupu cizorodých látek do organismu či buňky dochází: • k jejich vazbě na buněčné receptory kontrolující klíčové buněčné pochody, • ke vzniku reaktivních intermediátů, • k inhibici určitých enzymových aktivit a dalším procesům, které předcházejí toxickým a dalším negativním efektům na úrovni buňky, orgánů, organismů a populací. Biochemické markery toxicity = vybrané parametry, jejichž měřitelné změny jsou prvními, časnými odpověďmi na expozici cizorodými látkami („early warning of biological impact"). - indikují mechanismus toxicity, nikoliv určitou cizorodou látku. -některé biochemické parametry specificky odrážejí expozici některou třídou nebo skupinou kontaminantů. - biologickými modely jsou nejčastěji jaterní tkáň, primární hepatocyty nebo permanentní linie odvozené od hepatocytů, případně odebraná krev či jiné tělní tekutiny • Vhodně zvolené biomarkery jsou významnými indikátory zdravotního stavu organismů v monitorovaném ekosystému. •Předností je schopnost detekovat toxické účinky látek před manifestací jejich účinku, tzn. před narušením fyziologických funkcí jako např. růstu, vývoje, reprodukce. RUSE Biomarkery = biochemické, fyziologické či histologické indikátory expozice nebo vlivů xenobiotik na suborganismální nebo organismální úrovni Výhoda: odpovídají na expozici = reagují pouze na polutanty dostupné pro organismus. Vhodné biomarkery by měly splňovat následující vlastnosti: (i) senzitivní ve srovnání s ostatními biomarkery; (ii) specifičnost ke konkrétním druhů chemických xenobiotik; (iii) permanentní odpověď ; (iv) jasnost v interpretaci a propojení na vlivy vyšší úrovně; (v) spolehlivost, reprodukovatelnost; (vi) preciznost, jednoduchost a nízké náklady; (vii) aplikovatelnost v terénních podmínkách a validace v terénu BIOMARKERY Specifičtější parametry Nespecifické parametry Stresové proteiny Imulogické markery Fyziologické markery Růst Reprodukce Histologické markery Xenobiotika -► • environmentálni polutanty • léky • agrochemikálie Bioaktivace • PHS • LPO • P450 Eliminace UDPGTs Detoxifikace • GSH • GST • epoxid hydroláza Reaktivni intermediáty elektrofily volné radikály 4- Reaktivni kyslikové radikály Buněčná ochrana • GSH • GR • GPx • SOD • GST • Cat • G6PD Cílové molekuly • DNA • proteiny • lipidy Poškození • adukty • oxidace Teratogenita Malformace Mortalita ■ ■ BIOMARKERY EXPOZICE • identifikují látku v systému a interaktivní produkt mezi xenobiotikem a endogenní složkou nebo jiné skutečnosti v biologickém systému způsobené expozicí. • charakterizují množství toxikantu, které proniklo do organismu • neposkytují příliš informací o následcích expozice, různě specifické BIOMARKERY ÚČINKU-VLIVU • biochemické změny, které se projevily jako výsledek negativní interakce toxikantu a biologického systému a mohou vyústit až v patologické poškození organismu Biomarkery expozice I. Stresové proteiny (proteiny teplotního šoku) - nespecifické, indukovatelné u rostlin i živočichů II. Inhibice esterázové aktivity (acetylcholinesterázy) - enzym nervového systému živočichů, specifická odpověď - po expozici organofosfátových pesticidů a karbamátů - primární toxický vliv těchto látek, stupeň inhibice enzymů je v úzkém vztahu k expozici tkání Acetylcholinesteráza (AchE): zejména v mozku, červených krvinkách a plasmě některých obratlovců, zodpovědná za hydrolýzu acetylcholinu, hlavního přenašeče neuronů. Její inhibice silně ovlivňuje přenos nervových signálů. III. Metalothioneiny - cytoplasmické kovy-vážící proteiny, vyskytují se u řady eukaryot, indukce po expozici kovy, biomarkery vlivu toxických kovů. - skupina proteinů s nízkou molekulovou hmotností (6 000-20 000), vysokým obsahem aminokyselin obsahujících sulfhydrylové skupiny (zejména cystein) a schopností vázat těžké kovy. K jejich zvýšené syntéze dochází při zvýšené koncentraci iontů kovů, jak esenciálních, tak toxických RUSE BIOMARKERY EXPOZICE IV. Indukce detoxikačních enzymů u rostlin i živočichů A. Enzymy I. fáze biotransformace - enzymy MFO (monooxygenázy smíšené funkce) - indukce enzymů cytochromu P450 (EROD, MROD, PROD) cytochrom P4501A - biomarker expozice důležitých skupin organických látek - hladina cytochromu indukována 2,3,7,8-tetrachlodibenzo-p-dioxinem a příbuznými látkami, PCB, PAU - cytochromy P450 (CYP) jsou hemoproteiny schopné vázat molekulární kyslík a vsunovat jeho jeden atom do molekuly substrátu, kterým mohou být i cizorodé látky, které jsou jedním nebo více cytochromy přeměněny tak, aby mohly být z organismu např. exkretovány. B. Enzymy II. fáze biotransformace - glutathion transferázy (GST), uridinedifosfoglukuronosyl transferázy, sulfotransferázy Biomarkery účinku RĚJJ5E I. Parametry oxidativního stresu - produkce kyslíkových radikálů, aktivita antioxidačních enzymů, koncentrace neenzymatických antioxidantů, oxidativní poškození makromolekul II. Parametry energetické bilance organismu - obsah lipidů, proteinů, uhlovodíků a aktivita elektronového transportu III. Indikátory narušení metabolismu - metabolické enzymy pyruvát kináza, laktát dehydrogenáza, isocitrát dehydrogenáza IV. Biomarkery zatížení endokrinního systému - vitelogenin, hormony T3 a T4, enzymy metabolizmu steroidních hormonů. V. Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA - zlomy v DNA, mikrojadérka) VI. Histologicko-patologické změny některých orgánů BIOMARKERY ÚČINKU Parametry oxidativního stresu > produkce kyslíkových radikálů - superoxid, peroxid vodíku, hydroxylový radikál > aktivita antioxidačních enzymů - glutathion peroxidáza, glutathion reduktáza, superoxidáza, kataláza > koncentrace neenzymatických antioxidantů > oxidativní poškození makromolekul - lipidní peroxidace, oxidativní adukty DNA, produkty oxidace proteinů Jedná se biomarkery organochlorových pesticidů, PCB, pesticidů typu paraquat apod. Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA - zlomy v DNA, mikrojadérka) - využívány při hodnocení zatížení ekosystémů látkami s genotoxickým účinkem, které indukují vznik chromosomálních aberací a mutací. alternativa detekce - metody PCR, RT-PCR a DNA-fingerprintingu, test mikrojader Test mikrojader (MNT) - jednoduchá orientační metoda ke stanovení genotoxicity. Pozitivní po působení PCB, benzpyrenu, benzidinu, apod. Biomarkery účinku na endokrinní systém Stanovení produkce vitelogeninu • Vitelogenin je bílkovina produkovaná jaterními buňkami ryb, obojživelníků, plazů a ptáků. • Produkce je indukována vazbou estrogenů na jaterní receptory. • U samic je vitelogenin transportován do vaječníků, kde tvoří součást žloutkových proteinů. •U samců je hladina endogenních estrogenů přirozeně velmi nízká, a proto je i produkce vitelogeninu minimální •Po působení ED's s xenoestrogenním účinkem (ze známých látek je to např. chlordan, toxafen, dieldrin, 4-nonylfenol) dochází u obou pohlaví ke stimulaci tvorby endogenních estrogenů a ke zvýšení hladin vitelogeninu. • Naopak působením