Dědičné změny v genech, genetické názvosloví, fenotypy nejčastěji používané v bakteriální genetice . Dědičné změny v genech •jsou způsobeny mutací, rekombinací nebo transpozicí •(gen: informační a funkční genetická jednotka obsahující genetickou informaci o primární struktuře buď funkční molekuly translačního produktu (proteinu), nebo funkční molekuly produktů transkripce (tRNA, rRNA, snRNA – malá jaderná, nepodléhajících translaci) Definice mutace •Dědičná změna genotypu, jejíž molekulární podstatou je nukleotidová substituce, delece nebo inserce. •(Genotyp: genetická konstituce organismu representovaná souborem alel specificky uspořádaných v jeho genomu) •(Fenotyp: soubor znaků, kterými se v daném prostředí projevuje genotyp organismu) •(Genom: Všechny molekuly DNA živé soustavy, které se vyznačují replikací a dědí se na potomstvo) Nukleotidová substituce •je výměna nukleotidů v jednořetězcových NK nebo výměna nukleotidových párů v dvouřetězcových NK. •Probíhá transicí (výměna purinu za purin, pyrimidinu za pyrimidin) •nebo transverzí (výměna purinu za pyrimidin a naopak). Delece a inserce •Je ztráta jednoho nebo více nukleotidů v nukleotidové sekvenci nebo •vložení jednoho nebo více nukleotidů do nukleotidové sekvence. •Inserční mutace bývají způsobeny insercí mobilního genetické elementu, •rekombinacemi mezi IS elementy vznikají inverzní mutace a delece Mutace mohou být •Spontánní (bez pozorovatelného vlivu mutagenu) •Indukované (vyvolané mutagenem např. fyzikálním, chemickým) Základem schopnosti genů mutovat (mutability) •jsou chemické vlastnosti bazí, v důsledku kterých se mohou během replikace vytvářet chybné páry bazí (odchylují se od Watsonových-Crickových párů) •Tautomerní změny bazí (A se páruje s C místo s T, v dalším replikačním cyklu se C páruje s G a pár AT je nahrazen párem GC) Na celkový počet správných nukleotidových párů •připadá podíl asi 10-4 až 10-5 chybných párů s tautomerními bázemi. •Vzhledem k nízkým hodnotám rychlosti spontánní mutace tj. 10-9 až 10-10 se předpokládá, že chybné páry se odstraňují opravnými mechanismy, •takže pravděpodobnost spontánní mutace se sníží na uvedené hodnoty 10-9 až 10-10 na nukleotid a replikační cyklus. Mutační rychlost •Je pravděpodobnost, se kterou dojde k mutaci •Záleží na počtu genů, které odpovídají za daný fenotyp - pro fenotyp His- je 1000x vyšší (11 genů) než pro StrR (1 gen) •Extrémně vysoká mutační rychlost na určitý fenotyp (vyšší než 10-6) obvykle znamená ztrátu plasmidu, profága nebo inverzi (hot spot místa s určitými sekvencemi, hypermutabilní) Mutační rychlost •Se stanovuje fluktuačním testem •Kultura buněk se připraví ve větším množství •Rozdělí se do většího počtu frakcí (zkumavek) •Ponechá se růst do určitého počtu buněk •A v každé frakci se sleduje počet mutantů Mutační rychlost •a=(-lnpo)/N, kde •a…mutační rychlost, •po…frakce kultur, ve kterých se neobjevily mutace, •N…počet buněk v kultuře •(nedá se snadno stanovit) Frekvence mutací •Je velmi nepřesná hodnota, ale velmi snadno stanovitelná •Rovná se počtu mutantů/ celkový počet buněk •Je používána jako první přiblížení Fluktuační test bere v úvahu, v které generaci došlo k mutaci na rozdíl od frekvence mutací . •Obr. od č. 13 do konce převzato ze Snyder a Chapmann 1997 Typy mutací – obr. •Bodová (záměna nukleotidu a tím i AK) •Posunová (změna čtecího rámce delecí nebo insercí 1 nebo 2 nukleotidů)) •Nesmyslná (vznikne nesmyslný kodon) •Inverse, duplikace, delece (rekombinace mezi IS sekvencemi) •Supresorová mutace (mutace v antikodonu tRNA, páruje se s nesmyslným kodonem) Vznik bodové mutace Vznik nesmyslné mutace Vznik inversní mutace Vznik posunové mutace Vznik duplikace a delece Supresorová mutace Geny se mutacemi mění •Na různé mutantní formy •Variace genu se nazývají alely Většina mutací •je škodlivá tj. inaktivuje