Bakteriofágy . Bakteriofágy (fágy, bakteriální viry) rozlišujeme na •Virulentní: způsobují lyzi buněk •Mírné (temperované): způsobují buď lyzi •nebo se jejich DNA začlení do chromosomu buňky, což má za následek, •že buňka nelyzuje a infekci přežije Podle typu genomu patří většina bakteriofágů do těchto skupin •ds DNA viry (T4, P22 s permutovanými geny, T7 s nepermutovanými geny, lambda, P2, fi80 s kohezními konci, ) •ss DNA viry (M13, f1, Φ X174) •ds RNA viry •+ ss RNA viry (f2, MS2, Qβ) Bakteriofágy se klasifikují •Také do morfologických skupin Bakteriofág T4 (E.coli) •Je virulentní •Genom je tvořen lineární ds DNA o délce 160 kb •Místo C obsahuje hydroxymetylcytosin •Na DNA je lokalizováno 300 genů, 30 z nich zajišťuje poměrně rychlou replikaci fágové DNA v hostitelské buňce •Genetická mapa fága je kruhová (má cyklicky permutované geny tzn., že viriony mají různé pořadí genů) •Některé geny fága T4 obsahují introny Schéma virionu T4 (Rosypal 2003) Infekce buňky •Viriony se naadsorbují na povrch buňky •Pomocí proteinu v bičíkových hrotech se spojí se specifickým buněčným receptorem •Kontrakcí bičíku je umožněna injekce DNA do buňky Ihned po infekci •zastavuje fág syntézu hostitelské DNA, RNA a proteinů •Díky exprese genomu fága T4 . Exprese genomu fága T4 •Působením RNA-polymerázy hostitelské buňky dochází k transkripci genů rané fáze exprese (před replikací fágové DNA) – genů kódujících •enzymy pro rozklad DNA hostitelské buňky, •cytidylázu hydrolyzující volný dCTP, •enzymy pro syntézu HMC •a pro glukozylaci (glukosylací je DNA fága chráněna proti účinku restrikčních nukleáz v hostitelské buňce) •enzymy pro replikaci fágové DNA Po syntéze enzymů kódovaných geny rané fáze exprese •začne probíhat replikace DNA •V replikovaných molekulách jsou přepisovány geny pozdní fáze exprese za tvorby mRNA, •která je překládána do proteinů, jimiž jsou obalovány zreplikované molekuly fágové DNA •za tvorby virionů •Vlivem lysozymu dochází k lyzi hostitelských buněk a uvolnění virionů Exprese genomu bakteriofága T4 (Rosypal 2003) Bakteriofág T7 (E. coli) •Fág virulentní •Strategie exprese genomu je založena na logickém sledu 3 skupin genů, které se přepisují podle určitého pořadí. Jsou to Geny první skupiny •(geny brzké rané fáze exprese) – jsou přepisovány RNA polymerázou hostitelské buňky na nereplikované fágové DNA. •Jedním z těchto genů je i gen, který kóduje vlastní fágovou RNA polymerázu, • kterou jsou přepisovány geny druhé a třetí skupiny. Geny druhé skupiny •(geny pozdější rané fáze exprese) – zahrnují geny kódující enzymy pro rozklad DNA hostitelské buňky a pro replikaci fágové DNA. Geny třetí skupiny •(geny pozdní fáze exprese) – geny kódující proteiny kapsidů a lyzi buňky Exprese genomu fága T7 (Rosypal 2003) Specificita RNA polymerázy fága T7 vůči vlastním promotorům •byla využita při konstrukci klonovacích expresních vektorů. Fágy s jednořetězcovou (ss) DNA •Malé fágy E. coli •Fág Φ X174 má sférickou kapsidu •Fág M13, fág f1 jsou vláknité •Jsou tzv. male specifické, protože se adsorbují na pilusy kódované konjugativními plasmidy •Celý vláknitý fág je pohlcen buňkou a proteinový obal je oddělen od DNA během průchodu vnitřní cytoplasmatickou membránou •Po replikaci je DNA opět obalena proteinem během průchodu cytoplasmatickou membránou •Po vstupu ss DNA do buňky (+ řetězec) začíná syntéza komplementárního řetězce DNA (-řetězec), čímž vzniká ds DNA nazývaná replikativní forma (RF). Vláknitý fág M13 •A další fágy s ss DNA •Nemají fixní délku •Částice bývá tak dlouhá, jak dlouhá je její DNA •Cizí molekuly různé délky mohou být ve fágové DNA klonovány, aniž by došlo k porušení funkcí fága •Proto jsou tyto fágy používány jako klonovací vektory Bakteriální viry s pozitivní RNA (+ssRNA) •Např. viry MS2 a Qβ. •Genom obsahuje gen O pro obalový protein, gen R pro RNA-replikázu a gen P pro připojovací protein. •Po vstupu do buňky E. coli se genom nereplikuje •Protože je tvořen + RNA, působí jako mRNA, takže se na něj může připojit ribozom a to na místo, kde je lokalizován gen O pro obalový protein •Translací tohoto genu se uvolňuje vlásenka blokující původně překlad na genu R •Po uvolnění vlásenky je umožněn vstup ribosomu na gen R, takže se může tvořit RNA replikáza •Pak začne syntéza připojovacího proteinu na genu P RNA-replikáza •Katalyzuje replikaci pozitivní RNA na negativní a negativní na pozitivní •Na část molekul pozitivní RNA se nejprve připojí jedna molekula připojovacího proteinu a pak proteiny obalové za tvorby kompletních virionů •Syntéza RNA-replikázy je regulována koncentrací molekul obalových proteinů, při jejich kritické koncentraci se syntéza zastaví •RNA replikáza Qβ se využívá při amplifikacích in vitro Strategie replikace a exprese genomu RNA bakteriofágů (Rosypal 2003) Bakteriofágy •Mírné (temperované): způsobují buď lyzi •nebo se jejich DNA začlení do chromosomu buňky, což má za následek, •že buňka nelyzuje a infekci přežije Bakteriální buňka obsahující profága se označuje jako •Lyzogenní •Lyzogenie je stav bakteriální buňky, v němž obsahuje profága •Lyzogenizace je souhrn pochodů, které se rozvíjejí po infekci bakteriálních buněk mírným fágem a směřují k jejich přeměně na buňky lyzogenní Je-li buňka infikována mírným fágem •Fágový genom se v ní replikuje a proto buňka zlyzuje, jako kdyby byla infikována virulentním fágem nebo •Fágový genom přejde do stavu profága a buňka infekci fágem přežije. •Profágem se rozumí provirus ve formě fágového genomu. Lyzogenní buňky se liší od nelyzogenních •ve vlastnostech, které jsou podmíněny přítomností profága: •1. Schopnost syntetizovat viriony stejného typu jako ten, kterým byly lyzogenizovány •Profág se může z chromozomu baktérie uvolnit a začít se replikovat •Uvolnění profága z chromosomu baktérií lze indukovat fyzikálními nebo chemickými faktory (UV-záření, mitomycin C) •Při nízkých frekvencích probíhá náhodně spontánní lyze (bez pozorovatelného vlivu vnějších faktorů) Lyzogenní buňky se liší od nelyzogenních •2. Imunitou vůči infekci fágem, jehož genom je homologický s profágem. •Podstata této imunity spočívá v tom, •že profág kóduje syntézu imunitního represoru, •který specificky zastavuje syntézu proteinů potřebných k syntéze virionů fága, jež je s ním homologický nebo blízce příbuzný Příkladem mírného fága je fág •λ (E. coli)