Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Ekotoxikologické biotesty Půdní biotesty RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Q (g) TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání r*ht^^,& evr?p?xý | ZH5 ivi| % iMji ř00!?'11^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání "%t^J^ď fond V UR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ,<4NA*'" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ^ Půdní biotesty ■ Testy s půdními organismy ■ Matrice je půda (solid phase) ■ Cíl: chránit půdu a půdní biotu před účinky chemických látek a dalšími stresory ■ Proč? Půda je nepostradatelná složka přírody, základna pro růst rostlin, zásobárna živin, počátek a konec potravních řetězců a cyklů prvků, filtrační a dekontaminační zóna /^Ě^-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Proc ekotoxikologicke testy ? CHEMICKÉ ANALÝZY samotné NEDOKÁŽOU postihnout reálné riziko pro živé organismy: 1) reálná expozice se liší podle biodostupnosti toxických prvků a látek v dané situaci, 2) jde vždy o směs toxikantů, která působí jinak než jednotlivé toxikanty zvášť 3) Negativní vlivy matrice samotné bez ohledu na obsah toxikantů na živé organismy či interakce vlivu matrice s efekty toxikantů 4) spektrum analytických metod (tedy i limitních hodnot) je omezené a ve vzorku mohou být přítomny neanalyzované významně toxické látky. (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Proč testy kontaktní (půdní) ? ■ Účinky na půdní organismy exponované v pevné matrici nelze zcela extrapolovat z testů akvatických ■ Do hry vstupuje významně osud kontaminantu v půdním prostředí, vliv na reálnou biodostupnost pro půdní organismy ■ Nezanedbatelné vlivy samotné matrice (např. nevhodné fyz.- chem. vlastnosti, kombinace s toxicitou) /^Ě^-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí 1Důsledky expozice v pevné matrici ■ Pevné matrice jsou dosti heterogenní ■ Obsahuje vždy všechny tři fáze PEVNOU, KAPALNOU (pórová voda) a PLYN (vzduch) ■ Přítomnost pevné fáze zejména má významný vliv na OSUD a CHOVÁNÍ chemické látky ■ V závislosti na vlastnostech látky, vlastnostech půdy a /čase dojde k DISTRIBUCI látky v půdě, případně vzniku SPECIÍ ■ Stěžejním procesem je SORPCE a důsledkem je klíčový faktor půdních testů (eko)toxicity - BIODOSTUPNOST ■ To vše má fatální důsledky pro výslednou toxicitu a riziko ■ Důsledkem je i ztížená extrapolace mezi půdami, z akvatických testů na půdní a z laboratorních testů na reálnou situaci Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Schéma expozice v půdním prostředí POLUTANT v půdě prostorově distribuován a v různých formách EXPOZICE je funkce: osudu polutantu v půdě + vlastností organismu (morfologie, fyziologie, ekologie ...) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ORGANISMUS Polutant v organismu Metabolismus, eliminace, efekty Které vlastnosti matrice jsou kritické ■ Obsah organické hmoty - OM, TOC ■ Obsah jílovitých částic (0 < 10 um) ■ Kationtová výměnná kapacita ■ pH ■ Vlhkost ■ Struktura půdy %fMwT ■ Cas fc' .t&ft /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ j v prostředí Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Využiti půdních biotestu v ochrane půd Q (g) TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání r*ht^^,& evr?p?xý | ZH5 ivi| % iMji ř00!?'11^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání "%t^J^ď fond V UR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ,<4NA*'" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Využití půdních biotestů při ochraně půd ■ Zakotvení v legislativě = PROČ mají půdní biotesty své místo na slunci ■ Do teď zejména při hodnocení nebezpečnosti chemických látek a pesticidních přípravků ■ Silný nárůst zájmu o využití biotestů při hodnocení komplexních směsí jako jsou odpady, kal ČOV, sedimenty, komposty, hnojiva apod. ■ Velký potenciál biotestů při hodnocení kvality půd např. před a po remediaci, při inventůře kontaminovaných ploch apod. /^Ě^-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Legislativa vs půdní biotesty - ČR 1) CHEMICKÉ LATKY ■ Zákon č. 356/2003 Sb., O chemických látkách a chemických přípravcích a jeho prováděcí vyhláška č. 222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí (ve znění ve znění vyhlášky č. 389/2005 Sb.) ■ Jako povinné ekotoxikologické testy jsou uvedeny (včetně metodiky): ■ akutní test se žížalou E. fetida ■ testy efektů na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci dusíku a uhlíku ■ test efektů na aerobní a anaerobní transformace v půdě ■ Jde v podstatě o přeložené metodiky OECD testů /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Legislativa vs půdní biotesty - CR 2) PESTICIDY ■ Zákon č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a jeho prováděcí vyhláška č. 329/2004 Sb., o přípravcích a dalších prostředcích na ochranu rostlin ■ Příloha 1: Seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku ■ Příloha 2: seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné látky ■ S půdními biotesty souvisí požadavek na zhodnocení vlivů na: ■ necílové suchozemské členovce (dle metodiky SETAC/ESCORT) ■ žížaly (akutní, reprodukce a pokud potřeba i polní test) ■ mikroorganismy (dle metodiky SETAC) ■ Vyhláška č. 327/2004 Sb., ochrana včel, zvěře, vodních organismů před přípravky na ochranu rostlin ■ Definuje skupinu prospěšných, necílových členovců = beneficial, non-target arthropods ■ Definuje skupinu půdních organismů ■ Neobsahuje doporučení konkrétních testů Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Legislativa vs půdní biotesty - CR 3) ODPADY, HNOJIVA A DALSI ■ Zákon 185/2001 Sb., o odpadech a jeho prováděcí vyhláška č. 376/2001 Sb., o hodnocení nebezpečných vlastností odpadů (stejně jako EU pod kódem H14 je zde ekotoxicita) ■ Definuje hodnocení účinků na vyšší rostliny ■ Test inhibice růstu kořene hořčjce bílé výluhem odpadu (Metodika v Metodickém pokynu MŽP ke stanovení ekotoxicity odpadů - Zpravodaj MŽP 12/1998) ■ Kontaktní testovaní odpadů bylo dosud opomíjeno, ač má pro pevné odpady nesrovnatelně vyšší vypovídací schopnost, zejména v případě kalů, sedimentů, stavebních odpadů apod. ■ Hnojiva - pouze obecně definováno, že nesmí mít negativní vliv ■ (a Vyhláška č. 257/2009 Sb., O používání sedimentů na zemědělské půdě: chvostoskok, roupice, rostlina a mikroorganismy Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ■ Legislativa vs půdní biotesty - EU Council Directive 2001/59/EC adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances ■ Příloha V obsahuje metody včetně ekotoxikologických biotestů s žížalami a půdními mikroorganismy dle směrnic OECD ■ Council Regulation (EEC) 793/93 