Kultury izolovaných embryí 8. Jaroslava Dubová Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a anatomie rostlin Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Krytosemenné rostliny Vývoj embrya = embryogenéze _ in situ 1. zygoticka , />; v/Vro 2. somatická Co předchází embryogenezi? Makrosporoqeneze = tvorba makrospor 9 samicí archespor 1 makrosporocyt Meióza 1,11 tetráda haploidních makrospor (ď podobně u samčího gametofytu mikrosporoqeneze = tvorba mikrospor) Co předchází embryogenezi? 9 Makroqametoqeneze a tvorba zárodečného vaku (a podobně ď mikrogametogeneze = tvorba pylových zrn) tetráda haploidních makrospor fungující makrospora (makrospory) | mitotická dělení mladý zárodečný vak ^ diferenciace buněk zralý zárodečný vak = samicí gametofyt monosporický, bisporický, tetrasporický Vývoj zárodečného vaku typ Polygonum functional : coenocytic phase i i Bioassays 28:1067-1071, 2006 Anatropní vajíčko - schéma Co předchází embryogenezi? opylení, oplození a vývoj zygoty detaily podrobněji viz Rostlinná embryológie Embryogenéze - krytosemenné rostliny Rostlinné embryo je charakterizováno svým původem, svou morfologií a svým vývojem v čase. Původ: zygotická embrya vznikají ze zygoty, která je výsledkem fůze gametických buněk (vaječná a spermatická buňka) somatická embrya (syn. asexuální embrya, adventivní embrya, embryoidy) se vyvíjejí ze somatických buněk Morfologie: plně vyvinuté embryo je bipolární struktura se stonkovým meristémem na jednom konci a kořenovým meristémem na konci druhém; dále je charakterizováno specifickým typem listů, tzv. dělohami. Vývoj embrya v čase je charakterizován sledem typických morfologických stadií vývojová stadia embrya u dvoudeložných rostlin: zygota globulární embryo srdcovité embryo hruškovité (torpédovité) zralé embryo Embryogenéze Capsella bursa-pastoris Capsella bursa-pastoris - vývojová stadia embrya globulární embryo torpédovité embryo starší torpédovité zralé embryo embryo http: //botit. botany. wise. edu Embryogeneze Arabidopsis- Nomarski DIC 1 preglobuldrni 2 globuldrni 3 srdcovite 4 torpedovite DM Vernon and D Meinke (1994) Dev. Biol. 165: 566-573. Photos by DM Vernon Semeno a embryo fazolu PhaseoI us vulgaris L. osemení plumula děloha cikatrikula semenná jizva hypokotyl radikula pupek = hilum Kultivace izolovaných zygotických embryí historie aplikace Historický přehled experimentu Bonnet (1754) - klíčení zárodku fazolu zbavených děloh Sachs - 19. stol.- špatné klíčení embryí bez endospermu van Tieghem - pěstování izolovaných embryí na rozetřeném endospermu jiného druhu Brown a Morris (1890) - transplantace embryí ječmene do endospermu pšenice Hannig (1904) - izolace nezralých i zralých embryí Raphanusa Cochlearia Knudson (1920 - 1930) výsevy semen Orchidaceae (semena s malými embryi) - kultivace na agarovém médiu s cukrem bez symbiotických hub Ďietrich (1924) - možnost zkrácení dormance Historický přehled Raghavan - experimentální embryológie Torrey Monnier - izolace globulárních embryí Capsella Norstog - kultivace izolovaných embryí obilovin Preťová - izolovaná embrya Inu {Linum) Rangaswamy Bajaj Zenkteler - využití překonání aborce hybridních embryí po opylení in vitro V. Raghavan 1. kultivace izolovaných zralých embryí 2. kultivace proembryí Kultura izolovaných embryí aseptické vyjmutí embrya a jeho přenos do vhodného média a optimálních kultivačních podmínek • relativní snadnost získání embryí bez patogenu (povrchová desinfekce semen nebo plodu) • semena s