Genetické mapování s využitím konjugace . Během konjugace •Nebývá do buňky přenesen celý plasmid s chromozomem a nedochází k recirkularizaci DNA řetězce •(vznikne merozygota) •Přenesená DNA však může rekombinovat s chromosomem recipientní buňky •Rekombinanty můžeme detekovat, jestliže se donorová a recipientní buňka liší genotypem Rekombinace v merozygotě (Rosypal 1981) Časová posloupnost přenosu •Geny, které jsou lokalizovány v místě integrace plasmidu •Jsou do buněk přenášeny jako první a s vyšší frekvencí než geny, které jsou od počátku chromosomu vzdálenější •Počátkem chromosomu zde rozumíme jeho konec, kterým po naštěpení jeho původně kružnicové formy vchází do recipientní buňky •Časová posloupnost se využívá při genetickém mapování Genetická mapa chromosomu E.coli K-12 •Se zakládá na údajích, které byly získány konjugačním přenosem z donorového kmene Hfr do recipientního kmene F-. •Přenášené geny se integrovaly c-o do chromosomu recipientní buňky v závislosti na vzdálenosti od počátku chromosomu do ní přeneseného. Přenos genů z buněk Hfr do buněk F- (Rosypal 2006) Zjednodušená genetická mapa chromosomu E.coli K-12 (Rosypal 2006) Nepřerušovaná konjugace •Proces konjugace se nechá proběhnout bez přerušení •Vytvoří se merozygoty s různě velkými chromosomovými segmenty, které do nich přešly z buněk Hfr •Merozygoty s kratšími segmenty se budou vyskytovat ve vyšší frekvenci než merozygoty s delšími segmenty •Z toho důvodu lze očekávat vyšší frekvenci přenosu pro geny, které jsou umístěny blíže počátku chromosomu Nepřerušovaná konjugace •Příklad nepřerušované konjugace •HfrH Leu+Pro+Lac+Gal+Trp+StrS X F- Leu-Pro-Lac-Gal-Trp-StrR •Frekvence jednotlivých rekombinantních typů = počet rekombinantů daného typu/počet buněk Hfr •Uvedené typy rekombinantů byly v těchto frekvencích: •Leu+StrR ve frekvenci 0,20 •Pro+StrR ve frekvenci 0,15 •Lac+StrR ve frekvenci 0,13 •Gal+StrR ve frekvenci 0,078 •Trp+StrR ve frekvenci 0,044 •Z toho plyne, že chromosom HfrH má následující pořadí genů: O-leu-pro-lac-gal-try Nepřerušovanou konjugací •Se zjistí pořadí genů na chromosomu Přerušovaná konjugace •Vychází z toho, že se v různých časových intervalech konjugující páry od sebe oddělí •Do recipientních buněk vstoupí různě velké fragmenty chromosomu •Čím delší bude tato doba od počátku konjugace, tím delší fragmenty (a více genů) vstoupí do recipientní buňky Jestliže se provede selekce transformantů pro geny, které již vstoupily do recipientních buněk •Lze stanovit dobu vstupu těchto genů do recipientních buněk •A odstupňovat tak vzdálenost mezi geny na chromosomu v časových jednotkách •Rekombinanti Thr+Leu+StrR se začínají objevovat u té směsi, kde bylo provedeno protřepání po 8,5 min. od začátku pokusu •To znamená, že geny thr a leu jsou vzdáleny 8,5 min. o začátku chromosomu Přerušovaná konjugace •Příklad přerušované konjugace •HfrH Thr+Leu+Thi+Lac+Gal+Mal+Xyl+StrS X •F- Thr-Leu-Thi-Lac-Gal-Mal-Xyl-StrR •F=počet rekombinantů daného typu/počet buněk Hfr •Uvedené typy rekombinantů se začínají objevovat po určité době: •Thr+Leu+StrR po 8,5 min., •Thr+Leu+Gal+StrR po 25 