Bakteriofágy a transdukce . Obecná transdukce •Souvisí s balením DNA do fágové hlavičky Fágová replikace •Má 1 cíl a to •Vytvořit co největší počet molekul v co nejkratší době •během replikace se syntetizují konkatemery a •je balena do fágových hlaviček z konkatemeru •Různým způsobem U fága lambda •Jsou na konkatemeru rozpoznávána •specifická cos místa (12 nukleotidů, konce molekul) •ta jsou štěpena speifickou nukleázou (termináza) •a DNA (48502 bp) je balena do fágových hlaviček •(účinně se balí se od 37 000 bp do 52 000 bp) Balení DNA fága lambda do hlavičky z konkatemeru (Snyder 1997) Virion s DNA (Snyder 1997) U fága T4 a dalších fágů •Je známo balení DNA do fágový hlaviček mechanismem plné hlavičky •Z dlouhých konkatemerů vstupuje do fágové hlavičky DNA tak dlouho, dokud hlavička není plná Genom fágů •je terminálně redundatní • je cyklicky permutovaný Terminální redundance a cyklická permutace u fága T4 (Snyder 1997) Balení DNA •začíná na konkatemeru ve specifickém místě PAC (packaging) •U různých fágů se vyznačuje různou specifitou •Toto místo má význam pro obecnou transdukci Transdukce •Znamená přenos bakteriální DNA z jedné buňky na druhou pomocí bakteriofága •Transdukující fág – fág schopný transdukce •Donorový kmen – kmen, ve kterém se fág původně replikoval •Recipientní kmen – kmen infikovaný transdukujícím fágem •Transduktanti – buňky, které získaly DNA z jiné buňky transdukcí Rozlišujeme •Obecnou transdukci – fágem může být z buňky na buňku přenášena jakákoliv oblast bakteriální DNA •Specializovanou transdukci – fágem jsou přenášeny pouze určité geny z bakteriálního genomu •Oba typy transdukujících částic vznikají zcela odlišným mechanismem Mechanismus obecné transdukce •Fág obvykle balí do hlaviček fágovou DNA, avšak někdy může omylem zabalit DNA hostitelské buňky (sekvence podobná PAC sekvenci, konec molekuly) Vlastnosti transdukujícího fága •Může infikovat bakteriální buňky •Po infekci se netvoří fágové potomstvo ani plaky •Přenesená DNA může rekombinovat s homologní sekvencí recipientní buňky za vzniku transduktanta Příklad obecné transdukce (Snyder 1997) Obecná transdukce •Je událost řídká •Transdukující fágy vyžadují, aby hostitelská DNA nebyla degradovaná a obsahovala vhodná pac místa •Dobrý transdukující fág je fág P1, protože má menší nároky na specifitu pac místa, po rozštěpení balí DNA od konce •Má široké rozmezí hostitele (transdukuje DNA z E. coli do mnoha G- baktérií) •Fág P22 je také dobrý transdukující fág. Z jednoho pac místa balí DNA do asi 5 fágových hlaviček. Proto jsou některé chromosomální geny transdukovány s větší frekvencí než jiné Charakteristika 2 obecně transdukujících fágů P1 a P22 (Snyder 1997) Fág T4 a fág λ •Nejsou dobře obecně transdukující fágy •Fág T4 po infekci degraduje hostitelskou DNA •Stává se transdukujícím až po vyblokování odpovídajících genů mutací •Pak balí do hlaviček hostitelskou DNA s vysokou frekvencí •Fág λ potřebuje pro účinné balení DNA do hlavičky 2 cos místa •vzdálená od sebe na délku fágového genomu (37až 52 kb) •a proto není dobrý obecně transdukující fág. Transdukující fágy •Byly izolovány u řady baktérií a použity při jejich genetické analýze •Nalezení obecně transdukujících fágů je náročné •Transdukce bývá nahrazována konjugací, transpozonovou mutagenezou, technikami rekombinantní DNA •zvláště u baktérií, které nejsou příliš charakterizované Do fágové hlavičky se může nabalit •Kromě chromosomální DNA •Plasmidová DNA (může se v buňce začít replikovat) •DNA nesoucí transposon (ten může transponovat do některého replikonu v buňce – chromosomu nebo plasmidu) •Tyto vlastnosti jsou důležité z hlediska evoluce DNA ve fágové hlavě •Je stabilnější než volná DNA •V prostředí může déle vydržet (je chráněná proteinovým obalem) Specializovaná transdukce •Souvisí s lyzogenií a týká se mírných fágů •Při této transdukci mohou být přenášeny pouze geny