tvrdým osemením - měkčení vodou, pak opakovaná desinfekce • podmínka nutná pro vývoj izolovaných embryí = nepoškození embrya (suspenzor) - preparační mikroskop • výběr média - čím mladší embryo, tím větší nároky Použití kultur izolovaných embryí • překonání dormance semen • prekonaní aborce embryí („embryo rescue") po křížení in situ nebo in vitro mezidruhové hybridy: bavlník, ječmen, rýže, juta mezirodové hybridy: Hordeum x Secale, Triticum x Secale, Hordeum x Hordelymus, Tripsacum x Zea • monoploidní ječmen • studie experimentální embryogenéze • zdroj mladého materiálu pro mikropropagaci Překonávání aborce embryí po opyI ování in vitro aggie - horticulture.tamu. edu/facuity/ king/Tissue_Culture_Lecture. ppt Hordeum bulbosum metoda tvorby haploidu Hordeum vulgare ječmen obecný 2n = 2X = 14 X I Hordeum bulbosum planý ječmen 2n = 2X = 14 izolace embrya postupná eliminace chromosomů H. bulbosum haploidní ječmen 2n = X = 7 mezidruhový hybrid zdvojení chromosomů Hordeum vulgare homozygotní ječmen obecný 2n = 2X = 14 • dříve to byla mnohem účinnější metoda pro tvorbu haploidních rostlinek než mikrosporové kultury (nevýhoda = použití jen u ječmene) • nyní, při použití zlepšeného složení média (sacharosa nahrazena maltosou), je mikrosporová kultura mnohem účinnější (~2000 rostlin ze 100 prašníků) Príklad získaní alopolyploidô Triticum durum pšenice 2n = 28 AABB x Secale cereale žito 2n = 14 RR izolace embrya haploidní hybrid 2n = 21 ABR i vysoce sterilní zdvojení chromosomQ Triticale 2n = 42 AABBRR mczidruhový hybrid aggie-horticulture.tamu.edu/facuity/ king/Tissue_Culture_Lecture.ppt Embryo and ovary culture 30 DAP Lammerts van Bueren et al., Luis Bolk Instituut Podélný řez semenem modřínu Larix dexidua (L.) MILL. dělohy SAM zbytek nucelu parafínový řez, barveno Heidenheinovým hematoxylinem, osemení odstraněno před procedurou Mikropropagace konifer z izolovaných embryí adventivní pupeny na hypokotylu __ZLA_ Kultivace izolovaných embryí konifer (P/cea, Pinus) povrchová desinfekce semen bobtnání semen ve sterilní destilované vodě přes noc opakování povrchové desinfekce semen sterilní izolace embryí inokulace embryí na povrch agarem ztuženého média M-S s přídavkem auxinu NAA a cytokininu BA (1F), kontrola M-S (1). stavba Podélný řez obilkou embrya kukuřice (Zea mays L.) endosperm Izolace a kultivace embryí kukuřice (Zea mays L.) povrchová desinfekce obilek bobtnání obilek ve sterilní destilované vodě přes noc opakování povrchové desinfekce obilek sterilní izolace embryí inokulace embryí na povrch agarem ztuženého média M-S. hodnocení experimentu - rychlost růstu klíčních rostlin (délka kořenů a prýtu) Somatická embryogenéze 9. definice, historie objevu mlčiace využiti I MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ. OPVzdélávání EVROPSKÁ UNIE M^^^l MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pn>konkumnceiehopiiMt MNA* ^erS/> INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNI Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Somatická (adventivní) embryogenéze vývoj bipolární struktury embryonálními stadii bez fuze gamet 1. spontánní SE in vivo somatická pletiva - kapradiny, orc\\\de']e,Kalanchoe reprodukční pletiva - Citrus, Mango 2. indukovaná SE in vitro nepřímá - přes stadium kalusu přímá - meristémy, zygotická embrya, klíč ní rostliny Totipotence somatických buněk Každá buňka obsahuje celou sadu genetických informací, které jsou nezbytné k vytvoření celé rostliny. Časová a prostorová exprese