Konjugace . Pozoruhodnou vlastností mnoha plasmidů •je jejich schopnost přenášet se z jedné buňky do druhé procesem, který nazýváme konjugace. •Donorová buňka F+ je buňka, která obsahuje plasmid, který se přenáší •Recipientní buňka F- je buňka, do které se plasmid přenáší •Podobně rozlišujeme donorový a recipientní kmen nebo donorovou a recipientní kulturu. •Recipientní buňka, která získala DNA konjugací se nazývá transkonjugant nebo konjugant. Jakákoliv baktérie nesoucí konjugativní plasmid •je potenciální donor plasmidu, •protože může dojít k jeho přenosu do dalších baktérií, které plasmid neobsahují. •Jakékoliv baktérie, co nenesou plasmid •jsou potencionálním recipientem plasmidu •Donory plasmidu bývají označovány jako male. Konjugující buňky •Bývají označovány jako rodičovské Konjugativní plasmidy jsou nejvíce prostudovány •U G- baktérií rodu Escherichia a Pseudomonas •U G+ baktérií rodu Enterococcus, Streptococcus, Bacillus, Staphylococcus a Streptomyces •Konjugativní (nebo mobilizovatelné) plasmidy pravděpodobně mají všechny baktérie •Přenášejí se mezi buňkami jednoho druhu Plasmidy promiskuitní •Se mohou přenášet mezi nepříbuznými druhy •Např. plasmid pKM101 (IncN), plasmid RP4 (IncP) •Plasmidy IncP skupiny se mohou přenášet do všech G- baktérií a s nízkou frekvencí i do G+ baktérií (Streptomyces) •Byl popsán i plasmid přenášející se z E. coli do kvasinek. •Tyto přenosy jsou významné evolučně. Velikost konjugativních plasmidů E. coli •Konjugativní plasmidy bývají velké – nesou hodně genů, nezbytných pro konjugaci. •Nazývají se tra geny (podmiňují přenos DNA z jedné buňky do druhé) •U plasmidu pKM101 je známo 11 genů tra Genetická a fyzikální mapa konjugativního plasmidu pKM101 (Snyder 1997) Pro všechny konjugativní plasmidy je společné to •že jsou na nich umístěny geny, které podmiňují přenos plasmidu z donorové buňky do recipientní (transferové tra geny) •Ovlivňují fenotyp buňky tím, že kódují syntézu vláken označovaných jako pilusy •Prostřednictvím těchto vláken se donorové buňky spojují s recipientními Konjugační proces začíná •interakcí pilusů donorové buňky se specifickými receptory proteinové povahy v povrchu recipientních buněk •Při této interakci dojde k těsnému přiblížení buněk a ke vzniku otvoru v donorové i recipientní buňce •Tímto otvorem přechází plasmid z donorové buňky do recipientní a to tak, že současně dochází k replikaci přenášeného plasmidu, během níž 1 kopie plasmidu zůstává v donorové buňce a druhá přechází do recipientní. Geny tra kódují mj. •syntézu proteinu pilinu, •z něhož jsou tvořeny pilusy •Na 1 buňku E. coli připadá asi 1-10 pilusů •Vnitřek pilusu tvoří dutina o průměru asi 2.5 až 3 nm Různá morfologie pilusů •Pilus kódovaný plasmidem pKM101 je dlouhý a rigidní, •pilus F plasmidu je dlouhý a flexibilní, •pilus plasmidu RP4 je krátký a rigidní. •Některé pili slouží pro adsorpci fágů na povrch buňky (F specifické fágy, male specifické fágy) Pro konjugační proces je nezbytná •Ori T (transfer) sekvence na DNA konjugativního plasmidu •(!sekvence odlišná od oriV, počátku replikace) Ori T sekvence a začátek přenosu •Je rozpoznávána endonukleázou (produkt tra genu) •oriT plasmidu F je menší než 300 bp, obsahuje invertované repetice a je bohatá na AT •Endonukleáza rozštěpí DNA v jednom řetězci •V tomto místě začíná působit helikáza (další produkt tra genu), která rozmotává řetězce. •Jeden řetězec plasmidové DNA se 5´koncem začne přenášet do recipientní buňky •Protože se tento konec uvolňuje po naštěpení endonukleázou v místě ori vždy na stejném místě, je počátek, kterým vstupuje řetězec plasmidové DNA do recipientní buňky vždy stejný. Mechanismus přenosu DNA během konjugace. Přenos 1 řetězce z donorové buňky do recipientní (Snyder 1997) Během konjugace dochází k replikaci plasmidu •Nepřenesený řetězec v donorové buňce je matricí pro syntézu komplementárního řetězce, který se syntetizuje kontinuálně. •Podle řetězce vytěsňovaného z kružnice do recipientní buňky se syntetizuje diskontinuálně nové vlákno DNA, •jeho replikace je katalyzována DNA-polymerázou III recipientní buňky. •V recipientní buňce se potom další replikací