Hodnocení toxických vlastností: Vyhodnocení ekotoxikologických testů Teorie zdravotní kondice ve vztahu k expozici toxickou látkou Hodnocení ekotoxikologických dat - Úplnost dat - Správnost dat • Spolehlivost: jak dobře je studie provedena, jak jsou interpretovány výsledky? Jsou aplikovány a dodrženy standardní metodiky? • Relevance: je použitý test vhodný? Jsou výsledné parametry stanoveny za relevantních podmínek? • Interpretace dat: nezbytné využití expertních znalostí •Např. pokud je trvání testu odlišné, sledované parametry různé (NOEC -EC50).... Faktory ovlivňující toxicitu •Původ organismů • Aklimatizace • Abiotické faktory - Foto-indukovaná toxicita -pH - Tvrdost -Teplota - Obsah kyslíku - Organické látky • Fyziologický stav •Věk •Pohlaví Odpověď na stres: prahová, bezprahová a hormeze •Prahová - žádná biologická odpověď při nízké dávce, pak se odpověď projeví se vzrůstající dávkou • Bezprahová - bez biologické odpovědi pouze na nulové koncentraci •Hormeze - počáteční biologická odpověď na toxikant je pozitivní, při vzrůstu koncentrace se stává negativní (příp. naopak?) Prahová odpověď Bezprahová odpověď Hormeze Increasing concentration of sllclochemicals-------> Hodnocení ekotoxikologických účinků - prahová odpověď Hodnocení vztahu dávka-odpověď: ke stanovení „predicted no effect concentration" (PNEC) = předpokládaná koncentrace nezpůsobující žádný účinek • Identifikace nebezpečnosti: identifikace škodlivých účinků Hodnocení ekotoxikologických účinků • PNEC: PEC < PNEC: zajišťuje komplexní ochranu prostředí • PEC = predicted environmental concentration = očekávaná environmentální koncentrace • Výpočet PNEC: násobení NOEC nebo EC50 přepočtovým faktorem (faktorem nejistoty) za využití statistických extrapolačních technik •Přepočtové faktory jsou používány k zohlednění nejistot • Nejistoty: - intra- a inter-laboratorní variabilita v toxikologických datech - intra- a inter-druhové rozdíly (biologická variabilita) - extrapolace z krátkodobých na dlouhodobé testy - extrapolace z laboratorních dat na situaci v prostředí (synergistické, aditivní a antagonistické účinky...) Hodnocení ekotoxikologických účinků Akvatické prostředí: Základní data: akutní toxicita pro ryby akutní toxicita pro bezobratlé test inhibice růstu na řasách Assessment factors to derive a PNEC aquatic Faktory nejistoty = bezpečnostní faktory Assessment factor At least one short-term L(E)C50 from each of three trophic levels of the base-set (fish, Daphnia and algae) 1000 One long-term NOEC (either fish or Daphnia) 100 Two long-term NOECs from species representing two trophic levels (fish and/or Daphnia and/or algae) 50 Long-term NOECs from at least three species (normally fish, Daphnia and algae) representing three trophic levels 10 ( Field data or model ecosystems Reviewed on a case by case basis Species sensitivity distribution (SSD method) 5-1, to be fully justified on a casa by case basis Species Sensitivity Distribution (SSD) Acute LC50 values of Carbaryl for 34 aquatic invertebrate species. The fitted log-normal SSD has a mean of 3.497 and a standard deviation of 2.063. " 100% 60% 2o% io% o% I -ä "5 ■JI .2 n o 40° S. 20-.