Definice genového inženýrství Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných či nových genů nebo přípravou nových (nepřirozených) kombinací genů a jejich zaváděním do genomu organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu a vytvářet tak geneticky modifikované (transgenní) organismy. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro (klonování genů a jejich úpravy). Pozn.: cílené změny genetické informace lze provádět také in vivo Genové manipulace, moderní (molekulární) biotechnologie Genové inženýrství (sylabus přednášky 2011) 1. Osnova přednášky, definice genového inženýrství a jeho stručná historie, studijní literatura.Mutageneze in vitro (metody založené na restrikčních místech, metody založené na mutagenních oligonukleotidech, kazetová mutageneze, využití modifikovaných tRNA) 2. Optimalizace exprese klonovaných genů (faktory ovlivňující expresi genů v cizích hostitelích; úroveň transkripce, translace, export proteinů) 3. Klonování genů v grampozitivních bakteriích 4. Klonování genů v kvasinkách 5. Klonování genů v rostlinách 6. Klonování genů v živočišných buňkách, vektory pro přenos genů do savčích buněk, selekční markery pro vyhledání klonů obsahujících cizorodou DNA 7. Vnášení genů do zárodečných buněk myší, příprava transgenních savců 8. Cílená exprese cizorodých genů v buňkách a tkáních vyšších organismů 9. Opravy dědičných defektů u zvířat metodami genového inženýrství 10. Genová terapie u člověka - základní principy 11. Příprava farmakologicky významných látek v prokaryotických a eukaryotických organismech. Využití metod rekombinantní DNA k přípravě vakcín a protilátek. Identifikace produktů rekombinatních genů. 12. Pravidla pro práci s geneticky modifikovanými organismy, zákon 78/2004 Sb., rizika GI Doporučená literatura • Old R.W., Primrose S.B., Principles of gene manipulation. An introduction to genetic engineering. Blackwell Science, 1995. 5. vydání. • Watson J.D. et al., Recombinant DNA, 2nd ed., W.H.Freeman, New York 1992. • Watson J.D. a kol. Rekombinantní DNA, krátký kurz. Academia Praha 1988. • Strachan T., Read A.P. Human Molecular Genetics, 3. Vydání. Garland Science, London 2004. • Glick B.R., Pasternak J.J. Molecular Biotechnology, 3. vydání, ASM Press, Washington 2003. • Reece R. Analysis of Genes and Genomes. Wiley 2004 • Primrose S.B.,Twyman R.M. Principles of gene manipulation and genomics. Blackwell Publ., 2006, 7. vydání. • Internetové zdroje, IS muni.cz Využití genového inženýrství Ve výzkumu: studium struktury, funkce a exprese genů (genomů) Praktické (Moderní biotechnologie): 1. Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu • vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier 2. Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících genů nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj. 3. Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů - vytváření geneticky modifikovaných n. transgenních organismů (GMO) • příprava mikroorganizmů pro biotechnologie, • zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat) • genové terapie Předpoklady pro cílené genetické manipulace • Identifikovat geny a stanovit jejich funkce • Izolovat geny a cíleně je in vitro (in vivo) pozměňovat • Přenést vhodným způsobem upravené geny do původních nebo nepříbuzných organismů a zajistit jejich expresi (heterologní expresní systémy) Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství Poznání základních procesů přenosu genetické informace 1970 - izolace prvního restrikčního enzymu 1972 - příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro 1973 - začátek klonování genů 1975 - Asilomarská konference, moratorium NIH (1976) 1976 - první pravidla práce s rekombinantní DNA 1977 - první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny 1977 - sekvenování DNA 1978 - příprava lidského inzulinu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně), založení