vytvoří více kopií téhož plasmidu. Replikace konjugativních plasmidů během konjugace •.Obr. Rosypal Mnoho plasmidů kóduje •Vlastní primázu •Primáza se syntetizuje v donorové buňce a •přenáší se spolu s DNA do buňky recipientní. •Tak je zabezpečeno, že ihned po přenosu začne syntéza komplementárního vlákna DNA •Tím, že plasmidy kódují vlastní primázu, se rozšiřuje jejich rozmezí hostitele, protože některé buněčné primázy mohou být odlišné od plasmidových Transferové geny kódují •Nukleázu (provede zlom v 1 řetězci DNA) •Helikázu (separuje oba řetězce) •Primázu (nezbytnou pro syntézu RNA primeru pro syntézu komplementární DNA) •Další produkty, které se podílejí na přenosu DNA z buňky na buňku •Např. proteiny napomáhající přiblížení konců řetězců v recipientní buňce, což je nezbytné pro spojení obou řetězců do kružnicové molekuly. Výsledkem konjugace •Jsou 2 buňky – donorová a recipientní (konjugant, transkonjugant), které obě obsahují plasmid Účinnost přenosu •Za optimálních podmínek se některé plasmidy mohou přenášet do buněk se 100% účinností (po každém kontaktu) •U jiných přirozeně se vyskytujících plasmidů dochází k expresi tra genů a k přenosu jen po krátkou dobu Byly popsány geny •eex (entry exclusion) •Zabraňují vstupu plasmidů se stejnými funkcemi Tra do recipientní buňky U konjugativních plasmidů G+ baktérií •Se netvoří pili •Vstup plasmidů do buňky je umožněn tzv. feromony Produkty genů tra •Mohou působit i na jiné plasmidy v buňce Mobilizovatelné plasmidy •Těmto plasmidům chybí některé geny tra (asi 10 genů) nutných pro vznik pilusu •Pro svůj přenos můžou využívat pilusu kódovaného konjugativním plasmidem, jež se nachází ve stejné buňce •plasmid musí mít pro mobilizaci vlastní oriT místo Plasmidy izolované z přírody •Mívají ori T místo a geny mob, jež jsou analogické některým genů tra •mob geny např. kódují •nukleázu, která štěpí oriT místo •helikázu, která odděluje řetězce •Některé produkty genů mob rozšiřují rozmezí hostitele (primáza) Molekulární mechanismus mobilizace •Buňka obsahuje dva plasmidy: • plasmid F (tra geny) a plasmid mobilizovatelný (mob geny) •Na obr. je znázorněn přenos mobilizovatelného plasmidu Schéma přenosu mobilizovatelného plasmidu. Mechanismus mobilizace. Když jeden plasmid mobilizuje druhý •Obvykle dochází i k jeho přenosu •Recipientní buňka získá oba plasmidy Uměle byly zkonstruovány •Mobilizovatelné plasmidy, •které obsahují pouze oriT místo •Využívají se v molekulární biotechnologii •Jsou menší a proto vhodnější jako vektory pro přenos cizorodé DNA •Klonované geny jsou spolu s mobilizovatelným plasmidem přenášeny do recipientních buněk Přenos bakteriálního chromosomu plasmidy •Plasmidy mohou přenášet i DNA svého bakteriálního hostitele. •Nezbytné je, aby došlo k integraci plasmidu do bakteriálního chromosomu. K integraci plasmidu do chromosomu •dochází homologní rekombinací v místě homologních sekvencí (IS sekvence) •IS sekvence musí být lokalizovány na plasmidu i v bakteriální DNA •Takovéto kmeny s integrovaným plasmidem se nazývají Hfr kmeny (high frequency of recombination) Integrace F plasmidu do chromosomu homologní rekombinací. Vznik Hfr buňky. Chromosom E. coli •obsahuje 20 míst s IS sekvencemi, v nichž se může plasmid integrovat, má-li homologní IS sekvence Konjugativní plasmidy v integrovaném stavu •Přenášejí chromosomální DNA •Integrovaný plasmid exprimuje tra geny, takže dochází k tvorbě pilusů, ke kontaktu donorové buňky s recipientní, ke štěpení oriT místa a k přenosu DNA řetězce Nejprve se přenáší •Část plasmidové DNA a pak následuje •přenos chromosomální DNA. •Geny, které jsou lokalizovány u 5´konce oriT plasmidu jsou do buněk přenášeny jako první •Přenos celého chromosomu a plasmidu trvá při 37ºC asi 100 minut. •Výsledkem je diploidní buňka Většinou však dojde •k přerušení spojení buněk •nebo ke zlomení DNA řetězce. •Proto v recipientní buňce nemůže dojít k recirkularizaci DNA řetězce •Přenesená DNA však může rekombinovat s chromosomem recipientní buňky (obecná rekombinace) •Při této rekombinaci jde o interakci mezi lineární dsDNA z donorové buňky a kružnicovou dsDNA buňky recipientní Přenos chromosomální