-Í List of tested endangered species 0% /f 0.I 1. Apache trout 2. Greenback cutthroat trout 3. Shortnose sturgeon 4. Fountain darter 5. Greenthroat darter 6. Bonytail chub 7. Lahontan cutthroat trout 8. Colorado pikeminnow 9. Gila topminnow 10. Spotfin chub 11. Razorback sucker 12. Cape Fear shiner 13. Boreal toad C. dubia WQC 10 100 1000 Carbaryl concentration (|jg / L) 1 0000 P.promejas Colorado pikeminnow ela 4* 13 Razorback sucker 910 D. magna Bony Tail 12 Chub o.i i io ioo Carbaryl, ug/L iooo ioooo iooooo Křivka dávka - odpověď: základní nástroj pro hodnocení toxických vlastností látek Křivky dávka-odpověď jsou založeny na normálním rozložení biologických proměnných Populační odpověď na toxické látky je zpravidla skloněná nalevo Koncept individuální tolerance: základ modelu vztahu dávky-odpovědi • individuální účinná dávka (IED) -minimální dávka vedoucí ke smrti jedince • geneticky určená pro každého jedince ConcerMraliOrt Křivka dávka-odpověď • Graf ukazující biologickou odpověď, např. enzymu, proteinu, populace či společenstva na rozmezí koncentrací polutantu •Křivka mortality - obvykle zobrazována jako závislost kumulativní mortality na vzrůstající koncentraci Experimentální design pro testy toxicity Pokud nemáme podkladová data - pro úsporu materiálu při hledání lineární části odpovědi -> doporučen dvoustupňový proces Krok 1 - Skríningový test Exponovat 5-10 organismů 10x koncentrační řadě po 24-96 h Cílem určit rozmezí kde se nachází 50 % letální koncentrace (LC50) o o \0 © # mrtvých žádný žádný [X] mg/L několik 0 0 30% všichni 100% všichni 100% Koncen. 10-3 10-2 10-1 100 101 Krok 2 - Definitivní test Zpředchozích výsledků - stanovit rozmezí testu dolní = 10-2 = 0.01 mg/L horní = 100 = 1.0 mg/L • Provést test s využitím logaritmického měřítka koncentrací, protože organismy zpravidla odpovídají logaritmicky na toxikanty • Obvykle použít alespoň 5 koncentrací + kontrola - Kontrola-ověřuje toxicitu pozadí, ředící vody, media, zdravotní stav organismů, vliv stresu testovacího prostředí (testovací nádoby, osvětlení, teplota, atd.) - Validita testu!! např.úhyn >10% kontrolních organismů -> neplatný test! Příklad uspořádání definitivního testu Pokus. zásah Ředění Koncentrace (mg/L) 1 10-2 0.01 2 10-i.5 0.032 3 10-1 0.1 4 10-0.5 0.32 5 100 1.0 Kontrola 0.0 Design testu toxicity Kontrola 6 mg/L 25 mg/L 50 mg/L 100 mg/L Exponováno 20 jedinců/koncentraci Odpověď po 24 hodinách, jedinců 0 0 1 13 17 Odpověď po 96 hodinách, jedinců 0 0 9 15 20 Výsledek testu Koncentrace Kontrola 6 mg/L 12 mg/L 25 mg/L 50 mg/L 100 mg/L Účinek 24 h 0% 0% 5% 30% 65% 85% Účinek 96 h 0% 0% 20% 35% 75% 100% Ideální křivka dávka - odpověď Ideální křivka dávka - odpověď Logaritmické měřítko Křivka - sigmoidní tvar Hodnocení ekotoxikologických účinků • Sledované parametry testů toxicity krátkodobé studie: • LC50 (letální koncentrace) • EC50 (účinná koncentrace) dlouhodobé studie : • NOEC (no observed effect concentration) • LOEC (lowest observed effect concentration) • EC10 (10 % effects concentration) • ECx ( x % effects concentration) • MATC (maximal acceptable toxicant concentration) Parametry které mohou být vypočítány z křivky dávka-odpověď LD50 - účinná dávka, která způsobí 50% mortalitu testovacích organismů LC50 - 50% letální koncentrace - účinná koncentrace, která způsobí 50% mortalitu testovacích organismů EC50 - účinná koncentrace, která způsobí účinek (snížená reprodukce, růst atd.) u 50% testovacích organismů, či která způsobí 50 % maximálního účinku, 50% odpověď v testovací populaci (mg/L, ml/L...) IC r50 - inhibiční koncentrace, která sníží normální odpověď o 50% Další zahrnující jinou percentuální změnu (10%, 20%, atd.) EC05, EC20, EC90, ... Rozmezí EC20 - EC80 Letální účinky \ Stanovované parametry