on the evaluation and control of the risks of existing substances ■ Regulation (EC) 1907/2006 of the European Parliament and of the Council concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) ■ Technical Guidance Document on Risk Assessment. Part II: Environmental Risk Assessment. European Chemical Bureau, Luxembourg (2003) = TGD /^ß7-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ J v prostředí ^| Legislativa vs půdní biotesty - EU ■ COUNCIL DIRECTIVE 91/414/EEC of 15 July 1991 concerning the placing of plant protection products on the market ■ Příloha 1 - seznam účinných látek hodnocených na evropské úrovni, které byly seznány, že rizika jsou přijatelná a není třeba je dále hodnotit na národní úrovni ■ Příloha 2 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné látky ■ Příloha 3 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku ■ Příloha 61 - podle čeho a jak se hodnotí na základě EC2 a SETAC3 metodik. Povinnými testovacími druhy necílových členovců jsou Typhlodromuspyri (dravý roztoč), Aphidius rhapalosiphi (lumčík), Chrysoperla carnea (zlatoočka), Coccinela septempunctata (slunéčko), Aleochara bilineata, Poecilus cupreus (střevlík), Orius laevigatus (klopuška), Hypoaspis aculeifer 1. Guidance document on Terrestrial Ecotoxicology in the context of Directive 91/414/EEC (SANCO/10329/2002) 2. Council Directive 97/57/EC of 22 September 1997 establishing Annex VI to Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market 3. Guidance Document on Regulatory Testing and Risk Assessment Procedures for Plant Protection Products with Non-Target Arthropods. From the ESCORT 2 Workshop (European Standard Characteristics of Non-Target Arthropod Regulatory Testing). Ed: MP Candolfi, KL Barrett, PJ Campbell, R Forster, N Grandy, M-C Huet, G Lewis, PA Oomen, R Schmuck, H Vogt. SETAC-Europe /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ J v prostředí ■ ■ ■ ■ ■ ■ Legislativa vs půdní biotesty - EU Směrnice 91/689/EEC o nebezpečném odpadu a seznamu odpadů (rozhodnutí 2000/532/EC) Rozhodující je 14 kriterií, která jsou odvozena z legislativy o nebezpečných látkách. Kritérium H14 značí „ekotoxické vlastnosti" - odpady, které představují nebo mohou představovat akutní nebo pozdní nebezpečí pro jednu nebo více složek životního prostředí. Zatím není definován odkaz k žádné metodě a ani v seznamu odpadů nejsou ekotoxické vlastnosti blíže specifikovány pro rozhodnuti, zda se jedná či nejedná o nebezpečný odpad. Příloha III direktivy 91/689/EEC pouze uvádí, že testovací metody by měly korespondovat s metodami legislativy pro chemické látky a dalšími doporučeními OECD. Standard EN 14735 definuje přípravu a nakládání se vzorky odpadů pro ekotoxikologické testy. v příloze B je obsažen i seznam použitelných ekotoxikologických testů. Z půdních jsou zde roupice, žížaly, chvostoskoci a rostliny Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí EU ringtest 2006-2007 Cíle: ■ zhodnotit standard EN 14735 ■ vyhodnotit aplikovatelnost baterie testů Umwelt Bundes Amt m rfrtkwtianiJtiKtt 10 [»io)nnol^col Apprm ícotoxkotogical Characterization of Waste Výstupy: ■ Kniha, report a zejména příprava nového EN standardu:"wT 292050: Characterisation of waste - Guidance on the use of ecotoxicity tests applied to waste /^fi7-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ J v prostředí EU - Základní sada testů Testy pevného odpadu Organismus Typ testu Eurtpointy Doba trvání Výsledek Norma zízala Eisenia fatida akutní mortalita 14 dní LC50 ISO 11268-1 [15] rostlina Áveno sativa, Bvasicca rapa akutní vyklíčení mhibice mstu cca 14 dní EC50 ISO 11269-2 [16] Testy vadného výluhu odpadu Organismus Typ testu Eudpointy Doba trvaní Výsledek Norma bakterie Vibrio Jisheri akutní mhibice luminiscence 30 min EC50 IS01134S [17] korýš Daphnia magna akntmVchronic kv mhibice mobility 4S hod EC50 ISO 6341 [13] rasa Desmoáesmus subcapitatus Pseuáokirch n eríella. subcapitata růst EC20 3 dny ISO 8692 [19] _—»^ ffň EU - Rozšířená sada testů Testy pevného odpadu Organismus Typ testu Endpointy Doba trvání Výsledek Norma V i- v i zízala Eiseriia fetida chronický reprodukce biomasa 56 dní EC50 13011268-2 [201 V i- v i zízala Eiseriia fetida chronický únikové chování 2 dny ISO/DIS 17512-1 [211 roupice Enchytraeus albidus Enchytraeiis crypticus akutní / chronický mortalita reproducke 4 týdny 6 týdnu LC/EC50 ISO 16387 [22] chvostoskok FoJsomio Candida chronický mortalita reprodukce 28 dní LC/EC50 ISO 11267 [23] Testy vodného výluhu odpadu Organismus Typ testu Endpointy Doba trvání Výsledek Norma okřehek Lemna minor chronický růst 7 dni EC50 ISO 20079 [24] umu Salmonella typlúmurium genotoxicita -aktivace genů 4hod ISO 13829 [25] bakterie Pseuáomans putida chronický růst 16 hod ISO 10712 [26] (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí \ Příprava nové legislativy v ČR ■ ■ ■ Aktivity CeHO MZP0002071102 - Výzkum pro hospodaření s odpady v rámci ochrany životního prostředí a udržitelného rozvoje Porovnání 18 testů na 18 odpadech Vybraná sada testů: ■ Test toxicity na perloočkách: ČSN EN ISO 6341 ■ Test toxicity na řasách: ČSN EN ISO 8692 ■ Test zhášení bioluminiscence baktérií: ČSN EN ISO 11348-1-3 ■ Test reprodukční toxicity na chvostoskocích: ISO 11267 ■ Test reprodukční toxicity na roupicích: ISO 16387 ■ Test inhibice růstu kořenů suchozemských rostlin: ISO 11269-1 Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ISO 16387 (2004) ISO 11267 (1999) ISO 11269-1 (1993) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Dostupné standardní postupy půdních biotestů ^ U (g) TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání r*ht^^,& e™p?*ý | ZH5 ivi| | iMji ř00!?'11^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání "%t^J^ď fond V UR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ,<4NAVÍ" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Půdní potravní síť vs dostupné biotesty Organic Matter Waste, residue and metabolites from plants, animals and microbes. First trophic level: Photosynthesizers Second trophic level: Decomposers Mutual ists Pathogens, parasites Root-feeders Third trophic level: Shredders Predators Grazers Fourth trophic level: Higher level predators Fifth and higher trophic levels: Higher level predators Standardy půdních biotestů - OECD Accepted standards 207 Earthworm, Acute Toxicity Tests (4th April 1984) 208 Terrestrial Plants, Growth Test (19th July 2006) 216 Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test (21st January 2000) 217 Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test (21st January 2000) 220 Enchytraeid Reproduction Test (13th April 2004) 222 Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) (13th April 2004) 227 Terrestrial Plant Test: Vegetitive Vigour Test (19th July 2006) Drafts Predatory Mite Reproduction Test in Soil (Hypoaspis (Geolaelaps) Aculeifer) 2009 Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies (Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae)) 2009 Collembola reproduction test with Folsomia candidaand F. fimetaria 2009 Bioaccumulation test with Eisenia fetida 2009 (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Standardy půdních biotestů - ISO ISO 15799 2003 Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials ISO 17616 2008 Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxicological characterization of soils and soil materials ISO 11268-1 1993 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate ISO 11268-2 1998 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetiddaa) - Part 2: Determination of effects on reproduction ISO 11268-3 1999 Effects of pollutants on earthworms - Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations ISO 11267 1999 Inhibition of reproduction of Collembola(Folsomia candida) by soil pollutants ISO 16387 2004 Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival ISO 20963 2005 Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) - Determination of acute toxicity ISO 15952 2006 Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) - Determination of the effects on growth by soil contamination ISO 23611 (1-6) 2006 -2010 Sampling of soil invertebrates - Part 1 - 6 (earthworms, microarthropods, enchytraeids, nematodes, macrofauna, design of field studies) ISO 17512-1 2008 Avoidance test for testing the quality of soils and effects of chemicals on behaviour - Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei) ISO/DIS 175122 Soil quality -- Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -- Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida) ISO/FDIS 10872 Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda) ISO 11269-1 1993 Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 1: Method for the measurement of inhibition of root growth ISO 11269-2 2005 Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants ISO 22030 2005 Chronic toxicity in higher plants ISO/AWI 29200 Soil quality -- Assessment of genotoxic effects on higher plants -- Micronucleus test on Vicia rsc Standardy půdních biotestů - ISO ISO 14238 1997 Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes ISO 14240-1 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 14240-2 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method ISO 16072 2002 Laboratory methods for determination of microbial soil respiration ISO 17155 2002 Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves ISO 15685 2004 Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation ISO 23753-1 2005 Determination of dehydrogenase activity in soils - Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC) ISO 23753-2 2005 Determination of dehydrogenase activity in soils - Part 2: Method using iodotetrazolium chloride (INT) ISO/TS 22939 2010 Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates ISO/CD 11063 Method to directly extract DNA from soil samples ISO/TS 10832 2009 Effects of pollutants on mycorrhizal fungi -- Spore germination test ISO/DTS 29843-1 Determination of soil microbial diversity - Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis ISO/DTS 29843-2 Determination of soil microbial diversity - Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the "simple PLFA extraction method" /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ J v prostředí Standardy půdních biotestů - US EPA 850.2450 Terrestrial (soil-core) microcosm test 850.4000 Background-Nontarget plant testing 850.4100 Terrestrial plant toxicity, Tier I (seedling emergence) 850.4150 Terrestrial plant toxicity, Tier I (vegetative vigor) 850.4200 Seed germination/root elongation toxicity test 850.4225 Seedling emergence, Tier II 850.4230 Early seedling growth toxicity test 850.4250 Vegetative vigor, Tier II 850.4300 Terrestrial plants field study, Tier III 850.4600 Rhizobium-legume toxicity 850.4800 Plant uptake and translocation test 850.5100 Soil microbial community toxicity test 850.6200 Earthworm subchronic toxicity test /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ J v prostředí Crop Type of natural enemies Examples1 Cereals Polyphagous predators Pterostichus cupreus+* Bembidion lampros+ Tachyporus hypnorum Aleochara bilineata+ Linyphiid spiders+ Lycosid spiders+ Chrysoperla carnea+ Aphid-specific predators Coccinella septempunctata+ Episyrphus balteatus Eupeodes corollae+ Aphid parasitoids Aphidius spp.+* Vegetables Polyphagous predators As for cereals Aphid parasitoids Aphidius spp.+ Diaeretiella rapae+ Lepidopteran parasitoids Trichogramma cacoeciae+ Orchards Predatory mites Typhlodromus pyri+* Amblyseius potentillae+ Aphid-specific predators As for cereals Lepidopteran parasitoids As for vegetables Polyphagous predators Anthocoris spp.+ Orius sp.* Glasshouses Predatory mites Phytoseiulus persimilis Whitefly parasitoids Encarsia formosa Aphid-specific predators As for cereals (except syrphids) Aphidoletes sp. Aphid parasitoids As for vegetables Leaf miner parasitoids Dacnusa, Diglyphus Opius+ Přirození nepřátelé škůdců z řad členovců, kteří jsou standardizováni ve směrnicích IOBC, BART, EPPO (Sams0e-Petersen, 1990) (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 1Organizace spojené s půdními testy ■ OECD = Organization for Economic Cooperation Development ■ ISO = International Standardization Organization ■ US EPA = US Environmental Protection Agency ■ SETAC = Society for Environmental Toxicology and Chemistry ■ IOBC = International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants ■ EPPO = European and Mediterranean Plant Protection Organization ■ ASTM = American Society of Testing and Materials ■ ANSI = American National Standards Institute ■ CEN = European Commitee for Standardization ■ AFNOR = Association Francaise de Normalisation ■ EEC = European Economic Community ■ WHO = World Health Organisation ■ BBA = Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft ■ OPPTS = The Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (EPA) ■ BART = Beneficial Arthropod Regulatory Testing Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí j Výběr testů do procesů hodnocení rizik ■ Optimální vlastnosti půdního testu jsou: ■ standardizovatelnost, opakovatelnost, variabilita ■ praktická proveditelnost, cena, rychlost ■ citlivost ■ vypovídací hodnota, použitelnost pro ochranu ŽP ■ ekologická relevance (samozřejmě platí vlastně i pro všechny další biotesty) /^Ě^-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ j v prostředí Příklad: sada testů z Vyhlášky 257/2009 Sb. Před testy s roupicemi a vyššími rostlinami jsou reprezentativní vzorek sedimentu i reprezentativní vzorek referenční půdy (půda, na kterou má být sediment použit) vysušeny při laboratorní teplotě, zhomogenizovány a přesáty přes síto 2 či 4 mm. Pro testy inhibice nitrifikace je referenční půdou nekontaminovaná půda splňující požadavky ISO 15685 (2004) a jak sediment tak referenční půda jsou vzorkovány, zpracovány a skladovány v souladu s ISO 10381-6 (2009): v přirozené vlhkosti, přes 2 mm síto, uchování v 4 °C maximálně dva týdny. Před testováním se hodnocený sediment smíchá s půdou v objemovém poměru 1:3, který vychází z maximálního povoleného poměru výšky použitého sedimentu a orničního profilu v vyhlášce. ISO 16387 (2004) ^fcy^/ vprostřed! 