Restrikce a modifikace DNA
.


Restrikčně modifikační systémy
•Umožňují rozlišit vlastní DNA od cizí DNA
•Ochraňují buňky před infekcí cizorodou DNA
•Restrikce = degradace
•Modifikace = ochrana před degradací
•Kmen restrikční specificity r má i odpovídající modifikační specificitu m, která chrání vlastní
DNA před degradací

Platí
•Chromosomální, plasmidová nebo fágová DNA pronikající do buněk s restrikční specificitou r
•jsou degradovány, pocházejí-li z buněk,
•které nemají odpovídající modifikační specificitu m
•Modifikace = metylace (A,C)

Restrikce a modifikace DNA byla zjištěna při množení fága lambda na různých hostitelích
•Lambda/K12 : E.coli K12 +,  E.coli C +
•Lambda/C     : E.coli K12 - , E.coli C  + (eop nižší než 104)
•Lambda/C/K12: E.coli K12 +, E.coli C +
• E.coli K12 má RM systém  X  E. coli C
•E.coli K12 rozlišuje vlastní DNA od cizí

Tři typy restrikčně modifikačních systémů
•I, II, III
•Lokus hsd (hostitelská specificita pro DNA)
•hsdR – gen pro restrikční endonukleázu
•hsdM – gen pro modifikační metylázu
•hsdS – gen pro subjednotku, která poskytuje přesnou specificitu předchozím enzymům

Kompletní lokus hsd R-M systému typu I (Hubáček a spol. 1992)



Restriktázy typu I
mají
•3 podjednotky pro restrikci
•2 nebo 3 podjednotky pro modifikaci
•Další  enzymové aktivity (ATPasa, topoizomeráza)
•Vyžadují kofaktory pro restrikci (Mg2+, ATP)
•Vyžadují kofaktory pro modifikaci (AdoMet, reakci stimulují Mg2+, ATP)

Restriktázy typu I
•Rozpoznávají asymetrická místa na DNA
•Štěpí náhodně, daleko od asymetrických rozpoznávacích míst

Restriktázy typu II
mají
•1 jednotka pro restrikci
•1 jednotka pro modifikaci
•Další  enzymové aktivity nemají
•Vyžadují kofaktory pro restrikci (jen Mg2+)
•Vyžadují kofaktory pro modifikaci (AdoMet)

Restriktázy typu II
•Rozpoznávají specifická symetrická místa
•Štěpí ve specifických symetrických rozpoznávacích místech

Restriktázy typu III mají
•2 podjednotky pro restrikci
•1 nebo 2 podjednotky pro modifikaci
•Další  enzymové aktivity nemají
•Vyžadují kofaktory pro restrikci (Mg2+, ATP)
•Vyžadují kofaktory pro modifikaci (AdoMet,  Mg2+)

Restriktázy typu III
•Rozpoznávají asymetrická místa na DNA
•Štěpí 25-27 bp od 3´konce asymetrických rozpoznávacích míst

Mcr/Mrr systémy mají
•několik podjednotek pro restrikci
•Není u nich modifikace
•Další  enzymové aktivity nemají
•Vyžadují kofaktory pro restrikci (Mg2+, GTP)

Mcr/Mrr
•McrA/McrBC rozpoznávají a štěpí DNA sekvence s metylovaným C
•Mrr/Mcf rozpoznávají a štěpí DNA sekvence s metylovaným  A a C

Restrikčně –modifikační systémy – souhrnná charakteristika jednotlivých typů (Hubáček a spol. 1992)



V technikách genových manipulacích
•Se využívají restrikční enzymy typu II