antiestrogenních ED's (např. metoxychloru) se produkce vitelogeninu minimalizuje pod měřitelnou úroveň. • Sledován zejména u ryb a obojživelníků Další parametry: vitelin, cytochromy, hladiny hormonů Histochemická charakteristika a lokalizace Doporučené metody pro biologické monitorovací programy ve vodním prostředí na národních úrovních Metoda Organismus V sou časnosti používán v monitorovacích programech Biom arke r l átek Biologický význam Tvorba DNA adukt ů Ryby, mlži Francie, Holandsko, Švédsko, USA PAU, nitro látky, amino triazinové pesticidy Parametr genotoxických vlivů, citlivý indikátor minulé a současné expozice Inhibice acetylcholiesterázy Ryby, korýši, mlži Francie Organofosfáty a karbamáty nebo podobné molekuly, možné řasové toxiny Parametr expozice Indukce met allothionein ů Ryby Monitoring and Research Programme of the Mediterranean Action plan, Holandsko Indukce metallothioneinových proteinů vlivem určitých kovů (Zn, Cu, Cd, Hg) Parametr expozice a disturbance metabolismu mědi a zinku Indukce ethoxyresorufin- O-deetylázy (EROD) nebo cytochromu P450 1A Ryby Německo, Francie, Holandsko, UK, Belgie, Monitoring and Research Programme of the Mediterranean Action plan, Norsko Indukce enzymů detoxikujících planární organické kontaminaty (PAU, planární PCB, dioxiny) Možný prediktor patologie vlivem mechanistických propojení, senzitivní indikátor současné expozice Inhibice A-amino levulinové kyselina (ALA-D), indukce vitellogeninu Samci a juvenilní jedinci ryb Holandsko, UK Estrogenní látky Parametr feminizace sam čích ryb a reprodukční poškození RÜSE Aplikace biomarkerů v akvatických testech > Při přípravě testu nezbytné používat dobře charakterizovaný materiál - homogenní populaci > faktory ovlivňující biomarkery - druh organismu, pohlaví, věk, vývojové stadium a výživa, environmentální faktory (teplota etc.) > otestovat a nakalibrovat potřebné množství vzorku podle množství sledovaných parametrů, jejich limitu detekce a spotřeby biologického materiálu pro jednotlivé metodiky - u malých druhů směsné vzorky z více jedinců Biomarkery - závěry • Biomarkery = citlivé indikátory zatížení organismů environmentálními stresory a subletálních účinků •Umožňují náhled do subletálních fyziologických procesů -charakterizují mechanismus účinku • Specifické markery - informují o přítomnosti specifického stresoru • Použitelnost určitého biomarkeru pro každý nový druh musí být validována a optimalizována, musí být posouzena jeho relevance a míra odpovědi pro nový druh • Nezbytný multiparametrický přístup • Studium spojení časných subletálních biochemických a buněčných změn s dlouhodobějšími negativními účinky na úrovni populace a společenstva Speciální ekotoxikologické biotesty - in vitro • standardní testy (normy ISO, ČSN, USEPA) • optimalizace/vývoj nových testů • Toxicita • Specifické mechanismy neletálních účinků > Genotoxicita > Dioxinová aktivita > Mechanismy endokrinní disrupce - estrogenita, androgenita > Imunotoxicita > Biochemická ekotoxicita • Testování čistých látek (environmentálni polutanty) modelových směsí komplexních environmentálních extraktů In vitro toxikologie Testy na původních či geneticky modifikovaných prokaryotických či eukaryotických buňkách BAKTERIÁLNÍ TESTY, KVASINKOVÉ TESTY TESTY NA TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH 1 ^ .; lí Využití tkáňových kultur (TK) = Alternativní metoda k pokusům na živých organismů Výhody TK: výrazné snížení množství