Histochemická lokalizace kyselé fosfatázy (Beneš a kol. 1961 in Lojda a kol. 1979) Kyselá fosfatáza (AcP)= kyselá fosfomonoesteráza, ortofosfomonoester fosfohydroláza, 3.1.3.2 Enzym v kyselé oblasti katalyzuje hydrolýzu esterů ortofosforečné kyseliny s různými alkoholy a fenoly podle následujícího schematu: monoester o-fosforečné kyseliny + H[2]O AcP alkohol (fenol) + ortofosfát Kyselá fosfatáza navíc hydrolyzuje pyrofosfátové sloučeniny a působí jako transfosforyláza. Všeobecnými inhibitory jsou fluoridové a fosfátové ionty, naopak Mn^2+ ionty mohou enzym aktivovat, pH optimum je mezi 4 a 5. Kyselá fosfatáza je lokalizována hlavně v lysozomech. Existují též extra-lysozomální kyselé fosfatázy, které se vyskytují hlavně v ER a hyaloplazmě. Protože lysozomy se snadno zničí a kyselá fosfatáza zčásti není pevně vázána na strukturu, musí být zvláštní pozornost věnována předpůsobení pletiva. Aktivitu enzymu lze detekovat i na parafínových řezech, ale celková aktivita enzymu může být detekována jen na kryostatových řezech čerstvého pletiva metodou semipermeabilních membrán. K detekci aktivity kyselé fosfatázy lze použít azokopulace, Gomoriho srážecí reakce i indogenní metody. Univerzální metodou je simultánní azokopulace s naftol AS-BI nebo naftol AS-TR fosfátem jako substrátem a hexazonium-p-rosanilinem jako azokopulačním činidlem. Postup: 1. Fixace vzorků: 4% formaldehyd v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7,2, doba fixace 2 hod., (u citlivějšího materiálu 0,5 hod. na ledu při 0^oC) 2. Oplach v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7,2 2 x 5 minut 3. Kryoprezervace v 7,5% sacharose v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7,2 3 x 4. Příprava kryostatových řezů a přenos na podložní skla potažená chromovou želatinou nebo na semipermeabilní membránu 5. Inkubace řezů v inkubačním médiu - navrstvit na řezy umístěné ve vlhké komůrce a nechat inkubovat (30 – 60´při 37°C, 1 – 2 hod. při RT nebo několik hodin v ledničce při 4°C) 6. Oplach v destilované vodě 7. Postfixace: 4% formaldehyd v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7,2, (pro redukci bublinek v řezech) 2 - 4 hodiny 8. Oplach ve vodovodní vodě 9. Uzavření řezů do glycerol-želatiny (Při dehydrataci, obzvlášť při přechodu ze 100% EtOH do xylénu a uzavírání do pryskyřice dochází k eluci reakčního produktu a navíc barvivo není jasně lokalizováno. Proto se odvodnění nedoporučuje.) Výsledek: Místa s aktivním enzymem jsou zbarvena červeně. Příprava roztoků: 0,05 M TRIS-HCl pufr 1. zásobní roztok 0.2M TRIS (m.v. 121,14) 12,114 g do 500ml 2. zásobní roztok 0,1 N HCl (m.v.36,47) 4,16 ml do 500 ml pro pH 7,2: 250 ml 0,2M TRIS + 450 ml 0,1N HCl doplnit do 1000 ml destilovanou vodou 4% formaldehyd v TRIS / HCl pufru, pH 7,2 (8 ml 36% formaldehydu +64 ml pufru ) 7,5% sacharosa v TRIS / HCl pufru, pH 7,2 (7,5 g sacharosy do 92,5 ml TRIS/HCl pufru) Hexazonium-p-rosanilin Ostrost s jakou jsou zobrazeny lysozomy na řezech závisí především na koncentraci hexazotizovaného p-rosanilinu. Čím vyšší koncentrace, tím ostřejší je zobrazení lysozomů. Avšak s rostoucí koncentrací kopulačního činidla roste také žluté vybarvení pozadí řezů, hlavně po fixaci glutaraldehydem. Navíc při vyšší koncentraci hexazotizovaného p-rosanilinu je nebezpečí silnější inhibice kyselé fosfatázy. Pokud pracujeme s pletivy s vysokou aktivitou kyselé fosfatázy, doporučuje se vyšší pH inkubačního média a zvýšení koncentrace diazoniové soli pro zvýšení rychlosti azokopulace, i když získáme silnější žluté vybarvení pozadí. Naopak při nižším pH a nižší koncentraci diazoniové soli bude pozadí řezů čiré a místa s nižší enzymatickou aktivitou budou snadněji zobrazena, avšak místa s vysokou aktivitou budou zbarvena difúzně. Příprava hexazonium-p-rosanilinu roztok A bazický fuchsin (kvalita pro Schiffovo reagens) 400 mg rozpustit v destilované vodě 8 ml koncentrovaná HCl (36%) 2 ml míchat do rozpuštění a filtrovat roztok lze skladovat po měsíce při uložení v ledničce při 4°C roztok B 4% NaNO[2] roztok lze skladovat max. 1 týden při uložení v ledničce při 4°C. Těsně před použitím smícháme stejné objemy roztoku A a roztoku B. Pokud je barvivo dobré kvality, směs krátce po přidání dusitanu zežloutne. Hnědé zbarvení ukazuje na špatnou kvalitu barviva nebo na nedokonalou diazotaci, či ztrátu HCl. Výsledkem inkubace s takovou směsí jsou neuspokojivé výsledky (Lojda a kol. 1979). Inkubační médium naftol AS BI nebo AS-TR-fosfát 20 – 25 mg rozpustit v N,N-dimethylformamidu (DMFA) 1 ml pufrovaný hexazotizovaný p-rosanilin (nebo new fuchsin), pH5 – 5,5 (připraví se smícháním 2 ml hexazotizovaného-p-rosanilinu a 48 ml 2% acetátu sodného) 50 ml pečlivě zamíchat a po chvíli stání zfiltrovat Literatura: 1. Beneš K., Lojda Z. and Hořavka B. (1961): A contribution to the histochemical demonstration of some hydrolitic enzymes in plants. – Histochemie 2: 313 – 320. 2. Gahan P.B. (1984): Plant Histochemistry and Cytochemistry. – 301 pp., Academic Press London etc. 3. Lojda Z., Gossrau R. and Schiebler T.M. (1979): Enzyme histochemistry. A Laboratory manual. – 339 pp., Springer Verlag, Berlin etc.