NOEC: No Observed Effect Concentration. Nejvyšší testovaná koncentrace látky, která nezpůsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou LOEC: Lowest Observed Effect Concentration. Nejnižší testovaná koncentrace látky, která způsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou. Nejbližší vyšší koncentrace než NOEC. NOEL: No Observed Effect Level. Nejvyšší testovaná dávka látky, která nezpůsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou NOAEL: No Observed Adverse Effect Level. Nejvyšší testovaná dávka látky, která nezpůsobila negativní účinek. Je pozorován účinek, ale není považován za nebezpečný. Letáli LOEC Odhad EC50 Všechny testy toxicity se snaží určit hladinu toxikantu, která způsobí nebo nezpůsobí žádný účinek MATC • Maximum Allowable Toxicant Concentration • maximální povolitelná koncentrace toxikantu - geometrický průměr NOEC a LOEC - často nazývaná "chronická hodnota" Testované koncentrace Kvalita výsledků je určena správným výběrem testovaných koncentrací EC0 EC100 -;- vzrůstající log koncentrací • Testované koncentrace by měly pokrývat rozmezí od koncentrací nevykazujících žádný účinek až po 100 % letální koncentraci •Dobře vybraná koncentrační řada pro stanovení EC50/LC50 má jednu koncentraci blízko EC50, a nejméně dvě koncentrace s částečným účinkem pod a nad EC50 - rozložených symetricky. • Koncentrační řada by měla být v geometrickém měřítku. Ředící krok (koeficient) obvykle 2 až 10 •Příklady koncentračních řad: -1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 látky s mírným sklonem odpovědi (některé pesticidy); koeficient ředění 10. -1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 ; příkřejší odpověď, koeficient 2. •Dobře vybraná koncentrační řada pro stanovení LOEC/NOEC má několik koncentrací v oblasti nízkých odpovědí, nad a pod očekávanou LOEC a relativně nižší ředící koeficient (< 2) Stanovované parametry NOEC • No Observed Effect Concentration = nejvyšší koncentrace, která ještě nevyvolává účinek statisticky významně odlišný od kontroly • Odpověď populace v testovaných koncentracích je porovnávána s kontrolou • Hledáme nejvyšší koncentraci, která nezpůsobuje toxickou odpověď Příklad určení NOEC Porovnáváme 3 testované koncentrace s kontrolou \ Přežívající dafnie v kontrole 20 20 20 20 20 P^ v v r my r Přežívající dafnie v koncentraci 19 20 20 20 20 5 mg/L P^ v v r my r Přežívající dafnie v koncentraci 19 20 20 19 19 10 mg/L Přežívající dafnie v koncentraci 18 19 19 19 19 20 m/L Stanovení NOEC • Studentův t-test • ANOVA (Analýza rozptylu) Dunnettůvtest Williamsůvtest • LSD test Studentův t-test 1 Control 5 mg/L \ Average value 20 19,8 Variance 0 0,2 No of observations 5 5 Difference 4 t stat 1 P(T<=t) (1) s 0,18695 N t krit (1) f 2,131846 ) P(T<=t) (2) ^ 0,373901 t krit (2) 2,776451 1 Control 1 10 mg/L Average value 20 19,4 Variance 0 0,3 No of observations 5 5 Difference 4 I t stat 2,44949 ( P(T<=t) (1) X 0,035242 \ 1 t krit (1) ( 2,131846 ; P(T<=t) (2) \ 0,070484 t krit (2) 2,776451 1 Control 1 20 mg/L Stř. hodnota 20 18,8 Rozptyl 0 0,2 Pozorování 5 5 Rozdíl 4 t stat 6 P(T<=t) (1) / 0,001941 \ t krit (1) í 2,131846 ) P(T<=t) (2) \ 0,003883 t krit (2) 2,776451 Výsledek analýzy rozptylu X C 1 3 10 Koncentrace (mg/L) 30 100 Nevýhody stanovených parametrů • Jejich hodnota je silně závislá na designu experimentu a na: -Počtu opakování -Počtu testovaných koncentrací - Proceduře výběru koncentrací -Přirozené variabilitě systému - Použitých