11269-1 (1993) ISO 15685 (2004) ISO 11267 (1999) I Ekologická relevance testů ■ testované druhy by měly reprezentovat relevantní funkční skupinu ■ test má respektovat ekologii organismu ■ sledované odpovědi by měly být ekologicky relevantní a indikovat stav a funkci organismu (přežití, růst, reprodukce, přijímání potravy a mobilita) ■ při sledování reprodukce by měla expozice pokrývat většinu životního cyklu ■ abiotické a biotické faktory by měly v testu být podobné jako v habitatu ■ expoziční cesty by měly napodobovat reálné expozice ■ biodostupnost kontaminantu by měly být podobná jako v reálu ■ koncentrace by měly být environmentálně reálné (u půdy obecně pro všechny látky lze jako maximum dát 1 g/kg půdy) /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí ■ ■ Ekologická relevance organismů hrají klíčovou roli ve fungování půdního ekosystému vyskytují se v řadě ekosystémů ve vyšší abundanci lehce použitelné v polních i laboratorních podmínkách dostávají se do kontaktu s polutanty jsou dostatečně citlivé na stres Problém ekotoxikologie obecne: ■ v testech použiji organismy A (z celé řady důvodů), ale cílové organismy v systému jsou B jaký je vztah výsledků pro A a B ? ■ Příklad: Eisenia fetida- nejznámější půdní test /^F~^\ I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Druhy žížal Dendrobaena octaedra Eisenia fetida - žije v kompostu !! Lumbricus rubellus Lumbricus terrestris Aporrectodea caliginosa Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Základní koncepce půdních biotestů ^ U (g) TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání r*ht^^,& e™p?*ý | ZH5 ivi| | iMji ř00!?'11^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "%t^J^ď fond V UR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ,<4NAVÍ" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Koncepce půdních biotestů (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ■ Jde o prospektivni prístup k HODNOCENI EKOLOGICKÝCH RIZIK ■ CÍL: Určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je bezpečná ■ K tomu slouží soubor půdních ekotoxikologických testů a následně metodika hodnocení ekologických rizik /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Půdní biotesty - koncepce Response Dose 1. Testuje se chemická látka koncentrační řada, např. 1, 10, 100, 1000 mg Cd / kgsuché půdy 2. Testuje se materiál typu kontaminovaná půda, sediment, kal ČOV apod. koncentrační řada vzniká „ředěním" s referenční půdou, např. 10, 20, 40, 80, 100 % kalu s čistou půdou /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí ProC testy kontaktní ? výluh 1:10 kontrolní půda smíchání v různých EETF P°měrech testy výluhů nelze simulovat toxicitu pevných vzorků PROC ? reálná BIODOSTUPNOST integrován EFEKT MATRICE (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Testovaní toxicity tuhe matrice Biotesty jako nastroj hodnoceni I kvality tuhé matrice Existují ISO normy určující výběr testů ■ ISO 15799 (2003): Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials ■ ISO 17616 (2008): Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxicological characterization of soils and soil materials /^ß^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ J v prostředí Biotesty jako nástroj hodnocení kvality tuhé matrice Retention function - Biotests with eluates Ecotoxic contents Genotoxic contents •ú, Luminescent bacteria test Algal inhibition test Umu-test Site inherent test organisms Added test organisms Bacteria contact test Earthworm avoidance test Respiration test Nitrification test (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Plant test Earthworm test Collembolan test j Expoziční systémy ■ Chemikálie smíchána s půdou ■ Artificiální půda (OECD, ISO) ■ Reálná půda (LUFA 2.2 či jakákoliv jiná) ■ Aplikace na povrch těla /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí m Expoziční cesty v pevném vzorku Ingesce a orální vstup potrava a půdní částice - organismy konzumují minerální a organickou hmotu - významná expoziční cesta pro sorbované chemikálie; kontaminanty se mohou bioobohacovat - např. v houbách, které konzumují chvostoskoci; významná cesta pro členovce Dermální vstup ■ z půdy, z půdního roztoku - zejména organismy vrtající v půdě (žížaly a roupice), které mají tenkou kutikulu a jsou v kontaktu s půdou a pórovou vodou; lze modelovat výsledky i z testů v akvatickém prostředí při doplnění modelu distribuce látky mezi půdní roztok a sorpci na částice = tzv. Equilibrium partitioning theory (EqP) Dýcháním m nejsou téměř žádná data Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^| Artificiální půda ■ 10% Suchá a jemně namletá rašelina ■ 20% Kaolinitový jíl obsahující minimálně 30% kolinitu ■ 70% Křemenný písek jemný obsahující minimálně 50% zrn o velikosti 0,05 - 0,2 mm ■ 0,3 - 1% Uhličitanu vápenatého, který je přidán tak, aby výsledné pH bylo 6 ± 0,5 /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Složeni artificialni pudy je předmětem výzkumu LUFA standardní půdy (http://lufa-speyer.de/) ■ Landwirtschaftliche Untersuchungs und Forschungsanstalt Speyer ■ přírodní půdy je potřeba před testy ošetřit: defaunace, úprava vlastností ■ Cena: 4 EUR za 1 kg + doprava LUFA 2.1 LUFA 2.2 LUFA 2.3 LUFA 5M LUFA 6S organic carbon (%) G.B1 t G.21 2.16 t G.4G G.9B t G.G5 1.29 t G.2G 1.75 t G.ll particles < 0.02 mm (%) B.2 t G.9 13.9 t 1.1 22.7 t 1.1 25.3 t l.B 65.1 t 2.7 pH (0.01M CaCl2) 5.1t G.4 5.4 t G.l 6.4 t G.6 7.2 t G.l 7.2 t G.l cation exchange capacity (meq/100g) 4t 1 1G t 1 B t 2 15 t 3 22 t 6 water holding capacity (g/100g) 33.2 t 1 4B.2 t 5 34.4 t 2 42.1 t 4 4G.7 t 5 weight per volume (g/1000ml) 14G4 t 46 1197 t 6G 1291 t 3G 1212 t 56 1264 t 9G Particle size (mm) distribution according to German DIN (in %): <0.002 3.G t G.9 