zvířat použitých v experimentu • zajištění vysokého počtu vzorků a možnost odběru kontrolních i experimentálních vzorků ztkáně jednoho zvířete, což minimalizuje variabilitu získaných výsledků. Nevýhoda TK: možnost sledovat účinky testované látky pouze na konkrétním druhu tkáně, ze kterého byla TK připravena, tedy chybějící možnost posouzení zdravotního stavu a chování celého živočicha. Např. k testování účinků ED's se využívají TK z jater drápatky vodní. Za 6 až 8 dnů po expozici xenoestrogenním látkám začne TK produkovat vitelogenin. Bylo prokázáno, že hladiny vitelogeninu vyprodukovaného TK a játry živé drápatky se statisticky významně neliší Nejznámější stabilní rybí buněčné linie využívané v testech toxicity jsou: RTG-2 (fibroblasty gonád pstruha duhového), EPC (epithelioma papillosum cyprini), R-1 (fibroblastické buňky jater pstruha duhového), PLHC-1 (jaterní buňky Poecilopsis lucida). Testy na buněčných kulturách • využívány zejména pro teoretické objasnění účinku toxického agens. • v poslední době i pro rutinní provádění testů toxicity. •prováděny za využití primárních buněčných kultur a stabilních buněčných kultur. Primární buněčné kultury se získávají z jednotlivých tkání organismů, jsou nestandardní, což může významnou měrou ovlivnit výsledek testu toxicity (= nízká reprodukovatelnost). • například stabilizované linie kožních buněk, nervových buněk, buněk srdečního svalu, buněk odvozených od tkání ledvin a pod. • buněčný substrát pro založení kultury se kdysi získal většinou od lidského dárce (jako vedlejší materiál např. při operaci), pak se stabilizoval a uzpůsobil k neomezenému dělení a následné kultivaci. • dnes se kupuje v buněčné bance, respektive Sbírce buněčných kultur. • možno získat stabilní buněčné linie z různých orgánů a z různých druhů organismů • tyto linie se velmi dobře přechovávají v hybernovaném stavu. • podle předepsaných podmínek (výživa, teplota, vlhkost apod.) lze danou buněčnou kulturu rozpěstovat a použít v toxikologickém testu. •buňky se nasazují do speciálních nádob pro pěstování buněčných kultur, přidává se živné medium obohacené o antibiotika, případně antimykotika • stabilizované linie se dobře pěstují, rychle rostou a lze vytvořit mnoho vzorků menších kultur, ke kterým se přidávají do kultivačního prostředí chemické či jiné látky a zkoumá se charakter toxických účinků dané látky. Používané metody Řada testů optimalizována na provedení v mikrodestičkách Toxicita a genotoxicita: měřen zákal či aktivita reporterového genu -spektrofotometricky, fluorimetricky či přirozená bioluminiscence Cytotoxicita: hodnocena přímými a nepřímými metodami. Přímé metody = posouzení celkového počtu uhynulých buněk a rozsahu cytopatických efektů. Nepřímé metody založeny na fyziologických reakcích buněk hodnocených na základě barevných reakcí. Mezi nejpoužívanější patří NR-test, který využívá schopnosti nepoškozených buněčných lysozomů přijímat neutrální červeň a dále MTT-test, založený na redukci MTT tetrazolové soli účinkem mitochondriální sukcinátdehydrogenázy. Výhodou těchto metod je jejich časová nenáročnost, možnost standardizace a miniaturizace. Modulace receptorově-závislých odpovědí: aktivita reporterového genu, např. luminometrie - indukce nebo inhibice reporterové luciferázy, nebo spektrofotometrie - indukce nebo inhibice reporterové P-galaktosidázy Stanovení hladin specifických mRNA a proteinových produktů - elektroforetické a imunoblotovací