Genentech zavedení technik mutageneze in vitro - proteinové inženýrství příprava transgenních organismů (bakterie, kvasinky,rostliny, živočichové) 1980 - genové terapie 1997 - klonování živočichů Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneza reverzní genetika*, genetika „naruby" klasická genetika DNA (genotyp) ' > fenotyp reverzní genetika * Reverzní genetika - „vypínání genů" navozování nulových mutací genů nebo potlačování jejich exprese (knokauty genů, transpozonová inzerční mutageneze, anti-sense RNA, RNAi) Mutageneze in vitro Mutace se vnášejí do vyizolované DNA (= in vitro) Typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: Výzkum: • Analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK • Objasnění funkce genů a regulačních oblastí Praxe: • Cílené změny aminokyselin v proteinech - příprava proteinů s novými vlastnostmi (proteinové inženýrství) • Příprava geneticky modifikovaných a transgenních organismů Nevýhody klasické mutageneze (chemické, fyzikální, biologické mutageneze) 1. V organizmu může být zmutován kterýkoliv gen 2. Frekvence mutací v žádaném genu může být nízká 3. Žádaný fenotyp může být výsledkem mutací v různých genech 4. Rekombinační analýzou nelze zjistit, zda mutace v genu vznikla substitucí jedné báze, nebo delecí či inzercí Mutageneze in vitro Mutageneze in vitro náhodná manipulace s restrikčními místy inzerce linkerů chemická mutageneza inkorporace chybných bazí vyhledání genu nebo funkčních oblastí na DNA mutace \\\ GEN cílená oligonukleotidová mutageneza (umístění do konkrétního místa) syntéza genů (kazetová mutageneza) záměny bazí nebo kodonů cílené změny struktury proteinů Obecná strategie při mutagenezi in vitro 1. Klonování genu (sekvence DNA) ur ené k mutagenezi 2. Vlastní proces mutageneze in vitro 3. Selekce klonů obsahujících mutované geny (sekvence) 4. Stanovení funkce mutovaných gen 5. Ověření charakteru vnesené mutace (stanovení sekvence) Stanovení sekvence pozměněného genu Test for function using genelic screen or selection Způsoby používané při mutagenezi in vitro 1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA 2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru) 3. Chemická mutageneze 4. Kazetová mutageneze 5. Metody založené na PCR 6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA Vytváření mutací v restrikčním místě Štěpení EcoRI DNA polymeráza + dNTP í Delece 4 bp Inzerce 4 bp Inzerční mutageneze pomocí linkerů k vyhledání funkčních oblastí transpozonu Soubor náhodně linearizovaných molekul Vložený linker inaktivuje různé geny Transposon AmpR DNase I Mn2+ ions molecules štěpení rekombinantní DNA na různých místech Introduce into 5. coli Test for transposition Připojení EcoRI-linkerů (= vložení inzerce inaktivující zasažený gen) Selekce klonů se ztrátou transpoziční aktivity, např. vyhledání genu pro transponázu (oblasti, která je pro její funkci nezbytná) Chemická mutageneze bisulfitem HírdlN Příprava ssDNA Plazmidová dsDNA Síngle-sfrflnded ONA NH, Urodí O X Bísulfile rť C — U —> T 1 1 1 G A A GC —> AT Urodí Připojení primeru Proti U je začleněn A Odstranění poškozeného vektoru Vložení inzertů do nového vektoru Knihovna klonů obsahujících mutované inzerty Působení bisulfitem Mixřure qF rTV-dlis-r! DNA polymeráza, dNTP, replikace Vyštěpení mutovaných inzertů (HindIII-EcoRI) Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů 1. Klonování sekvence (genu) do vhodného vektoru (M13, fágemid, fasmid), izolace jednořetězcové formy rekombinantní DNA 2. Příprava syntetického oligonukleotidů (mutagenního oligonukleotidů) nesoucího žádanou mutaci (jeho sekvence je komplementární ke klonované sekvenci vyjma místa, do něhož má být mutace vnesena) 3. Připojení (přihybridizování) mutagenního oligonukleotidu in vitro 4. Dosyntetizování druhého (komplementárního) řetězce DNA-polymerázou, spojení DNA-ligázou 5. Transformace buněk E. coli heteroduplexní