lokalizované v blízkosti profága (místa integrace fága) Vznik specializovaného transdukujícího fága •Transdukující fág vzniká velmi vzácně chybnou excisí profága z chromosomu •Transdukující fág nese jak bakteriální geny tak fágové geny Schéma vzniku specializovaného transdukujícího fága (Snyder 1997) U fága λ •Vznikají dva typy transdukujících fágových částic: •λdgal a λpbio •Částice jsou defektní •Vlastnosti transdukujících částic jsou determinovány chybějícími geny λ dgal •λdgal netvoří plaky •nemá geny hlavičky a bičíku •nemůže tvořit virové částice •Může infikovat bakteriální buňky •Nese gen pro utilizaci galaktózy Selekce λdgal •Se provádí v recipientních buňkách, které jsou Gal-. •Na miskách s galaktózou narostou Gal+ transduktanty po integraci fága λdgal do chromosomu λdgal •Může lyzogenizovat bakteriální buňky •Po indukci profága z takto vzniklých lyzogenních kmenů získáme HFT lyzáty (High frequency transduction), protože všechny fágy nesou gal geny •Fágy jsou defektní •Chybějící geny nahradí helper fág Indukce λdgal fága z dilysogenního kmene (Snyder 1997) λ pbio •tvoří plaky •bez helper fága však nemůže lysogenizovat hostitelské buňky •Nese bakteriální gen pro biosyntézu biotinu Specialisované transdukující fágy •Našly využití v mikrobiální genetice •Používají se ve speciálních aplikacích •Dnes byly nahrazeny mnohem jednoduššími technikami rekombinantní DNA Genetická analýza fágů •Klasická genetická analýza zahrnuje: •Izolaci mutantů se změněnou funkcí, kterou chceme studovat •Komplementaci s cílem zjistit, kolik genů kóduje změněné produkty •Křížení s cílem zjistit pořadí a vzdálenost genů Infekce sensitivních hostitelských buněk fágem •Je jednoduchá •Smíchají se bakteriální buňky s fágovými částicemi •K infekci dojde díky náhodným kolizím buňky s virionem •% infikovaných buněk závisí na koncentraci buněk a virusů •Když je každá buňka infikována 2 virovými částicemi, •může v buňkách docházet ke komplementaci nebo k rekombinaci Multiplicita infekce (MOI) •Vyjadřuje poměr počtu fágů k počtu buněk •Počet fágů stanovíme jako pfu/ml (plaque forming units) •Počet buněk stanovíme jako cfu/ml (colony forming units) •MOI vysoká – fágových částic je mnohem více než buněk (MOI 5) •MOI nízká – fágových částic je mnohem méně než buněk (MOI 0.5) •MOI určuje počet buněk infikovaných virusem. Řídí se statisticky Poissonovou distribucí. Křížení fágů •K infekci jsou použity současně 2 fágové mutanty s různými mutacemi (např. c-) •V buňce docházi k homologní rekombinaci mezi fágovými genomy •a k expresi genů obou mutantů Frekvence rekombinace •Poskytuje informaci o vzdálenosti mutací na DNA •Záleží na lokalizaci mutací •Čím blíže jsou na DNA, tím hůře mezi nimi dochází ke c-o a tudíž k rekombinaci •Frekvence rekombinace v křížení = počet rekombinantních fágů/počet všech fágů Rekombinace mezi virovými mutanty (Snyder 1997) Virusy, jimiž infikujeme buňku •Se nazývají rodičovské typy •Po rekombinaci získáme rekombinantní typy (rekombinanty) Frekvence rekombinace v % •Se nazývá mapová jednotka •Např. dávají-li 2 mutace frekvenci rekombinace 0,01 (1%), připadá 1 rekombinant na 100 překřížení. Vzdálenost mutací je 0.01x100 = 1 mapová jednotka •Mapová jednotka je pouze relativní hodnota. •Fyzicky představuje různou délku DNA. •Jsou-li mutace příliš vzdáleny, může mezi nimi docházet k dvojitým c-o, což snižuje detekovanou frekvenci rekombinace, protože 2 c-o vedou k obnově rodičovských typů Komplementačními testy •Se stanovují interakce mezi genovými produkty, jež jsou syntetizovány z různých částí DNA molekul v 1 buňce. •Komplementační test ukáže, zda 2 mutace inaktivují stejné nebo různé geny. •Jestliže mutace komplementují, jsou obvyle v různých genech a naopak. Komplementační test (Snyder 1997) Konstrukce genetické mapy fágů •Ukazuje pořadí a vzdálenost mutací v jednotlivých genech Genetická a fyzikální mapa fága L (Španová 1988)