metody, Western blot, molekulárně biologické techniky Řada autorů provedla porovnání výsledků testů in vivo s výsledky testů in vitro s cílem posoudit možnost náhrady testů na živých organismech. Výsledky testů in vivo a in vitro spolu korespondovaly, v řadě případů byly shodné a v některých případech byla citlivost testů in vitro nižší. MECHANISMY chronické toxicity polutantů Princip: různé chronické účinky chemické látky vycházejí ze společného biochemického mechanismu působení - Základní výsledky z mechanisticky založených in vitro testů (TOXIN) RECEPTOR HormoN Biochemické účinky In vivo účinky > r - zhodnocení in vitro účinků jednotlivých látek • Poznání zásadního mechanismu, predikce rizika - Využití pro hodnocení rizik a/nebo monitoring •Určení relativních potencí ("toxických ekvivalentů") -> RA • Biomarkery in vitro - přímá charakterizace komplexních vzorků Receptorové-mediované mechanismy toxicity ESTROGENNÍ RECEPTOR - ER DNA-bind domain of the Oestrogen Receptor Testy receptorově-mediovaných mechanismů • Nejvíce studovaný - Aryl hydrokarbon receptor - umístěný v cytosolu • Jaderné receptory zahrnují několik rodin receptorů: Androgenní receptor (AR), estrogenní receptor (ER), progesteronový receptor (PR), glukokortikoidní receptor (GR) a mineralokortikoidní receptor (MR) jsou hlavními představiteli rodiny steroidních receptorů • Receptory slouží jako poslové mezi genomem a extracelulárními signály, na které musí buňka reagovat, aby přežila. •Buněčné receptory regulují na základě interakce s xenobiotiky expresi enzymů I. a II. fáze biotransformace a některých detoxifikačních transportérů. •Ve většině případů se jedná o indukci exprese (up-regulaci) cílových genů, které se přímo podílejí na biotransformaci nebo exkreci xenobiotik. Princip testu: sledovaná aktivita reportérového enzymu odpovídá potenci látky či směsi pro interakci s receptorem In vitro stanovení dioxinové toxicity - Stanovení na buněčné linii krysího hepatomu H4IIE.luc - Pod kontrolu AhR-responsivního elementu vložen gen pro luciferázu Diox. aktivní látky □ □ □ □ luminometr <- syntéza luciferázy ATP + lucigenin In vitro stanovení estrogenní aktivity Estrogen or xenoestrogen Light [ERŽ \ Nuclear Factors ER \ ERE-Luc Protein Phosphorylation of ER: \ DNA Binding Ligand-Independent Activation \ mRNA / Luciferase "Estrogenic Effects" ER-Responsive Genes RÜSE In vitro biotesty k detekci dioxinové a estrogenní aktivity Buňky H4IIE-Luc l Buňky r5ypos0nobrěykaadmvkovánM Buňky MVLN Po 24 hodinách vyměněno medium, dávkovány testované látky Expoziční doba : 3-72 hod Po expozici odstraněno medium, buňky vymyty pufrem a přidán Luclite reagent. Po 20 minutách měřena aktivita luciferázy v destičkovém luminometru. 7185 13 RUSE In vitro testy na buněčných liniích - hodnocení expozice látkami se specifickým mechanismem účinku (látky s dioxinovou, estrogenní aktivitou) - reportérové buněčné linie transfekované genem luciferázy, který je indukován po navázání ligandu na receptor - kalibrace odpovědi standardním ligandem (2,3,7,8-TCDD pro dioxinovou aktivitu, 17p-estradiol pro estrogenní aktivitu) Vztah mezi dioxinovými toxickými ekvivalenty stanovenými v biotestu na buněčné linii (TCDD-EQ) a spočítanými z výsledků chemických analýz 1600 1200 800 400 0 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 500 1000 TCDD-EQ (pg/g) 1500 5000 10000 15000 20000 25000 TCDD-EQ [pg/g] 0 Srovnání různých látek -> Použití v hodnocení rizik • Kvantifikace účinků (EC50) - relativní potence • Srovnání s účinkem referenčního toxikantu (2,3,7,8-TCDD) •Vyjádření jako relativní potence/ Ekvivalenční Faktor (~ TEF) 120 100 80 60 40 20 TCDD B[a]P B[e]P TCDD: IC50 PAH: IEC50 Relativní potence IEF = IC50 /IEC50 Kolikrát je ta látka slabší ligand než TCDD ? 