genů je přesně regulována, aby došlo k diferenciaci různých orgánů. Indukce SE musí sestávat z ukončení exprese genů vedoucích k diferenciaci orgánů a jejich nahrazení embryogenním programem („přepnutí morfogenetického programu") auxiny 2,4-Ď picloram Co víme o somatické embryogenezi a na co se musí výzkum koncentrovat Základní požadavky jsou obecně platné i pro zygotickou embryogenezi = regulace dělení a diferenciace pletiv Požadavky na indukci somatické embryogenéze: • kompetentní buňky • vhodné prostředí • stimul Typy regenerace na různých částech explantátu řapíku Ďaucus carota (Schäfer et aL, 1985) růst cytoplazmy a dělení buněk = 12 D stadium 4 buněk = 14 Ď globulární stadium = 18D srdcovité stadium = 24 D torpédovité stadium = 28 D zralá embrya = 30 D embryogenní oblast růst cytoplazmy a dělení buněk = 5D primordium stonku = 12 D bjevení se prýtu = 23D rhizogenní oblast \kaulogenní oblast růst cytoplazmy a dělení buněk = 2D primordium kořene = 5D objevení se kořene = 7-10Ď Produkce somatických embryí odvozených od kořenových explantátô mrkve Embryím] fram nilturcd f r lil' rviin Stcward et al. Science, 143, p. 20-27, 1964 Somatic embryogenesis callus culture (shoots) regenerated plant Lammerts van Bueren et al., Luis Bolk Instituut Somatic embryogenesis of Daucus carota: standard protocol (Ammirato, 198 3) Place 0.5-1 cm petiole explant or 0.5cm3 storage root explant on MS agar medium + 4.5 uM 2,4-D After 4 weeks growth (dark or lighted) there is enough callus Subculture every 14-18 days Erlenmeyers are placed on a gyrotary shaker and maintained at 25°C and agitated 125-160 rprn Subculture 2.0 -3.0 g of callus into 50ml of MS liquid medium + 4.5 uM 2,4-D contained in a 250 ml Erlenmeyer flask Aseptic ally aspirate and/ or decant the stale medium and re suspend the cells onto culture medium devoid of 2,4-D for initiation of embryo development ^vvvvvvv^^Vvv.,.,.v.;.;.;. Transfer the washed and sieved suspension For more normal development Pass the pro embryo suspension through a series of mesh sieves for a uniform embryo population. to 50ml of MS basal medium in Erlenrneyers. For more normal embryo development and to inhibit precocious germination, especially root elongation, 0.1-1 uM ABA can be added cultures should be grown in darkness. Embryos should appear in about 8 days and reach mature size in 10-15 days Somatic embryos can be placed out on agar medium devoid of 2,4 -D for plantlet development Plantlets are transferred to Jiffy pots or verrniculite for subsequent development Vývojová stadia somatických embryí globulární srdcovité torpédovité kotyledonární http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/IM^00003.^IF Zrání somatických embryí a desikace • předčasné klíčení = torpédovité embryo pokračuje v růstu do klíč ní rostlinky bez fáze dozrávání = chybí zásobní látky a tolerance k vyschnutí • akumulace zásobních proteinů • nárůst obsahu kyseliny abscisové • dehydratace Nepřímá somatická embryogenéze Ďebergh et al. somatická embrya Aesculus hippocastaneum odvozená z květenství Nepřímá somatická embryogenéze na kalusu Inu Somatická embryogenéze u dřevin Sitka spruce {Picea sitchensis) (Photo: br. P.Krogstrup) Jednobuněčný versus mnohobuněčný původ SE Haccius (1978) SE - nová individua vznikající z jedné buňky a jsou bez spojení s cévními svazky materského pletiva Raghavan (1976) a jiní mnoho případů, kde zjevné bipolární embryoidy vznikly z agregátů bunék Maheswaran et Williams (1985) - u přímé SE existuje gradient spojený s postupnou diferenciací pletiv - viz schéma Rozdíly mezi přímou a nepřímou SE (Sharp et a/. 