6.4 t G.9 9.4 t G.9 1G.B t 1.3 42.1 t l.B 0.002 - 0.006 2.2 t G.7 3.5 t G.7 4.2 t G.B 5.4 t G.3 1G.B t G.7 0.006 - 0.02 2.9 t G.7 3.B t G.7 9.1 t G.5 9.1 t G.5 12.1 t 1.3 0.02 - 0.063 5.3 t l.B 5.4 t 1.2 1B.6 t 2.3 19.5 t 1.3 14.1 t 2.5 0.063 - 0.2 27.G t 3.1 35.4 t 2.3 29.3 t 3.4 3B.9 t l.G B.7 t G.9 0.2 - 0.63 57.2 t 4.3 44.B t 2.7 26.9 t G.7 14.9 t 1.G 9.G t G.3 0.63 - 2.0 2.4 t G.6 G.7 t G.l 2.5 t G.B 1.4 t G.l 3.2 t G.7 soil type sand (S) loamy sand (lS) loamy sand (lS) silty sand (uS) clayey loam (tL) Particle size (mm) distribution according to USDA (in %) <0.002 3.G t G.9 6.4 t G.9 9.4 t G.9 1G.B t 1.3 42.1 t 1.B 0.002 - 0.05 B.B t l.B 12.2 t G.6 29.B t 3.G 27.5 t 2.2 36.G t2.3 0.05 - 2.0 BB.2 t 1.2 B1.4 t 1.2 6G.B t 2.6 61.7 t 3.2 21.9 t 1.6 soil type sand loamy sand sandy loam sandy loam clay European reference soil set (IRMM-443-EUROSOILS) /^ß^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ J v prostředí Dávkování látek do půdy cílem je HOMOGENITA expozice testovanou látkou ■ 1. 2. (©) tli ve vode rozpustné ■ pro přídavek využita destilovaná voda, kterou současně adjustujeme potřebné ovlhčení půdy, přičemž by jejich koncentrace v přidávané vodě neměla přesahovat 50% saturační koncentrace nerozpustné ve vodě suspendovány ve vodním roztoku pomocí nosiče, který není toxický, je rozpustný ve vodě (aceton, etanol, arabská guma) a je volatilní rozpuštěny v organickém rozpouštědle, které není toxické a rychle se odpaří V předchozích případech lze aplikovat: 1. do malého množství (1-10%) jemného křemenného písku; po odpaření rozpouštědla je tato směs přidána do půdy a promíchána 2. přímo do vzorku půdy (suchý či vlhký) s následným odparem a promícháním Ve všech případech je nutno zařadit kontrolu na nosič respektive na rozpouštědlo nerozpustné ve vodě ani ve vhodném rozpouštědle lze smíchat přímo s křemenným pískem (2,5g písku na 20g půdy) ■ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Testovací design obecně ■ Mladí ale dospělí jedinci (většinou 10) jsou exponováni chemikálii (či kontaminované zemině) smíchané s artificiálni půdou v nádobkách ze skla či inertního materiálu (+ potrava) ■ Předběžný test - hledáme rozmezí používaných koncentrací (ředící faktor 10; 0,1 - 1000 mg/kg); mortalita hlavní endpoint hodnocený po krátké době (např. 2 týdnech) ■ Finální test - výstupem je funkce závislosti účinků na koncentraci testované substance (jemnější škála; nejlépe s faktorem 2); hodnoceny přežití dospělců (mortalita - akutní test) a počty juvenilů (reprodukce - reprodukční test) ■ NOEC design - méně koncentrací, ale více opakování - např. 5 koncentrací po 5 opakováních a kontrolní varianta (bez chemické látky, na rozpouštědlo apod.) ■ EC/LC design - více koncentrací, méně opakování - regresní metody /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Půdní biotesty s mikroorganismy o (i) TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání r*ht^^,& e™p?*ý | ZH5 ivi| | iMji ř00!?'11^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání "%t^J^ď fond V UR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ,<4NAVÍ" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Testy s půdními mikroorganismy OECD 216 (2000) Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test OECD 217 (2000) Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test ISO 14238 (1997) Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Soil sampling r Storage r r i Pre-incubation (7 days) >- ^ r START 10 g per replicate aerobic conditions 60% WHC; 22°C; dark Substance application > Negative control > Positive control 7th day 14th day 21st day 28th day Microbial parameters ^| Požadavky na půdu ■ přirozená půda, která je vybrána tak, aby byla citlivá vůči kontaminaci a splňovala tzv. "nejhorší scénář", tj. maximální expozici mikroorganismů polutantu v této půdě: ■ více než 70% písku ■ pH 5,5 - 7,0 ■ Corg 0,5 - 1,5% ■ Cbio/Corg více než 1% (dostatečné oživení) ■ kationtová výměnná kapacita vyšší než 70 mmol/kg ■ v historicky známé době nekontaminovaná (adaptace společenstva) Alternativy: ■ vzhledem k možnosti přítomnosti resistentních mikroorganismů v reálném společenstvu existují postupy, kdy je do sterilizované přirozené půdy inokulována specifická kultura mikroorganismů (Pseudomonasputida, Bacillus cereus) plynulý přechod k "solid phase testům (SPT)" toxicity s prokaryoty Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^| Endpointy v mikrobiálním testu ■ Standarně pouze mineralizace dusíku a uhlíku jako produkci CO2 a sumy minerálních forem dusíku (NH4+, N02-, NO3-) ■ Lze ale stanovit i další parametry: ^ ■ Mikrobiální biomasu 1 ■ Substrátem indukovanou respiraci ° ■ Enzymatické aktivity % m Kinetiku mineralizace C a N | ■ Amonifikaci, nitrifikaci ■ Diverzitu 0.01 0.1 i 10 100 Conc Ag (ppm) in soil . Výstupy: NOEC, LOEC, LC50, EC50, IC50 ... /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Stanovení mikrobiální biomasy Fumigačně-extrakční metoda ISO 14240-2 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method Bazální a potenciální respirace Voda Vzorek - 60% WHC Produkce C02 měřená 24 h/22°C VZOREK 40% WHC Předinkubován Vodav Glukóza Vzorek - 60% WHC + saturující množství glukózy í Produkce C02 měřená ^ 6 h / 22°C Bazální respirace Potenciální respirace ISO 14240-1 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 16072 2002 Laboratory methods for determination of microbial soil respiration Hodnocení mineralizace dusíku ISO 14238 1997 Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy - SIR kinetika A) Testování kontaminovaných půd B) Testování chemikálií ISO 17155 2002 Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy - Oxidace amoniaku ISO 15685 2004 Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation ■ ■ ■ Jde o míru nitrifikace = první krok nitrifikace SNA = short term nitrification assay PAO = potential ammonium oxidation ■ ■ ■ půda inkubována v roztoku síranu amonného chlorečnan sodný inhibuje oxidaci dusitanu po 6 hod stanovení NO2- Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Pudní biotesty s bezobratlými TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání r*ht^^,& e™p?