DNA integrovaným plasmidem Jesliže se donorová a recipientní buňka liší genotypem •vzniknou rekombinanty, které můžeme detekovat Obecná rekombinace v merozygotě (Rosypal 1981) K obecné (homologní) rekombinaci dochází při •konjugaci •transdukci •transformaci Obecná rekombinace (Rosypal 2003) •Kromě mutace se na změnách genetické informace podílí rekombinace •Obecná rekombinace je proces, kterým vzniká nová kombinace nukleotidových sekvencí, která je způsobena crossing-overem Jako crossing-over se označuje •Výměna nukleotidových sekvencí mezi dvěma homologními molekulami DNA •Výměna probíhá zlomem a znovuspojením •Zlom a znovuspojení představuje naštěpení dvou paralelních homologických polynukleotidových řetězců a křížové spojení fragmentů vzniklých tímto štěpením Organismus, jehož změněný genom je výsledkem rekombinace •Se označuje jako rekombinant (rekombinanta) Obecná (homologní) rekombinace může být •Intergenová tj. probíhající mezi geny homologických vazbových skupin nebo •Intragenová tj. probíhající mezi nukleotidovými sekvencemi alel téhož genu •(vazbová skupina: soubor genů, které se nacházejí na stejném genoforu) Obecná rekombinace probíhá •Při nízkých frekvencích u všech organismů a to při •tansformaci, transdukci a konjugaci baktérií, •mezi virovými genomy, kterými je infikována hostitelská buňka a •během meiózy eukaryotických buněk Místně specifická rekombinace •Je omezena na interakce virového genoforu s DNA chromosomů hostitelských buněk. •Při těchto interakcích dochází k integraci (začlenění do chromosomu hostitelské buňky) a excisi virových genoforů Popis Hollidayova modelu obecné rekombinace •Nejlépe propracován je u E.coli •Viz Obr.198 Rosypal Jednotlivé kroky modelu •1. Párování homologických molekul DNA - musí být v těsném kontaktu, musí být dostatečně homologické tj. s podobnou primární strukturou DNA, k rekombinaci dochází mezi paralelními DNA řetězci tj. mezi řetězci se stejnou orientací fosfodiesterových vazeb •2. Vytvoření zlomů v paralelních řetězcích – vlivem endonukleáz •3. Vzájemné prostupování řetězců, jejich výměna a asimilace - jeden řetězec obou ds molekul DNA se svým zlomeným koncem spojí s paralelním řetězcem druhé dsDNA. Spojení obou molekul dsDNA formou překřížených asimilovaných homologických DNA řetězců je tzv. Hollidayův spoj (chi-struktura) Hollidayův model Pokr. •4.Posun Hollidayova spoje – k posunu dochází podél dvoušroubovice, vlivem otáčení DNA. Dochází k postupnému posunování překřížených DNA řetězců při rekombinaci •5.Roztažení Hollidayova spoje. V konečné fázi posunu se spoj roztáhne do určitého tvaru •6. Zrušení Hollidayova spoje (zrušení chi-struktury) - po naštěpení endonukleázami za vzniku produktů, které lze prokázat jako výsledek rekombinace. •Výsledné molekuly DNA jsou charakteristické heteroduplexními oblastmi, ve kterých protilehlé úseky DNA nejsou zcela komplementární, jestliže pocházejí z různých alel téhož genu Hollidayův model Hollidayův model Heteroduplex je •Hybridní molekula DNA, která se vyznačuje neúplnou komplementaritou •Pouze některé molekuly se liší v kombinaci alel proti původní kombinaci •Tj. na jedné molekule DNA jsou kombinace alel Ab proti původní AB a na druhé aB proti původní ab. U baktérií dochází k rekombinaci •Běžně při konjugaci •Při této rekombinaci jde o interakci mezi lineární dsDNA z donorové buňky a kružnicovou dsDNA buňky recipientní (dvojitý c-o) •(Jednoduchým c-o se integruje konjugativní plasmid do chromosomu v místě IS elementů) Rekombinaci •Katalyzují enzymy (RecA protein) •Byly zjištěny i u eukaryálních organismů •Lze předpokládat, že eukaryální rekombinace se nebude lišit od bakteriální Obecná rekombinace u eukaryí •Má značný význam v prvním meiotickém dělení při segregaci chromosomů •Na každý homologní pár chromosomů připadá 1 rekombinace •Četnost rekombinace na chromosom v meiotickém jádře je podobná četnosti rekombinace v rámci konjugace baktérií U kvasinek i u ostatních organismů •Se v meiotické profázi uskutečňuje přechodně dvojitý c-o a to v tzv. horkých místech •Tato místa jsou štěpena nespecifickými nukleázami •U baktérií c-o probíhá na chi-sekvencích