Imunotoxikologie - metody 1
Imunomodulace a její důsledky
Příčiny imunomodulací (pozitivní i negativní)
1) Genetická fixace
2) Vliv prostředí - získané během života
Důsledky imunomodulací (imunotoxicity)
- porušení proti-infekční a proti-nádorové ochrany
- neschopnost reagovat na vakcíny
- imunopatologie (autoimunita, hypersensitivity)
Působení:
- přímo na buňky I.S.
- na jiné buňky, které modulují I.S. (neuroendokrinní řízení)
ImunoDEFICIENCE
PRIMÁRNÍ - genetická fixace
- často vázané na X-chromozom (více ohroženi M)
- deficity B-buněk a produkce Ab
- neschopnost vyrovnávat se s bakteriemi
- deficity T-buněk
- funkční poruchy T-buněk
- SCID (Severe Combined ImmunoDeficienci)
- řada variant: T-B-, T-B+, NK ...
- krátká doba přežití
ImunoDEFICIENCE
SEKUNDÁRNÍ - získané
- řada faktorů
- metabolismus a výživa
- záření
- věk
- poranění (např. popáleniny)
- chronické infekce
- chemické látky
- stres - spojení s hormonálním řízením
AIDS: retroviry (integrace do genomu) - HIV-1, HIV-2
infikuje CD4+ T-b a některé APC
důsledky: selhání IS
- smrt v důsledku oportunních infekcí
- neobvyklé nádory
IMUNOTOXIKOLOGIE
Část toxikologie
,,Každá látka je toxická - o toxicitě rozhoduje jen dávka"
Každá látka v těle
- prodělává řadu dějů, které ovlivňují výslednou ,,dávku"
Toxikokinetika
- závisí na povaze látek (velké x malé, hydro- filní x fobní ...)
- příjem, distribuce, metabolismus, vylučování
Toxikodynamika
- mechanismy interakce látek s ,,receptory"
- jedna látka: více mechanismů ? Který je hlavní ?
- rozhoduje koncentrace v místě reakce a toxikokinetika
př. - reakce látky s HMC a jeho modifikace
- aktivace receptoru AhR v brzlíku
Jak lze prokázat ,,Imunotoxické působení" ?
1) Epidemiologické studie
(+) vysoká informační hodnota - studie s populacemi lidí
(-) - nákladné, velká přirozená variabilita
- řada kovariant (slunce, léky, stres ...)
imunotoxicita prokázána pouze pro několik málo typů látek
- dioxiny (PCDD/Fs) a polychlorované bifenyly (PCBs)
- azbest
- olovo
- některé pesticidy
Jak lze prokázat ,,Imunotoxické působení" ?
2) Laboratorní studie
(+) lepší definice, nízká variabilita experimentů
lze hodnotit velké množství parametrů I.S.
prostudována řada chemických látek
(-) jen laboratorní zvířata
,,nejednotné" efekty v různých vědeckých studiích
(různé dávky, různé doby expozice ...)
Jak lze prokázat ,,Imunotoxické působení" ?
Co je cílem imunotoxikologa ?
? poznání
: vědecká práce imunotoxikologů
: studie řady látek, různé experimentální přístupy
: často základní informace o možném účinku
? posoudit skutečná RIZIKA pro lidi, zvířata
Co je riziko? (nebezpečnost = riziko)
: látka zabíjí T-buňky = nebezpečnost
: látka je přítomna v toxické koncentraci = riziko
Existující riziko - praktické dopady (zákaz výroby ...)
=> potřeba standardizovaných protokolů
Standardizace hodnocení rizik v imunotoxikologii
Národní (mezinárodní) postupy a standardy
- NEEXISTUJE nadnárodní doporučení/zákon (WHO, EU ...)
- NEEXISTUJE nadnárodní standard (ISO)
- Významné národní postupy
Holandsko - RIVM (potkan)
USA - NIEHS/NTP (myš kmen B6C3F nebo BALB/C)
Postupy při testování imunotoxicity
,,Tiered" approach
Tier 1
- aplikace xenobiotika
- sledování vlivu na obecné a základní vlastnosti IS
Tier 2
- aplikace xenobiotika
- sledování funkční odpovědi
na specifické antigeny
(aplikace antigenů)
PRAKTICKÝ EXPERIMENTÁLNÍ DESIGN
1) Nejdříve - zjištění obecné akutní a chronické toxicity
(existují standardy ISO, OECD ...)