genový produkt příp. se zastavuje nebo snižuje jeho syntéza. •Alely, které těmito mutacemi vznikají, jsou obvykle recesivní •Alela recesivní koduje nefunkční protein •Alela standardní, která převažuje v přírodní populaci, je většinou dominantní tj. koduje funkční polypeptid nebo se přepisuje do rRNA nebo tRNA Mutace letální a neúplné •Mutace letální jsou neslučitelné s životem buňky •Neúplné mutace (leaky) znamená, že si genový produkt ponechává určitou aktivitu Co do směru účinku mutací je nutno rozeznávat •Původní mutaci tj. mutaci, kterou se standardní alela mění v mutantní •Zpětnou mutaci neboli reverzi tj. mutaci, kterou se mutantní alela mění částečně nebo úplně ve standardní alelu •Pravá reverze vede k obnovení původní nukleotidové sekvence Organismus nesoucí mutantní alelu •Se nazývá mutant •Mutantní alela se obvykle projeví ve fenotypu •Fenotyp: soubor znaků, kterými se v daném prostředí projevuje genotyp organismu. •(Genotyp: genetická konstituce organismu representovaná souborem alel specificky uspořádaných v jeho genomu). Projev •standardní alely ve fenotypu se označuje jako fenotyp standardní • mutantní alely ve fenotypu se označuje jako fenotyp mutantní Určité mutantní alely •se ve fenotypu neprojevují. •Jsou výsledkem tzv. tiché mutace •např. změna kodonu za jiný kodon pro tutéž AK nebo •změna nukleotidu, při které dochází ke změně smyslu kodonu, neprojeví se však ve funkci kódovaného polypeptidu. Genetické názvosloví •Označování genů •Označování mutací •Označování mutantních organismů •Označování a příklady genotypů některých kmenů E.coli •Označování fenotypů Označování genů •his kurzíva, 3 malá latinská písmena, zkráceně označují funkci genového produktu, je-li znám (enzym nezbytný pro biosyntézu histidinu) •Enzym se stejnou funkcí může být kódován více geny - hisA, hisB atd. velká písmena označují jednotlivé geny . Lze připsat znaménko minus (-) nebo slovo mutace např. hisA-, hisA mutace . Podobně označení hisA+ označuje standardní formu genu hisA, který koduje funkční genový produkt Označování bodových mutací •V jediném genu může dojít ke stovkám mutací, označují se číslem •hisA4 … gen hisA s mutací č. 4 tj. his A4 alela genu •Může se psát také hisA4- nebo hisA4 mutace (mutace vede k inaktivaci genového produktu) •hisA4+ … znamená standardní alelu genu, která koduje funkční genový produkt (může vzniknout reverzní mutací) Označování delečních mutací •Před názvem genu a číslem alely se používá řecké písmeno Δ (delta). Uvádí se poslední známý gen, který byl deletován. •Δ(lac-proAB)195… delece č.195 oblasti DNA od genu lac až po geny proAB chromosomu E. coli (rozsah delece je znám) •Δhis8… delece celého his operonu E. coli, včetně delece sousedních genů, celkový rozsah delece není přesně znám (tak tomu u delecí bývá) •(když známe sekvenci genomu, tak známe i přesný rozsah delece) Označování inserčních mutací •Uvede se název genu, dvě dvojtečky a označení inserčního elementu např. •galK::Tn5 … inserce transpozonu Tn5 do genu galK •Více insercí do stejného genu označíme čísly např. •galK35::Tn5 … inserce č.35 transpozonu Tn5 do genu galK •Je-li inserce provedena technikami rekombinantní DNA lze použít symbol Ω (omega) •pBR322 Ω ::KanR…inserce genu pro kanamycin rezistenci do plasmidu pBR322 •Inserce cizorodé DNA v plasmidu lze označit …. pUC19::HRS60, pUC19::dim1 Označování inverzních mutací •Mutace s geny v opačné orientaci než standardní se označují velkými písmeny IN a závorkou, v níž jsou uvedeny geny, u nichž došlo k inverzi a číslo mutace např. •IN(purB-trpA)3 … inverse č.3, u níž invertovaná oblast začíná v blíže neidentifikovaném místě genu purB a končí v blíže neidentifikovaném místě genu trpA Označování mutantních organismů •Escherichia coli AB2497, Escherichia coli AB2498, Escherichia coli JRS154, Salmonella typhimurium