min. atd. V minutách přenosu chromosomu do recipientní buňky •Bylo možné určit vzdálenost mezi geny •vzdálenost je udávána časovými jednotkami Pomocí konjugace se zjistilo •Že chromosom E.coli K-12 je kruhový •K tomu byly využity různé Hfr kmeny •Plasmid se může včlenit na různých místech chromosomu •Potom se přenášejí různé geny Obr. Různé Hfr kmeny E.coli K-12 (Snyder 1997) Cirkulární chromosom E. coli (Snyder 1997) F´plasmidy •Chromosomální geny mohou být přenášeny také po inkorporaci do konjugativních plasmidů •Plasmid, který nese část chromosomální DNA se nazývá F´(F s čarou, F prime) •Vzniká homologní rekombinací nebo transpozicí Integrovaný F plasmid •Se z chromosomu vyčlení homologní rekombinací •c-o mezi původními homologními sekvencemi •c-o mezi jinými homologními sekvencemi Vznik F´plasmidu homologní rekombinací (Snyder 1997) Recipientní buňka s F´plasmidem •Je merodiploidní (částečně diploidní) •Je diploidní pro geny nesené F´plasmidem •v buňce jsou 2 replikony •(nemusí docházet k rekombinaci) Merodiploidní buňka Geny nesené F´plasmidem •Mohou být použity pro testy komplementace •V případě, že plasmid a chromosom nesou různé alely téhož genu Testy komplementace •Umožnily rozlišit dominantní a recesivní mutace např.regulátorového genu laktózového operonu •a mutace operátoru •umožňují zjistit, jestli jsou ovlivněny funkce v trans nebo v cis (na DNA) Laktosový operon (Rosypal 1981) Mutace regulátorového genu – 3 alely •i- konstitutivní alela (represor se neváže na operátor) •is superrepresní alela (represor se nastálo váže k operátoru) •i+ alela inducibilní (w.t.) Genotyp •i+ z+ y+ vedoucí k inducibilní syntéze β-galaktosidázy a permeázy •i- z+ y+ vedoucí ke konstitutivní syntéze β-galaktosidázy a permeázy •is z+y+ nesyntetizující β-galaktosidázu a permeázu ani inducibilně ani konstitutivně Z těchto genotypů lze získat heterogenoty s následujícími vlastnostmi •i+ z+ y+ / F ´ i- z+ y+ syntetizuje β-galaktosidázu a permeázu inducibilně •i- z+ y+ / F´ i- z+y+ syntetizuje β-galaktosidázu a permeázu konstitutivně •Δi z+ y+ / F´ i- z+y+ syntetizuje β-galaktosidázu a permeázu konstitutivně •is z+y+ / F´ i+ z+y+ nesyntetizuje β-galaktosidázu a permeázu ani inducibilně ani konstitutivně •is z+ y+ / F´ i- z+y+ nesyntetizuje β-galaktosidázu a permeázu ani inducibilně ani konstitutivně Z vlastností heterogenotů plyne •is je dominantní vzhledem k i+ a i- •i+ je dominantní vzhledem k i- Mutace operátoru •Oc konstitutivní mutace operátoru - nereaguje na represor •O+ standardní alela operátoru •Alela Oc vzniká ze standardní alely operátoru O+ Genotyp •i+ocz+y+ syntetizuje β-galaktosidázu a permeázu konstitutivně •i+o+z+y+ syntetizuje β-galaktosidázu a permeázu inducibilně Z těchto genotypů lze získat heterogenoty s následujícími vlastnostmi •i+o+z+y+/F´ i+ocz+y+ syntetizuje β-galaktosidázu a permeázu konstitutivně •iso+z+y+/F´ i+o+z+y+ nesyntetizuje β-galaktosidázu a permeázu ani inducibilně ani konstitutivně •iso+z+y+/F´ i+ocz+y+ syntetizuje β-galaktosidázu a permeázu konstitutivně Z vlastností heterogenotů plyne •oc alela je dominantní vzhledem k o+