Transformace •Přirozená •indukovaná Při transformaci •Buňka přijímá volnou DNA ze svého prostředí •Volná DNA pochází z donorové buňky (donora) •DNA je přijímána recipientní buňkou (recipient) •Buňka selektovaná po transformaci je transformant Přirozená kompetence •Je stav, ve kterém jsou bakteriální buňky schopné přijímat volnou DNA •Baktérie schopné přijímat volnou DNA se nazývají kompetentní Přirozeně kompetentní baktérie •Patří do více rodů G+ a G- baktérií •(Bacillus subtilis a půdní baktérie, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorhoeae) Objevení transformace •jako mechanismu přenosu genetického materiálu •u baktérií Streptococcus pneumoniae •Tím se zároveň potvrdilo, že DNA je nositelkou genetické informace Streptococcus pneumoniae tvoří 2 druhy kolonií •Drsné, nepatogenní (typ R) •Hladké, patogenní (s polysacharidovou kapsulou, díky níž buňky přežívají v infikovaném hostiteli a usmrcují jej) (typ S) Griffithův experiment (Snyder 1997) V experimentu na myších bylo prokázáno •Že varem usmrcené patogenní baktérie přeměňují (transformují) nepatogenní baktérie na patogenní (byly izolovány z infikovaných myší) •Totéž bylo později provedeno in vitro ve zkumavce •Tak bylo zjištěno, že transformující látkou je DNA Kompetence •Schopnost bakteriálních buněk přijímat volnou DNA •Většina přirozeně se transformujících baktérií může přijímat DNA pouze v určité fázi růstového cyklu •Obvykle před dosažením stacionární fáze růstu Geny, jež se účastní vzniku kompetence •Jsou nejvíce prostudovány u B. subtilis •K navození kompetence dochází, když je •vysoká hustota buněk a •nedostatek živin v prostředí Stav kompetence je řízen •Quorum sensing systémem •Jedná se o dvojsložkový regulační systém závislý na sensoru: •1. senzorový protein, membránový, kináza (autokináza) (katalyzuje fosforylaci) •2. regulační protein – získává fosfátovou skupinu od sensorového proteinu – aktivuje transkripci nebo jiné funkce b. Proteiny, jež se účastní vzniku kompetence u Bacillus subtilis •ComP … sensorový protein v buněčné membráně. •Zachycuje informace o nedostatku živin a o •dostatečné hustotě buněk. •Protein se aktivuje se fosforylací • •ComA… protein, na který je přenášena fosfátová skupina z ComP proteinu. •Ve fosforylovaném stavu funguje jako transkripční aktivátor mnoha genů, •včetně operonu srfA, který je nezbytný pro vznik kompetence Regulace vývoje kompetence u Bacillus subtilis (Snyder 1997) Proteiny, jež se účastní vzniku kompetence •Feromony kompetence … peptidy, produkované během růstu B. subtilis •Ke vzniku kompetence jich musí být nasyntetizováno velké množství, čehož je dosaženo při vyšší koncentraci buněk •ComX…feromonový peptid, jež vzniká odštěpením z delšího polypeptidu. Umožňuje fosforylaci sensorového proteinu ComP (neznámým mechanismem) •ComQ …proteáza, která vyštěpuje feromonový peptid •Spo0K…permeáza. Je aktivována dalším peptidem kompetence, který signalizuje kritickou hustotu buněk Současně se vznikem kompetence •Začíná B. subtilis sporulovat •Při zahájení sporulace se využívá rovněž produktu genu spo0K Některé kompetentní baktérie •Přijímají pouze DNA vlastního druhu (např. Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzeae) •U Neisseria gonorhoeae byla zjištěna specifická sekvence dlouhá 10 – 12 bp nutná pro přenos DNA do buněk •Jiné kompetentní baktérie přijímají jakoukoliv DNA (např. Bacillus subtilis) Specifické sekvence nutné pro přenos cizorodé DNA do kompetentních buněk (Snyder 1997) Mechanismus •kterým různé genové produkty činí buňku permeabilní pro DNA není znám. •Některé proteiny se zřejmě vážou k DNA •Jiné působí na buněčnou membránu •A umožňují průnik DNA do buněk během transformace Mechanismus transformace •Je nejvíce prostudován u •Streptococcus pneumoniae a •Hemophilus influenzeae Mechanismus transformace u Streptococcus pneumoniae •ds DNA uvolněná lyzí donorových bakteriálních buněk •se váže na specifický receptor na povrchu recipientní buňky •Jeden řetězec navázané DNA je degradován nukleázou lokalizovanou na membráně •Druhý řetězec je transportován do buňky •Transportovaný DNA řetězec je inkorporován do homologní oblasti buněčné DNA Transformace Streptococcus pneumoniae (Snyder 1997) Transformace Haemophilus influenzea •ds DNA (velikosti 30 až 50 kb) se váže na membránový receptor na povrchu recipientní buňky •Do recipientní buňky vstoupí ds DNA ve formě transformasomů •Z transformasomu je uvolňován jeden řetězec DNA •Jednořetězcová DNA se účastní rekombinace a vzniku transformanta Transformace u Haemophilus influenzae (Snyder 1997) V obou případech •Se na povrch bakteriálních buněk váže pouze ds DNA •Pouze ds DNA se může účastnit transformace •V cytoplasmě recipientní buňky je lokalizován 1 řetězec DNA, který se účastní rekombinace s chromosomální DNA •Rekombinanty lze detekovat tehdy, když se donorové a recipientní buňky liší svým genotypem Přirozeně kompetentní bakteriální buňky •Jsou účinně transformovány pouze chromosomální DNA •Neplatí to pro plasmidovou nebo fágovou DNA (nemůžou se v buňce cirkularizovat a tudíž ani replikovat) •Použijeme-li dimery plasmidových a fágových DNA, umožníme jejich recirkularizaci (rekombinací), čímž získáme transformanty Význam přirozené kompetence pro buňku •1. DNA slouží jako zdroj C, N a energie •2. Buňky přijímají DNA z jiných buněk s cílem reparovat poškození vlastní DNA •3. Transformace umožňuje rekombinaci 2 individuí jednoho druhu a vznik nových kombinací genů. Nahrazuje sexuální reprodukci známou u vyšších organismů. •4. Výhoda např. u některých druhů Neisseria vede transformace ke zvýšení antigenní variability druhu. To umožňuje unikat imunitnímu systému hostitele. Proč jsou některé druhy baktérií přirozeně transformovatelné •Neznáme •Není vyloučeno, že většina baktérií je přirozeně transformovatelných – v nízkých frekvencích, které nejsme schopny detekovat •Umožnilo by to vysvětlit mutace, jež se zdají být řízené Uměle indukovaná transformace bakteriálních buněk •Se využívá v technikách genových manipulací •K navození stavu kompetence se používají chemická činidla (Ca2+ ionty) •Chemicky indukovaná transformace je málo účinná •Bývá transformováno malé % buněk (0.01%) – DNA používaná pro transformaci musí proto nést nějaký selekční marker Uměle kompetentní buňky •Můžou přijímat ds DNA, ss DNA, lineární či kruhové molekuly Transfekce •Zavedení virové DNA nebo RNA do buňky •Princip transfekce je stejný jako u transformace Elektrotransformace •Metoda pro zavedení cizorodé DNA do buněk •Směs kompetentních bakteriálních buněk (buňky promyté v glycerolu) a DNA je po velmi krátkou dobu (msec) vystavena silnému elektrickému poli (20kV/cm). •To vede ke vzniku pórů a průniku cizorodé DNA do buněk Elektrodukce •Je obdoba elektroporace, •Která probíhá v přírodě např. za bouřky •Bývá řazena - vedle konjugace, transdukce a přirozené transformace – •jako další způsob sexuální reprodukce u baktérií.