1980) přímá SE - embryogenní buňky jsou již přítomny na explantátu = pre-embryogenně determinované buňky (PEDC), které potřebují pouze vhodné podmínky, aby došlo k expresi embryogenéze nepřímá SE - napřed musí dojít k redeterminaci diferencovaných buněk = proliferace kalusu a v něm u části buněk se uskuteční indukce embryogenně determinovaného stavu (IEĎC) Syntetická nebo umělá semena jsou jednotlivá enkapsulovaná somatická embrya Termín 'embling' se často používal pro označení rostlinek pocházejících ze somatických embryí nebo syntetických semen. Pro enkapsulaci embrya se používá Na-alginát nebo speciální gely, které se samovolně rozkládají. Limitující faktory pro širší použití a tvorbu umělých semen ve větším měřítku*. • kvalita a pravidelná tvorba somatických embryí • konverze embryí Příprava umělých semen Umělá semena Ďebergh et al. embryo enkapsulované v alginátu sodném Problémy: nepravidelnosti utváření SE (často nedokonale vyvinutá SE, absence meristému, velké interceluláry, absence zásobních látek a ABA) konverze Somatická embrya sóje enkapsulovaná v alginátu v Ďr. M. Gňga, Agritec s.r.o. Šumperk http://people.whitman.edu/~vernondm/embryo/plant.html embryogenéze Arabidopsis http://bibd.uni-giessen.de/ghtm/2000/uni/p000004.htm somatická embryogenéze a biotechnologie http://wwww.cirad.fr/presentation/programmes/biotrop/resultats/bi os itec i rad/es. h tm somatická embryogenéze - kaučukovník, rýže, banánovník aj. http://www.botanic-garden.ku.dk/eng/forskning/vaev2.htm somatická embryogenéze - jehličnany Využití SE - praktické i teoretické 1. u mnoha laboratoří je dnes SE základní metodikou pro množení transgenních rostlin 2. zatím ale není plně pochopeno ani její cytologické ani fyziologické nebo biochemické pozadí podstaty 3. praktické aplikace jsou zřejmé, ale SE je stále i objektem základního výzkumu, který by měl vést k pochopení diferenciace jako jednoho ze základních rysů biologických systémů. Otázky pro další výzkum 1. Co je podstatou konstituce embryogenní kompetence na buněčné a molekulární úrovni? 2. Jak jsou embryogenně kompetentní buňky produkovány během ontogeneze rostlin? 3. Molekulární organizace programu somatické embryogenéze a její realizace 4. Jaká je povaha stimulu, který indukuje program embryogenéze u kompetentních buněk? Kultivace drevokazných hub Příklad suspenzní kultury • uchování čisté kultury mycelia na šikmém agar-sladu (pasáž lx ročně) tma, 4°C • nárůst hmoty mycelia - Petři ho misky s agar-sladovým médiem termostat, tma, 25°C • pasáž mycelia na povrch skleněných perel s 3% sladem termostat, tma, 25°C • roztřepání mycelia a inokulace do 3% sladu třepačka, 25°C • inokulace substrátu nasyceného 3% sladem termostat, tma, 25°C • indukce tvorby plodnic chladový šok Kultivace drevokazných hub i Lentinus tigrinus - houževnatec tygrovaný (1) Pleurotus ostreatus - hlíva ústřičná (2, 3) rust mycelia na šikmém agaru ve zkumavce 1 týden po pasáži na agar - sladové médium (tma, 25°C) Kultivace drevokazných hub Pleurotus ostreatus - hlíva ústřičná růst mycelia na Petriho misce 2 týdny po pasáži na agar - sladové médium (trna, 25°C) Kultivace drevokazných hub Pleurotus ostreatus - hlíva ústřičná růst mycelia na sleněných perlách 2 týdny po pasáži na 3% sladové médium (trna, 25°C) Pleurotus ostreatus - hliva ústřičná plodnice kukuřičné šustí a vřetena nasycená sladovým roztokem