*ý | ZH5 ivi| % iMji ř00!?'11^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání "í^tJ^J^ř fond V UR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ,<4NA*'" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky j Žížaly v ekotoxikologii ■ žížaly jsou asi nevíce a nejdéle ekotoxikologicky užívaný představitel půdní fauny Výhody a důvody: ■ celý vývojový cyklus probíhá v půdě - typický geobiont ■ zkonzumují velká množství půdy (vysoká expozice potravou a akumulace kontaminantů) ■ mají velmi úzký fyzikální kontakt s půdou (expozice pokožkou) ■ mají výrazné bioakumulační a biokoncantrační charaktery (jejich analýzou posuzujeme vliv delšího časového období) = patří mezi tzv. makrokoncentrátory ■ vysoký a významný podíl na tvorbě půdy, dekompozičních procesech, půdní úrodnosti ■ klíčové postavení v přenosu polutantů v potravních řetězcích ■ výskyt téměř ve všech půdách ve vysokých počtech i váhách ■ osvědčené, zavedené v laboratorních testech (nenáročný chov) ( ) H*f snadno se identifikují v reálných vzorcích (díky velikosti) ^| V různých testech různé endpointy ■ Mortalita ■ Reprodukce ■ Změny váhy ■ Behaviorální změny ■ Malformace ■ Fyziologické změny ■ Snížení imunity ■ Aktivity enzymů ■ Biochemické markery ■ Genotoxicita ■ ■ ■ ■ /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Eisenia fetida Výhody Standardní druh Snadná kultivace velkých počtů Krátký životní cyklus ■ ■ (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Chov žížal Nevýhoda těchto jinak perfektních testů: nároky na prostor, čas ■ boxy 50x50x15 cm s těsnícími víky ■ médium 1:1 směs kravího či koňského hnoje a rašeliny ■ pH cca 7 ■ nekontaminovaná amoniakem či močí ■ pokud vše jde dobře za 6 týdnů až 1000 žížal (na 20 kg směsi): týdně 2-5 kokonů s cca 4 juvenily na kokon ■ v optimálních podmínkách je dospělá za 2-3 měsíce ■ kulturu lze také získat ve vermikompostovacích firmách Synchronizace kultury: ■ začne se s kokony, za 3-4 týdny se vylíhnou, za 7-8 týdnů dospějí (20°C) výzKum l «/ v J Centrum pro výz toxických látek v prostředí 1E, fetida akutní test v půdě ■ dospělci E.f. jsou chovány 14 dní v artificiální půdě obsahující kontaminant (500 g půdy) ■ před finálním testem provádíme test hledající rozmezí koncentrací ■ kontaminace se udává v mg/kg; doporučené koncentrace jsou 0.1, 1, 10, 100, 1000 ■ dávkování (rozpustné x nerozpustné x pevné ... klasika) ■ vyšší koncentrace než 1000 mg/kg nejsou environmentálne relevantní a nemá smysl je testovat ■ na 1 koncentraci 1 nádoba v předběžném testu a 4 nádoby ve finálním testu ■ nádoba má 10 jedinců (dospělci: clitellum, váha 300 - 600mg, věk 2-12 měsíců, rozdíly ve věku by neměly být vetší než 4 týdny) ■ kontinuální osvětlení (400-800lx) zabezpečuje setrvání jedinců celou dobu v půdě ■ mortalita a váha po 7 a 14 dnech (nereagují na jemný mechanický stimul) se převede na LC50 ■ doporučuje se užití referenční látky - chloracetamid (LC50 mezi 20 a 80mg/kg) ■ kontrola - mortalita méně než 10% a úbytek váhy menší než 20% ISO 11268-1 1993 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) toxicity using artificial soil substrate Part 1: Determination of acute ^ E. fetida reprodukční test ■ v nádobách 1-2L s povrchem 200cm2, vrstvička asi 5-6cm (500-600g) AS ■ potrava 0,5g hnoje na jedince a na týden ■ do nádoby 10 dospělců ■ 1 týden předinkubace; předběžný test; finální test ■ 20°C; 16:8 400-800lx; krmení 5g sušeného hnoje týdně ■ po cca 4 týdnech mortalita, zvážení, spočítají se kokony + juvenilové; oddělají se dospělci ■ kokony se inkubují další čtyři týdny - extrakce juvenilů ručním tříděním ■ výsledky jsou váha dospělců a počet juvenilů na dospělce ■ KONTROLA musí mít cca 30 juvenilů/dospělce; koeficient variance pro reprodukci <30% a mortalita dospělců po 4 týdnech by neměla být větší než^ 10% ■ REFERENČNÍ LÁTKA je doporučován carbendazim; má mít statisticky významný efekt v koncentraci 1-5 mg/kg ISO 11268-2 1998 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) reproduction Part 2: Determination of effects on Eisenia fetida reprodukční test - začátek Příprava půd Měření WHC půd Ovlhčená AS rozvážená do testovacích nádob i Přídavek 10 adultů do nádoby na test (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Zvážení jedinců Výběr 10 reprezentativních adultů z chovu a jejich omytí dH20 Zvážení žížal Zhodnocení mortality Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí E. fetida - po 8 týdnech Po cca 20 min juvenilové na povrchu Vodní lázeň s narůstající teplotou 40°C až 60°C (©) Ruční třídění kokonů Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Sbírání a počítání Počítání Přiklad hodnoceni pesticidu Prüfung der Auswirkungen auf Regenwürmer Labortest mit Kompostwurm Kokons des Kompostwurms ein he im ische Regen wurm a rt Bewertunq: JER = U^L < 1fJ [ Mortalität, PEC Körpergewicht 2. Einfluss auf die Fortpflanzung (8 Wochen) Bewertung: Anzahl der Jungtiere, Körpergewicht TER = NOEC PEC < 5 3. Auswirkungen im Freiland (1 Jahr) Bewertung: Individuenzahlen, Risiken für Populationen und Lebensgemeinschaften 7.7 Earthworm Avoidance Test Guideline: Species: Substrate: Duration: Parameter: Test vessels: ISO/DIS 17512 (draft) E. fetida / E. andrei LUFA St. 2.2 standard soil 1 - 2 days Behaviour of the worms Dual chamber ^ Testy s roupicemi ■ Relevance: ■ Modelový organismus půdních destruentů ■ Roupice zastávají podobné funkce jako žížaly a v některých systémech je nahrazují ■ Realistická expozice - obývají horní vrstvičku půdy ■ Praktické výhody testů při srovnání s prostorovými, časovými a finančními náklady testů na žížalách: ■ 4-6 týdnů oproti 8 týdnům ■ 20g půdy oproti 1/2 kg ■ Malé ale dobře manipulovatelné ■ Malý a snadný chov (není potřeba hnůj) /^Ě^-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí ^ Enchytraeus albidus vs crypticus ■ E albidus: 15 - 40 mm ■ E crypticus je mnohem menší (5 - 10 mm) ■ praktické problémy - potřeba barvení ■ ALE dá se bez problémů kultivovat ve velkém na agaru ■ vzhledem ke kratší generační době ho získáme velké počty v krátké době (E.a. 33 dnů x E.c. 8 dnů) /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí ^ Chovy roupic ■ V půdě (E albidus, E crypticus) či na agaru (E crypticus) ■ Substrát může být artificiální půda, přírodní půda, či zahradní zemina, či směs např. 1:1 ■ Substrát musí být defaunizován (opakované zmražení a roztání), nesmí obsahovat polutanty a mít vhodné vlastnosti (zejména pH) a přesátý přes 2 mm ■ Krmení - autoklávované mleté ovesné vločky ■ V chovu musí být přístup vzduchu a optimální vlhkost ■ Indikátory nevhodného substrátu: roupice pohybující se pouze po povrchu, či snažící se uniknout z nádoby, nevyskytující se juvenilní jedinci apod. ■ Cyklus (18 °C): kokon obsahuje průměrně 5 - 15 vajíček; po 1-3 týdnech se vylíhnou juvenilní jedinci, kteří dospívají cca po 3 až 6 týdnech ■ 2 x týdně kontrola vlhkosti a krmení Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Test na reprodukci roupic - 1. část ■ Je možno provádět se dvěma druhy E albidusa E crypticus ■ Inertní nádobky a v každé 20g půdy pro E.a. a 10 g pro E.c. ■ Podmínky testu: optimální teplota (max 20 °C), vlhkost (40 - 60% WHC), osvětlení (perioda 16:8, 400-800 lux) ■ 10 dospělých jedinců (opasek s tečkami vajíček) do každé nádobky ■ Každý týden s vyjímkou prvního týdne po odstranění dospělců je přidávána potrava (cca 1,2 mg ovesných vloček na g půdy). ■ Mortalita - po 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se spočítají dospělci a odstraní se z půdy ■ Pozorování morfologických změn lze provádět na petriho miskách: ■ Jedinci jsou asi 12 hodin necháni na miskách v chladu, čímž dojde k vyčištění trávící soustavy. ■ Jedinec je přemístěn do kapky vody na podložní sklíčko ■ Pozorování začíná na 100x zvětšení a detailní studium externích a interních struktur provádíme při 400x zvětšení. Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Test na reprodukci roupic - 2. cast ■ Po odstranění adultů se inkubuje pouze půda s kokony (bez potravy) ■ Po dalších 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se hodnotí reprodukce - fekundita, pro extrakci juvenilních jedinců ■ Metoda mokré extrakce (fixace etanolem a barvení 1% bengalskou červení po 12 hodinách) ■ Kontrola v testu (bez aplikace chemikálie i nosiče) má vykazovat následující parametry: ■ mortalita dospělců méně než 20% na konci testu ■ rozmnožení nejméně 25 juvenilních jedinců na 10 dospělců (pro E.c. je zo 300 až 500) ■ koeficient variance pro počet juvenilů méně než 50% ■ Pozitivní kontrola - referenční látka by mělo vyvolat EC50) carbendazim (1,2±0,8mg/kg (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí OECD test 220 (2004): Enchytraeid Reproduction Test (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 1Avoidance test s E. albidus Parameter Test organism Test substrate Control substrate Eisenia fetida/andrei. or Enchytraens albidus, adult worms of similar size spiked artificial soil based on OECD guideline No. 207 (OECD 1984) uncontaminated artificial soil based on OECD guideline No. Bioakumulační test s máloštětinatci (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Biological parameters Endpoints Test duration Temperature Light regime & light intensity Test chambers Feeding during exposure Water Equilibration Test item Spiking of soil Analysis of test item Number of test concentrations Test concentrations Number of replicates per test concentration sampling date Number of organisms per test chamber Determination of soil diy weight and organic carbon content in soil Determination of lipid content in biota Validity of test Evaluation 207 (OECD 1984) concentration of test item in worms during uptake and elimination period bioaccumulation factor, uptake rate coefficient, elimination rate constant uptake period: until steady state or 28 d; plus 10 day elimination period 20 ± 2°C constant light: 400 to 800 be e.g. 250 1111750 mL glass tubes: additional chambers of appropriate size for chemical analyses food added to soil directly after spiking: additional feeding once per week during exposure periodic addition of deionised water 4 days: spiked soil under test conditions 14C-labelled/metal if possible, test item dissolved in water mixed with dry soil: optional: coating of sand in worms and soil 1 plus control(s) to be fixed (expressed in Bq or mg kg"1 soil dry weight) at least 3 per sampling date Eisenia: 1; Enchytraeus: 20 4 samples after soil preparation 4 samples at end of uptake phase* mortality during test period < 10% (earthworms). < 20% (enchytraeids) Use of appropriate methods (e.g. nonlinear regression analysis. ANOVA, Duimett's t-test) Testy s chvostoskoky ■ ekotoxikologicky dlouho využívané organismy - první test na filtračním papíře byl již v roce 1956 s DDT Výhody: ■ dobře prostudovaná skupina půdních bezobratlých ■ ekologická relevance ■ široce rozšířené, abundantní v půdách ■ lehce vzorkovatelní ■ lze je chovat v laboratoři ■ relativně rychlý životní cyklus s vysokou reprodukcí nejčastěji užívaným druhem je Folsomia candida ■ omnivor (řasy, bakterie, prvoci, detritus) > lehká kultura ■ partenogenetická povaha neposkytuje příliš ekologicky relevantní obrázek ■ Centrum pro toxických látek v prostředí i další druhy: Folsomia fimetaria, Isotoma viridis, Onychiurus armatus, O. quadricellatus, Orchesella cincta, Tullbergia granulata ^ Postup testu s F. candida Kultivace ■ na petriho miskách či jiných nádobách, kde je na dně štuková sádra (pH 6,4) a aktivní uhlí (pH 6-7) smíchané v poměru 8 až 10 ku 1, 100g směsi + 60-100g vody = dostatečná vlhkost; uhlí pohlcuje exkrety ■ tmavé pozadí umožňuje pozorování ■ 20-22°C; 70-80% rel. vlhkost vzduchu; 400-800lx ■ potravou jsou kvasnice párkrát týdně ■ po 8 týdnech je nutné přemístit do nové misky (tím se spouští ovipozice) Synchronizace ■ shluk vajíček se přemístí do nové nádoby; po 48h. odstranit zbylá vajíčka a krmí se juvenilové ■ nebo čerstvě vylíhlí jedinci se dají do nové nádoby a po nakladení vajíček se odstraní dospělci ■ manipulace pomocí exhaustoru dechového či automatického Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Test s F. candida ■ 30g AS + na počátku 2mg sušených kvasnic + 10 jedinců F.c. (10-12 dní staré) a těsně zavřít nádobky ■ po 28 dnech (případně po době, než se vylíhnou potomci z vajíček nakladených dospělci) se sleduje přežití a potomstvo (F1) ■ flotační metoda na konci pokusu ■ endpointy jsou reprodukce (produkce vajíček), růst, změny v chování, přežití ■ REFERENČNÍ LÁTKA: Betanal plus (160g/L Phenmedipham) či E605 forte (507,5g/L Parathion) efekt na reprodukci 100-200mg první látky a 0,1-0,18mg druhé ■ VALIDITA TESTU: v kontrole ne více než 20% mortalita a minimum 100 juvenilů na jednu testovací nádobu Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Folsomia Candida Testy s hhsticemi © © ■ Hlístice jsou de facto vodní organismy - žijí v pórové vodě Nesnadná extrapolace na reálné podmínky Velmi rychlé testy - krátký životní cyklus Hlístice jsou nejpočetnější půdní bezobratlí Existují varianty s půdou jako matricí Caenorhabditis elegans, Panagrellus redivivus, Plectus acuminatis Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ICaenorhabditis elegans chov a test ■ C elegans se chová na agarových plotnách s nárůstem E col/ ■ Nutné jsou aseptické techniky a opatrné zacházení ■ Několik medií - NGM - Nematode Growth Medium, LB - agar, K -roztok apod. ■ Po 1-2 měsících se přesazuje na nové plotny ■ Při nedostatku potravy se vyvinout tzv. Dauerovy larvy ASTM: E2172-01 Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity Tests with the Nematode Caenorhabditis elegans Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ C Elegans test ■ Protože testovací organismy by měly být stejné věkové a váhové kategorie, použije se synchronizovaná kultura nematod: ošetření kultury roztokem