LT2-18, Salmonella typhimurium LB5000 •Rodové a druhové jméno, zkratka autora •Nesmí odrážet fenotyp ani mít vztah k genu, o němž předpokládáme, že je mutován •(aby se zabránilo nedorozumění v případu přenosu genu do jiného kmene) •Mutantní organismus vznikl mutací ze standardního organismu (wild type, w.t.,divoký typ) Mutantní kmeny •Odvozené z kmene Escherichia coli K-12 •Přes 100 kmenů používaných v genetice •Barbara J. Bachmann, Pedigree of some mutant strains of Escherichia coli K-12, Bacteriol. Rev. 36 (4), 525-557, 1972 •Kmeny Y (Ymel), C (C600), AB, W,… Sbírkové organismy se označují písmeny a číslem sbírky •CCM (Bifidobacterium sp.CCM3761) •CCDM (Lactobacillus casei CCDM211) •DSM (Clostridium tyrobutyricum DSM2637T) •T označuje kmen typový •Bifidobacterium longum ssp. infantis ATCC…. •sci.muni.cz/ccm Kmen (strain) •Jsou buňky určitého druhu a stejného původu •(např. sbírkový kmen B. pseudocatenulatum CCM3761, kmen izolovaný z GIT Lactobacillus paracasei RL13, kmen izolovaný z přírody) •! Izoláty mohou obsahovat více druhů •Mohou představovat standardní organismy (w.t.), z nichž byly odvozeny mutanti – např. E.coli K12 w.t. Označování genotypů bakteriálních kmenů •E. coli K-12 (λ)F+ (wild type) (kmen divokého typu) •E.coli Ymel (mel1, supE57, supF58) •E. coli C (wild type,w.t.) •E. coli C600 (supE44 hsdRthi-1thr-1 leuB6lacY1tonA21) •E. coli CSH18 (supE44thiΔ(lac-pro) F´(ProAB+ lacZ-)) Supresorové tRNA u E. coli Příklady genotypů kmenů E.coli •Používaných v genových manipulacích Názvy genů E.coli K-12 •Najdeme v publikované genetické mapě •B.J. Bachman, Linkage Map of Escherichia coli K-12, Edition 8, Microbiol. Rev. 54(2), 130-197, 1990 Fenotypy se označují •Třemi písmeny a první písmeno je velké, nepíšou se kurzívou •Např. His-, His+, RifR, RifS •Např. His- označuje fenotyp s mutovaným genem his, buňky nerostou na půdě bez aminokyseliny histidinu, protože ho nejsou schopny syntetizovat •RifR označuje rezistenci k antibiotiku rifampicinu, vzniká mutací v genu rpoB, jež kóduje subjednotku RNA polymerázy Fenotypy používané v bakteriální genetice •Nejčastěji takové, co se snadno rozpoznají •Užitečné jsou auxotrofní mutanty •Podmíněně letální mutanty •Resistentní mutanty •Charakterizace kolonií Auxotrofní mutanty, auxotrofy •Neschopné syntetizovat nějakou aminokyselinu, vitamin, růstový faktor nebo využívat nějakou látku např. cukr •Ten musí být přidán do media •His-, Bio-, Mal- mutanty nesyntetizují histidin, biotin, nevyužívají maltózu jako zdroj energie •Izolují se pomocí bakteriologického razítka •(porovnáním růstu za selektivních a neselektivních podmínek) •(prototrofní baktérie rostou na syntetickém médiu) Izolace auxotrofních mutantů Podmíněně letální mutanty •Teplotně nebo na chlad sensitivní mutanty (protein funkční za permisivní teploty např.30ºC, nefukční za nepermisivní teploty např. 42ºC) •(Za vyšší teploty může potein částečně nebo úplně denaturovat, být přístupný proteázám, nevytvářet komplex apod.) Isolace teplotně sensitivních mutantů pomocí bakteriologického razítka Mutanty nesoucí nesmyslné mutace •Jsou rovněž podmíněně letální •Nesou mutace, které vedou ke změně kodonu na jeden ze tří nesmyslných kodonů (UAA, UAG, UGA – amber, ochre, opál) •V místě vzniku nesmyslného kodonu se zastaví translace genu, což vede ke vzniku neúplného proteinu •Syntéza proteinu se může dokončit, když má buňka supresor (supresorovou mutaci) Rezistentní mutanty •Odolné vůči látce, která buňku usmrcuje nebo inhibuje její růst •Vysévají se na misku s touto látkou •Např. mutanty rezistentní na antibiotikum •Mutanty rezistentní k bakteriofágům Příklady rezistentních mutací Buňky rezistentní k fágové infekci Užitečným fenotypem je •Charakterizace kolonií narostlých na agarových miskách •Zabarvení kolonií (mutant tvoří bezbarvé kolonie) •Velikost a tvar kolonie