Akutní toxicita (24-48 hodin, i.p. aplikace)
Kontrolní skupina 10 zvířat přežívá: 10
Expozice - koncentrace 1 5 zvířat přežívá: 5
- koncentrace 4 5 zvířat přežívá: 4
- koncentrace 20 5 zvířat přežívá: 2
- koncentrace 100 5 zvířat přežívá: 1
- koncentrace 500 5 zvířat přežívá: 0
Vyhodnocení LD50
LOEC
Chronická toxicita
zpr. 21 dní, dávky dle akutní toxicity
- 1/2 akutní LD50
- LOEC
- 1/10 LOEC
PRAKTICKÝ EXPERIMENTÁLNÍ DESIGN
2) Hodnocení imunotoxicity
viz dále
Praktické aspekty:
in vivo experimenty - potřeba velkého množství zvířat
: realizace jen v oprávněných případech
existují rozhodovací schémata - kdy a jak testovat?
? Lze in vivo nahradit in vitro ?
- v některých případech ANO - viz dále
http://www.fda.gov/cdrh/ost/ostggp/immunotox.html
Hodnocení imunotoxicity
podle RIVM
Tier 1 - obecná imunita
Tier 1 - RIVM - Hematologie a buněčnost
- Počty krevních buněk/mL
- Počty leukocytů, lymfocytů
: stanovení - mikroskopie: počítací komůrka
- jednoduché počítač - ,,cell counter"
Tier 1 - RIVM - Množství Ab & třídy Ig
- ELISA proti Fc fragmentům IgG, IgM, IgE
- Stanovení ,,titru" (čím vyšší ředění - tím více protilátek)
Vždy srovnání Kontrola vs. Exponované
Tier 1 - RIVM - HISTOLOGIE
- Hmotnost (a poměr k hmotnosti těla) orgánů IS a dalších
- zejména: slezina, thymus, uzliny
- Histopatologie
- fixace orgánu v parafinu
- tenké řezy cca 5 m (mikrotom)
- barvení & mikroskopie
Profesně náročné hodnocení
- expertíza
Slezina
Tier 1 - RIVM - Stanovení buněčnosti
- Buněčnost v kostní dřeni
- preparace femuru
- odstřihnutí hlavic
- výplach kostní dřeni
- Buněčnost ve slezině
- slezina / homogenizace
Myš: 108 buněk
- 4-8% adheruje MF
- 60% B-b
- 40% T-b.
- stanovení počtů bb.
(cell counter)
- stanovení typů bb.
(flow cytometer)
Průtoková cytometrie
- subpopulace lymfocytů
Fluorescenčně značené protilátky proti povrchovým antigenům
(CD3, CD4 ...)
Zástin
,,buňka a její velikost"
Fluorescence
Typ buňky
Průtoková cytometrie
- subpopulace
Fluorescenčně značené protilátky proti povrchovým antigenům
(CD3+/CD4+, CD3+/CD8+ ....)
Hodnocení imunotoxicity
podle RIVM
Tier 2 - specifická imunita
B-buňky
T-buňky
Tier 2 - RIVM - Protilátková odpověď
ELISA proti IgM na T-nezávislý Ag (LPS)
Antigenně specifické ELISA
- ELISA proti T-závislým Ag
: tetanový toxin (anaT)
: beranní erytrocyty (SRBC)
_____________
Viz dále:
Proliferační odpověď
bb. ze sleziny na LPS
Počty buněk produkujících Ab
proti SRBC: Plaková metoda
Proliferační odpověď B-bb. ze sleziny proti LPS
Homogenizace
a izolace buněk
-lyza erytrocytů
aplikace LPS
-> stimulace B-lymfocytů
kultivace in vitro (48 h)
Přidání *3H-Thy
Inkorporace do DNA
dělících se buněk
(24 h)
Oplach radioaktivního media
Stanovení radioaktivity (CPM) v buňkách
Plaková metoda - stanovení počtů B-bb.
- xenobiotikum
- antigen (=SRBC)
- izolace buněk ze sleziny -> agar
- opakované přidání antigenu (SRBC)
a přidání komplementu (morče) do agaru
- kolem buněk produkujících Ab proti
SRBC -> lyza SRBC: plaky
(PFC = plaque forming cells)
Plaková metoda - varianty
ELISPOT - Stanovení počtů buněk produkujících Ab
- destička krytá antigenem (anaT)
- přidání buněk (v různých ředěních)
- produkce Ab proti anaT v jamce
- sekundární Ab-HRP
- HRP - NEROZPUSTNÝ produkt
- počítání ,,spotů"
Tier 2 - RIVM - Buněčná odpověď (T-bb.)
Proliferační odpověď T-bb. ze sleziny
- nespecifické
- mitogeny (lectiny/sacharidy - ConA, PHA)
- jiné lymfocyty (smíšená lymfocytová reakce - MLR)
- specifické antigeny (SRBC, anaT)
Design stejný jako u B-bb.
Tier 2 - RIVM - Buněčná odpověď (T-bb.)
Test na T-závislé Ag (ovalbumin, tuberculin, Listeria)
,,DTH" test (delayed type hypersensitivity)
MEST - Mouse Ear Swelling Test
- Vyholení břicha, opakovaná aplikace Ag v pásce (3-5 den)
- po 10 dnech: Ag do jednoho ucha (solvent do druhého)