chlornanu a hydroxidu sodného (SAVO) - vajíčka rezistentní, dospělce usmrtí; pak cca 3-4 dny staré hlístice ■ připraví se varianty půd ve větších objemech; poté na petriho miskách (0 3,5) menší navážky + testovací organismy (10 jedinců) ■ po 24h. pokusu (20°C ve tmě) se provede speciální extrakce (Ludox® - koloidní suspenze) + centrifugace; nematoda jsou na povrchu supernatantu - přemístíme je na petriho misku s médiem a počítají se mrtví jedinci (bez pohybu při dráždění); spočítá se LC50 ■ kontrola pro validitu měření by měla mít 80% výtěžnost nematod z půdy a v kontrole 90% přežívání ■ pokud je test delší než 24h. musíme zajistit potravu - inokulum E.coli /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí t.5 MU TEST SOUÜTION 2.333 G SOIL. Postup 35MM DISH DAY 1 m m m Kontaminovanou půdu lze připravit předem Nutný je kvalitní mikroskop Tento test je méně ekologicky relevantní než ostatní půdní testy: hodně vodné fáze krátké trvání rychlý screeningový test (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí {MIX, EQUILIBRATE AT20*C) ADD 1Q WORMS (20-CFOR24 HR} I R!NSE WITH LUDOX § DAY 2 DAY 3 100MM OISH COUNT WORMS CENTRIFUGE 2500 RPM, 2 MIN. 1Testy s prospěšnými členovci b existuje pojem "užiteční členovci", spojen s ochranou před účinkem pesticidů na necílové organismy, například na pavouky, hmyz a roztoče které jsou přímo prospěšné, neboť v ekosystémech fungují proti škůdcům (predátoři a parazité škůdců) b existuje skupina IOBC (International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants) - připravila cca 30 testů v 3 stupňovém schématu hodnocení rizik (vychází z testů BBA a spolupracuje s BART) b cca 6 testů na blanokřídlých b 4 testy na broucích b 2 testy na dvoukřídlých b jeden na síťokřídlých b jeden na plošticích b 3 na roztočích b jeden na pavoucích b jeden na patogenní houbě Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Půdní biotesty s vyššími rostlinami TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání r*ht^^,& e™p?*ý | ZH5 ivi| % iMji ř00!?'11^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání "%t^J^ď fond V UR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ,<4NAVÍ" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ^| Testy s vyššími rostlinami ■ velké množství -obtížná přehlednost ■ dřívější testy zaměřené na klíčivost semen a elongaci kořene jsou označovány jako poměrně necitlivé a málo relevantní pro ekologii ■ pro relevantnější interopretace byly vyvinuty testy vícegenerační s možností studia subletálních účinků Nejpoužívanější endpointy 1. Klíčivost semen (půdní roztok) - nerelevantní 2. Elongace kořene (půdní roztok či půda) 3. Růst sazenic 4. Produkce biomasy 5. Životní cyklus (změny hmotnosti, počet květů, semen ..) 6. Enzymatický test 7. Fyziologické testy (fotosyntéza, respirace) Centrum pro výzkum » # v # i i i toxických látek v prostředí j Testy klíčivosti a elongace kořene ■ semena jsou exponovány v substrátu (křemenný písek), půdě toxické látce či přímo v kontaminované půdě z terénu a po 5 dnech se sleduje klíčivost -direct test ■ relativně necitlivý: semeno má bariéry pro vstup látky a energeticky je soběstačné, látka ho nemůže stresovat ■ postupy se v detailech liší, někdy bývá přímo spojen (US EPA) se sledováním délky kořene ■ jindy se ale vliv na délku kořene sleduje jako nepřímá expozice v roztoku Test inhibice růstu kořene Sinapsis alba ■ 72 hodin jsou semena vystavena roztoku látky (+kontrola) ■ 20°C; 5ml roztoku na petriho misku; 30 semen na misku; tma ■ stanoví se délka kořene a počet vyklíčených semen délka kořene hypokotyl V^É^/ v prostředí I Test růstu kořene ■ ISO 11269-1(1993): Soil quality -Determination of the effects of pollutants on soil flora - Parti: Method for the measurement of inhibition of root growth ■ rozšířená se salátem Lactuca sativa ■ PRINCIP: Měří se délka kořenů predklíčeného salátu v kontrole a zkoušeném vzorku po 5 dnech inkubace. Ekotoxicita vzorku je stanovena jako statisticky významný rozdíl v délce kořenů zkoušeného vzorku ve srovnání s kontrolou, popř. se stanoví hodnota EC50 z koncentrační (ředící) řady. /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ j v prostředí ^| Podmínky zkoušky • Teplota: 24 C 2 C • pH: 6,0 - 8,0 • doba expozice: 120h 2h • množství vzorku: 200 až 300 g vlhkého vzorku na zkušební nádobu • počet zkoušených semen - 15 predklíčených semen v jedné zkušební nádobě • počet paralelních stanovení: 3 až 5 • ostatní podmínky - bez osvětlení /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí ^ Postup - detaily • Predklíčení semen - na vrstvě filtračního papíru zvlhčené demineralizovanou vodou po dobu 36h až 48h, při laboratorní teplotě bez regulace osvětlení. Pro zkoušku se vybírají naklíčená semena s kořínkem, který je kratší než 2 mm. ^ Postup - detaily • Do nádoby se naváží 200 až 300 g zkoušeného vzorku nebo kontroly se známou sušinou, zvlhčeného na hodnotu 70% ± 5 % WHC • pravoúhlá síť např. 5x3 bodů • do jamek asi 1 cm hlubokých se pinzetou rovnoměrně rozmístí po 15 naklíčených semenech kořínkem směrem dolu • semena se k zemině přitlačí, zeminou se nezakrývají a takto připravené nádoby uzavřené víčkem se umístí do termostatu s teplotou 24°C ± 2 °C bez přístupu světla • po 5 dnech se salát šetrně oddělí od vzorku a změří se a zaznamenává délka kořenů ve zkoušeném vzorku a v kontrole s přesností na 1 mm /^Ě^Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí Vyšší rostliny ISO 22030 (200S): Chronic toxicity in higher plants Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí v _ Využití při registraci pesticidů Konzentrationsstufen im * Auswirkungen auf andere Pflanzen Auf lauf test Wachstumstest Lein Erbse Prüfpflanzen: 6 Pflanzenarten aus unterschiedlichen Familien 1. Stufe: Prüfungen im Gewächshaus Auflauftest: Auswirkungen auf Keimung und Auflauf Wachstumstest: Auswirkungen auf den Biomassezuwachs TER < 10 2. Stufe: Weiterführende Versuche • Verlängerte Gewächshausversuche • Mehr Arten • Freilandversuche F a-7 tii-id. rat ~7 H a LuTtLaijsbalt f • 1Půdní ekotoxikologie vs biotesty ■ Není soubor půdních ekotoxikologických biotestů ■ Pomáhá POROZUMĚT složitým vztahům mezi chemickými látkami, půdou a půdními organismy Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ■ Půdní ekotoxikologie vs biotesty Chceme určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je bezpečná Funkční biotesty pro proveditelné hodnocení rizik Porozumění komplexní problematice Chceme určit, jaké efekty a proč mají chemické látky a jejich směsi v půdách určitých vlastností v určitých podmínkách a jaké to bude mít důsledky a proč. /^Ě^-Vv I Centrum pro výzkum toxických látek V^É^/ | v prostředí