statistických metodách Výpočet EC50 • Interpolační metody - Dvou dávková metoda - Probitová analýza - Logitová analýza - Lineární regrese - Nelineární regrese Křivka dávka - odpověď Interval spolehlivosti EC50 Dvou dávková metoda log(EC50) = x50 = xl + 0,5—— (x2 - xj) P2 - Pl • Nejjednodušší metoda odhadu • Pokud je EC50 zhruba známá • Jedna koncentrace v intervalu (20; 50) 80) Letální účinek EC0 EC100 ---* vzrůstající log koncentrací • Druhá koncentrace v intervalu (50; • Interval (20; 80) je zhruba lineární pro účinek vs. log koncentrací Analýza křivky dávka-odpověď PROBITOVÁ TRANSFORMACE • Založeno na hypotéze že resistence k toxikantůmje normálně rozložena • Použít probitovou transformaci pro usnadnění analýzy • Založeno na směrodatných odchylkách, takže každý probit je spojen s procenty odpovědi •Průměrná odpověď je definována jako probit = 5, všechny probity jsou pozitivní -> snažší vizualizace • Je možno využít probitovou analýzu k výpočtu LC50 protože probitová transformace zlinearizuje (narovná) kumulativní distribuční křivku Probitová analýza • Odpověď organismů na toxické látky = normální distribuce • Není možné měřit přímo normální rozložení, neboť účinek je kumulativní - zobrazení grafu kumulativní distribuce Normální rozložení Kumulativní distribuce Dávka Log Dávka Probitová analýza Lineární regrese: závislost účinku na log koncentraci 100 75 50 25 0 0 i 0,5 1,5 2 2,5 3 1 log c Převedení křivky dávka-odpověď na přímku (lineární odpověď) • Problematické hodnotit křivku •Převedení křivky dávka-odpověď na přímku by hodnocení usnadnilo O Kumulativní distribuce Transformováno na Probit l l Přímka (snadnější analýza) Log Dávka Log Dose % probit % probit % probit % probit % probit % probit 0,2 2,122 10,0 3,718 30,0 4,476 50,0 5,000 70,0 5,524 90,0 6,282 0,4 2,348 11,0 3,773 31,0 4,504 51,0 5,025 71,0 5,553 91,0 6,341 0,6 2,488 12,0 3,825 32,0 4,532 52,0 5,050 72,0 5,583 92,0 6,405 0,8 2,591 13,0 3,874 33,0 4,560 53,0 5,075 73,0 5,613 93,0 6,476 1,0 2,574 14,0 3,920 34,0 4,588 54,0 5,100 74,0 5,643 94,0 6,5S5 1,2 2,743 15,0 3,964 35,0 4,615 55,0 5,126 75,0 5,674 95,0 6,645 1,4 2,803 16,0 4,006 36,0 4,642 56,0 5,151 76,0 5,706 95,5 6,695 1,6 2,856 17,0 4,046 37,0 4,668 57,0 5,176 77,0 5,739 96,0 6,751 1,8 2,903 18,0 4,085 38,0 4,695 58,0 5,202 78,0 5,772 96,5 6,812 2,0 2,946 19,0 4,122 39,0 4,722 59,0 5,228 79,0 5,806 97,0 6,881 2,5 3,040 20,0 4,158 40,0 4,747 60,0 5,253 80,0 5,842 97.5 6,966 3,0 3,123 21,0 4,194 41,0 4,772 61,0 5,278 81,0 5,878 98,0 7,054 3,5 3,188 22,0 4,228 42,0 4,798 62,0 5,305 82,0 5,915 98,2 7,096 4,0 3,249 23,0 4,261 43,0 4,824 63,0 5,332 83,0 5,954 98,4 7,144 4,5 3,305 24,0 4,294 44,0 4,849 64,0 5,358 84,0 5,994 98.6 7,197 5,0 3,355 25,0 4,326 45,0 4,874 65,0 5,385 85,0 6,036 98.8 7,257 6,0 3,445 26,0 4,357 46,0 4,900 66,0 5,412 86,0 6,080 99,0 7,326 7,0 3,524 27,0 4,387 47,0 4,925 67,0 5,440 87,0 6,126 99,2 7,409 8,0 3,595 28,0 4,417 48,0 4,950 68,0 5,468 88,0 6,175 99,4 7,512 9,0 3,659 29,0 4,447 49,0 4,975 69,0 5,496 89,0 6,227 99,6 7,652 99,8 7,878 Vztah mezi normálním rozložením a směrodatnými odchylkami 34.13% -2 -1 0 1 2 Směrodatná odchylka Je složitější pracovat se směrodatnými odchylkami (34.13, 13.6, atd) - převedení SMODCH na probity 34.13% 3 4 5 6 7 Probity Příklad probitové analýzy Koncentrace (mg/L) Mortalita % Kontrola 0/10 0 0.3 0/10 0 1 0/10 0 3 1/10 10 10 4/10 40 30 9/10 90 100 10/10 100 Prohlédnout data -> zřejmé, že LC50 by měla být mezi 