Imunotoxikologie - metody 2
Hodnocení imunotoxicity
podle RIVM
Tier 2 - specifická imunita
Makrofágy
NK buňky
Tier 2 - RIVM - Funkce makrofágů
Hodnocení ,,oxidativního vzplanutí" MF
- likvidace patogenů MF - řada enzymů / oxidace
- nespecifické stimulace (cukry) - LPS, zymosan, škrob
Stanovení reaktivních radikálů (ROS) po stimulaci
- krev (nebo bb. ze sleziny)
- přídavek sondy citlivé na oxidaci (luminol, fluorescein ...) + stimulace (LPS ...)
- měření kinetiky - luminiscence (luminol) / fluorescence (fluorescein)
Tier 2 - RIVM - Funkce makrofágů
Hodnocení ,,oxidativního vzplanutí" MF
Zdravé MFs
Tier 2 - RIVM - Funkce makrofágů
In vitro fagocytoza (a likvidace patogena)
- buňky ze sleziny nebo výplach břicha i.p. (adherence na povrch)
- aplikace na sklíčko / misku
+ přídavek fagocytovaných objektů:
- fluorescenčně značené latexové kuličky NEBO
- bakterie Listeria monocytogenes
+ možnost přidat cytokiny (IFN-gamma)
- inkubace 15-30 min
- fixace (& barvení) - fluorescence:
SCHOPNOST FAGOCYTOVAT
- nebo: kultivace živých L. monocytogenes
SCHOPNOST ZABÍJET
Tier 2 - RIVM - Funkce makrofágů
In vitro fagocytoza (a likvidace patogena)
Tier 2 - RIVM - Funkce NK-buněk
In vitro likvidace nádoru
- buněčná nádorová linie YAC-1 (nebo P815, L1210...)
- pre-inkubace s radioaktivně značeným substrátem Na2
51CrO4
- varianta: fluorescenční značení (méně citlivé)
- dokonalé odmytí (aktivní jsou jen buňky - nikoliv médium)
- smýchání s buňkami ze sleziny (specif. poměr ,,effector:target" ratio)
Modifikace: + přídavek IFN-gamma a LPS = zabíjení nádoru MAKROFÁGY
(odlišení od funkce NK bb. - NK bb. nepotřebují stimulaci !)
- inkubace 20h, centrifugace všech buněk
- stanovení radioaktivity v médiu
(aktivita pochází z rozbitých nádorových buněk)
- varianta: měření fluorescence (méně citlivé)
Tier 2 - RIVM - Funkce makrofágů
In vitro likvidace nádoru
Radioaktivita v myších po
aplikaci YAC-1 (rozvoj nádorů)
Inhibice lýzy YAC-1
po přidání modelové látky
Hodnocení imunotoxicity
podle RIVM
Tier 2 - specifická imunita
Testy hostitelské rezistence
? Projeví se in vivo imunotoxicita
pro určitou funkční část I.S.?
Tier 2 - RIVM: Hostitelská rezistence
Likvidace patogenů
Problémy: In vivo práce s patogeny ...
Bakterie - modely
Listeria monocytogenes
intracelulární patogen,
likvidace T-závislá (vyžaduje stimulaci MF)
Streptococcus
extracelulární G+ bakterie
likvidace - funkce Ab + MF
Viry - modely
Virus chřipky - neutralizační Ab, správná funkce IFN-a,b
Cytomegaloviry (herpes) - Tc, makrofágy, NK-bb.
Tier 2 - RIVM: Hostitelská rezistence
Likvidace patogenů Vliv TCDD na přežití
po infekci chřipkou
Tier 2 - RIVM: Hostitelská rezistence
Likvidace patogenů
Vliv cyklofosfamidu
(cytostatikum, karcinogen)
na titry virů
Tier 2 - RIVM: Hostitelská rezistence
Likvidace parazitů
- Trichinella spiralis
- helmint - infekce přes GIT
- T-buňěčná imunita + eosinofily
- Plasmodium yoelli - prvok
- malarie (infikuje ERY)
- likvidace: B-b / T-b / MF
Likvidace nádorů
B16F10 melanoma
- i.p. injekce - 21 dnů - diseminace na plicích
- likvidace: NK a MF
PYB6 sarcoma
- i.m. injekce - zde vývoj nádoru
Tier 2 - RIVM: Hostitelská rezistence
Likvidace parazitů
Dny ozařování UV-B vs počty T.spiralis
kultivovaných z infikovaných potkanů
Tier 2 - RIVM: Hostitelská rezistence
Likvidace nádorů
Metastázy B16F10 na plicích myši
Efekt cyklofosfamidu
-> Výskyt nádorů po aplikaci PYB6
Hodnocení imunotoxicity
Specifické testy
Autoimunita
Hypersensitivita
Autoimunita
Průkaz proti-jaderných protilátek (ANA)
- lidské buňky fixované na mikroskopickém skle
- přidání séra (pokud obsahuje ANA, naváží se ...)
Hypersensitivita
Kontaktní hypersensitivita
Kontaktní hypersensitivita
-průkaz DTH reakce
-> aplikace Ag na kůži
-> po delší době zarudnutí
,,DTH" test (delayed type hypersensitivity)
viz MEST - Mouse Ear Swelling Test
- Vyholení břicha, aplikace Ag /alergenu/
- po 10 dnech: Ag do jednoho ucha
(solvent do druhého & srovnání)
Hypersensitivita
Stimulace v lokálních uzlinách (myši)
Local Lymph Node (LLN) Assay
http://school.powow-consulting.com/sourisSchool.swf
opakovaná i.d. injekce látky (za uši) 5 dní
i.v. injekce 3H-Thy
5 h
usmrcení
izolace lokálních (krčních) uzlin
vyhodnocení hmotnost uzliny
+ proliferace buněk z uzliny in vitro
stanovení radioaktivity v uzlině
(proliferace T-buněk)
Hodnocení imunotoxicity
EXPERIMENTÁLNÍ DESIGN
Která část IS je zasažena?
Různé typy Ag
T-závislé př. SRBC
T-nezávislé DNP-Ficol (=dinitrofenyl-ficoll)
LPS
Exp. design:
- působení toxické látky
- kombinace různých Ag
-> reakce různých složek IS
-> poznání, které složky IS
jsou ovlivněny xenobiotikem
- vyhodnocení
-> reakce různých složek IS
CCl4 ­ selektivní toxicita pro T-buňky
Casein ­ toxicita pro T-buňky a Makrofagy
TCDD ­ toxicita zejména pro B-buňky
In vitro varianty pro studium vlivu xenobiotik na buňky
- separace jednotlivých typů buněk ze sleziny
- oddělené expozice buněk
- rekonstituce různých buněk & spojení dohromady
- odpověď na podávaný Ag
Výsledky
- srovnání různých xenobiotik
- posouzení vlivu na jednotlivé typy buněk
1) Homogenát buněk ze
sleziny:
(kontrolní / exponované zvíře)
2) oddělení makrofágů
(adherence na povrch)
3) neadherující buňky
(T- a B-lymfocyty)
- rozdělení vzorku na 2 části
-  lyza T-buněk
-  lyza B-buněk
4) oddělené expozice
cizorodé látce
5a) toxicita pro jednotlivé
typy buněk
5b) spojení buněk po expozici
a provedení plakového testu
(funkce)
Expozice B- a T-buněk in vitro (TCDD vs VH - kontrola)
-> spojení a sledování produkce IgM