1.E-07 1.E-04 1.E-01 1.E+02 0 concentration 1(1 M) Toxické equivalenční faktory pro PCDDs, PCDFs a PCBs: Table 4. Toxic EquivalenL Faclor.s e.slabliühed by ihe who (who-TEFs) for dioxinsand dioxin-like PCBü |4| PCDD Congener WHO-TEF PC D F Congener WHO-TEF PCB Congener WHO-TEF 2,3,7,8-TCDD 1 23,7,8-TCDr 0.1 Non-off ho 12,3,7,8-PeCDD 1 12,3,7>PeCDF 0 05 PCB#81 0 0005 123478-HxCDD 0.1 23478-Pe CDF 0.5 PCB#77 0.0005 123678-HxCDD D.l 123478-HxCDF 0.01 PCB#12ň 0.1 12317,89 HxCDD 0.1 123ft78-HxCDr D.l PCB#1Ů9 0.01 1234&78-HpCDD 0.01 234&78-HxCDľ 0.1 Mono-ortho OCDD 0.0001 123.7.89-HxCDr o.i PCB#105 0 0001 1234678-H pCD ľ 0.01 PCB#114 0 0005 1234789-H pCD F 0.01 PCB#118 0.0001 C Jí. oř 0 0001 PCB#123 0 0001 PCB#15& 0 0005 PCB#157 0 0005 PCB#1&7 0 00001 PCB#189 IJ.OOOl Eljarrat& Barceló, Trends Anal. Chem.22: 655 Testování komplexních vzorků ze životního prostředí • vzorky vzduchu, sedimentů, půd • rychlý screening znečištění • hodnocena toxicita, genotoxicita, dioxinová a estrogenní aktivita • výběr vzorků pro podrobnější studium/analýzu • spojení s analytickou chemií, frakcionace Problém reprezentativního vzorkování, uchovávání vzorku „pseudopersistentní látky" - kontinuální expozice nízkým dávkám Hodnocení přítomnosti látek se specifickým mechanismem toxicity v komplexních vzorcích. Příklad: AhR-aktivita 1) Srovnání toxicity různých vzorků, identifikace problematických 2) Identifikace nejdůležitějších toxických látek ve sledované oblasti: PAHs 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1,1 3,3 11,1 33,3 111,1 333,3 sample concentration (pg/ml) 3 5 3 0 2 5 2 0 15 10 5 0 10-7 10"6 10"5 10-4 10-3 102 103 104 Sample No. AhR^activity (TEO/g sed.) ER-activity(EEG/g sed.) Chemical analysis Locality 24 h 72 h H2SO4 treated (24h) 24 h 72 h TEQ(PAH)* ZPAJ-T EPCB*** 1 Litvínov 5363 2939 1419 4347 8650 280 3081 133,5 2 Litvínov 551439 120743 4220 69873 15255 5005 65346 45,6 3 Litvínov 1761 w.i. w.i. w.i. w.i. 169 1941 13,1 4 Zub ň 22725 996 w.i. w.i. w.i. 641 4207 32,1 5 Chropyně 7426 w.i. w.i. w.i. w.i. 586 3458 9,7 6 Chropyně 7281 1162 w.i. w.i. w.i. 1763 10278 37,0 7 Kroměříž 6179 741 w.i. w.i. w.i. 911 5263 13,6 8 Otrokovice 19282 1162 10 w.i. w.i. 1198 9428 14,8 Výhody toxikologických in vitro testů • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, snadnost provedení, menší náklady • ukazují celkovou biologickou aktivitu látek, které působí specifickým mechanismem • možnost provést screening velkého množství vzorků • mohou poukázat na přítomnost toxikologický významných látek, které nejsou běžně analyticky stanovovány • sledují i možné interakce (jako synergismus či antagonismus) působení látek v komplexních směsích Nevýhody toxikologických in vitro testů • nezohledňují biotransformaci látek v organismu • nemohou plně nahradit enzymaticko-imunitní reakci živého organizmu • neposkytují informaci o tom, které jednotlivé látky ze směsí vyvolaly odpověď • poskytují informaci jen o celkové aktivitě látek působících určitým specifickým mechanismem Závěr: Testy toxicity na buněčných kulturách jsou vhodný screening před provedením baterie testů na živých organismech.