10 a 30 mg/L Graf -> fit line by eye (cca stejný počet nad a pod křivkou) Výsledkem testu log normální distribuce (sigmoidní křivka) Transformace dat : Krok 1 změnit osu "koncentrací" na logaritmické měřítko Transformace dat: Krok 2 Převést % odpovědi na lineární formu - např. probit nebo logit - využití probit- nebo logit-linearizované křivky dávka - odpověď Lineární regrese - probit vs. Log koncentrace Výsledné přímky nejsou příliš rozdílné '*Logit Log koncentrace Parametry toxicity odvozeny z křivek dávka-odpověď Probit -1 sd mean +1 sd +2 sd log (concentration) Odhad LC/EC z přímky lineární regrese Y = a + bX • Y - transformovaný logit/probit, •X - log C, • b - sklon regresní přímky, • a - intercept regresní přímky vypočítat log(LC50) vypočítat LC50=10log(LC50) Využití LC50 1. Aplikační faktor -LC50 x n =_= povolená dávka - Dobrá pokud nemáme lepší informaci (chronické testy) 2. Zhodnocení rizika -> nižší LC50 = toxičtější 3. Vede k chronickému testování •LC50 z akutního testu neposkytuje ekologicky relevantní výsledek -> potřeba testování na více ekosystémové úrovni • Probit je kompromis mezi proveditelností, náklady a možností získat dostatečná data pro rozhodnutí o environmentální toxicitě látky Srovnání dvou toxikantů Látka s odpovědí, kterou zobrazuje červená křivka je toxičtější než ta se žlutou křivkou Testy toxicity mohou být využity ke zhodnocení rozdílů v toxicitě dvou látek (pozor při interpretaci!) Sklon křivky dávka - odpověď Důležitý pro odhad trendu toxicity. Toxikant s mírným sklonem může být nebezpečný na nízkých koncentracích i když EC50 je vysoká. dafnie ryb y artemie Log koncentrace Modely vztahu čas-odpověď Hormeze počáteční biologická odpověď na nižších koncentracích toxikantu vykazuje opačný trend než při vzrůstu koncentrací • Vztah mezi expozicí kontaminantu a odpovědí organismu může být komplikovanější než se dříve věřilo • Vysoké a nízké dávky kontaminantu mohou mít na organismus rozdílný vliv (hormeze neznamená, že účinky nízkých dávek jsou prospěšné, jenom to že jsou odlišné!!) • Zapracování konceptu hormeze do ekotoxikologie a hodnocení ekologických rizik je v současnosti limitováno nedostatečnou znalostí mechanismu hormeze V! CD i/i Ol o o o o Response I mprqvsd í u netto n Dysfuncli on š CD O ČD Ö Q) 03 CD N CD Responsa H Dysfunction Improved lünction ^- Teoretická křivka hormeze III Maximum S;im*li:ion Doře 2,4-D (ppmj Benzene (LN dilnlicn) Calabrese and Baldwin (2003) V AO - z 20 ^ CELdmiurr and Aquatic Dl?int (H. verriyllarttj Nrrals Hsdurtass Activity i -■001 Q.1 1 10 Cadmium |uMj 40 90 iW ■ \ 140 ■ V. 10U ■ an - = >- tifl. - 1 i* ■ I 50 ■ S ■ Copperz-ti Hydra Raproduclian B 10 C'rpp&f (ug/L) i-; if. 3» I1-I1: 1 » 3 * ** (l) Araenrie -Erd 0.1 OS 1 1 sodum areenite (xiq-& M> I- a. | 100-a J 50 " cAUP flwil / A / femi \ (P) Pjelinoic Ac c end ^* _ * He* n^l Granules* C*lt$ *** 1*10-10 1X10-9 1X10-8 Rsurric. acid (Ml ixio-e Calabrese and Baldwin (2003) Regulační souvislosti • Obecně používán prahový model pro ne-karcinogeny, a lineární bezprahový model pro karcinogeny (včetně radiace; EPA, FDA, a NRc). •Přechod na model hormeze by pravděpodobně zmírnil některé limity pro polutanty ve vzduchu, vodě, potravinách a půdě. • To by mohlo vést ke zmírnění nákladů na dodržování environmentálních limitů a na remediační projekty. • Tato změna ale není moc pravděpodobná, i když s ukazuje, že mnoho toxikantů vykazuje prahové nebo hormezní působení v nízkých dávkách