molekulou DNA, selekce mutantních molekul (příp. selekce in vitro a transformace mutantními molekulami DNA) 6. Pomnožení mutantní molekuly DNA v E. coli, ověření mutace stanovením sekvence DNA Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů syntéza druhého řetězce DNA-polymerázou selekce klonů s mutací rekombinantní dsDNA (fragment DNA klonovaný ve vektoru) I O O příprava jednořetězcové formy rekombinantní molekuly DNA (rekombinantní ssDNA) mutagenní oligonukleotid obsahující mutaci hybridizační připojení mutagenního oligonukleotidu přenos do buněk E.coli a jejich replikace i rodičovský fenotyp stanovení fenotypového projevu mutace Substituce delece inzerce A -T A -C G -C Zvýšení výnosu mutant začlenením uracilu do templátové DNA Většina kolonií obsahuje mutantní plazmid Řetězec s mutací (bez U) se replikuje DNA klonovaná do M13 vektoru ung- (uracil-N-glykozidáza-) (rep-) duí- (dUTPáza-) - zvýšení koncentrace U Do templátové DNA je začleněn U Připojení mutagenního oligonukleotidu Replikace, ligace Řetězec standardního typu (templátový, mateřský) je degradován Ověření mutace stanovením sekvence DNA žádaná mutace Vyhledání mutantních klonů pomocí sondy - tou je značený mutagenní oligonukleotid Labeled probe Hybridizes at room * temperature to ^ - both mufanl and ✓llďtype DNA sonda Mutageneze pomocí mutantních oligonukleotidů ampr pBR322 Afl III tetr 2. selekce pomocí RE; cílová sekvence = GEN TETR BglII DNA - Polymeráza DNA - Ligáza ampr Afl III tetr Netransformuje 1 Afl NNACPuPyGTNN Bgl II NNAGATCTNN Připojení dvou primem 1. Mutantní deleční oligonukleotid 2. Selekční oligonukleotid Bgl II I ampr Bgl II ampr Deletovaný plazmid Bgl II Transformace E. coli tets Izolace DNA T Štěpení selekč i Štěpení selekční RE Afl III tets Transformace výsev na AMP vyhledání klonů TETs Syntéza genů postupným spojováním kratších oligonukleotidů DNA sequence or amino acid sequence Complementary ** syníhtllg oligonucleotides Heatol 90°C Slowly cool lo room temperature Intermediates DNA liga se W^^^B isolate double-stranded i^fflS DNA molecule Express recombinant prolein in £ coli Mutageneze pomocí kazet tvořených mutantními „doped" oligonukleotidy Mutageneze pomocí „doped" oligonukleotidů Oligonukleotid obsahující inosin pro zajištění párování s náhodnými nukleotidy/kodony kodony pro různé aminokyseliny Oligonukleotid obsahující dva náhodné kodony Arg Glu Ile T CGA GAA ATC -> CTT TAG *** Glu Met *** Glu Ala Val Ser Met nnC GAG ATG GAA GCG GTT AGC ATG <- III CTC TAC III CTT CGC CAA TC i Kazeta s dvěma náhodnými kodony AGCT GTAC XhoI SphI N = kterýkoliv ze 4 nukleotidů NTG/C = hydrofóbní aminokyseliny (fenylalanin, izoleucin, leucin, methionin a valin) > Alternativní způsob nasyntetizování druhého nukleotidu PCR Záměna helixu v represorovém proteinu mutagenezou in vitro (příklad kazetové mutageneze) Záměna aminokyselin v doméně represoru zodpovědné za rozpoznání operátoru P22 Výhody PCR • jednoduché provedení • možnost vytváření různého typu mutací • není nutná následná selekce pro zvýšení proporce mutant • nezávislost na RE místech • není vždy nutné následné klonování mutovaného genu do vektoru (po PCR je možný přenos amplikonu do buněk transformací) Vytváření náhodných = „error-prone" PCR mutací • využívají se DNA-polymerázy bez korektorské funkce (např. Taq-polymeráza) • reakční podmínky PCR lze změnit tak, aby se počet chyb zvýšil a aby každý amplifikační produkt obsahoval jednu mutaci (např. zvýšení Mg++ nebo přidání Mn++, koncentrace reakčních složek atp) • nevýhoda: převaha určitého typu mutace (např. transice, zatímco transverze nevznikají) Využití PCR k vytváření mutací in vitro Místo, do něhož má být vnesena mutace Primery 2 a 3 = mutagenní primery klonování Vnášení mutací pomocí PCR Vložená sekvence (extenze primem na jeho 5'konci) (extenze jsou vzájemně komplementární) --t-J í- T\"" PCR #" changes v? overlap extension T ————j- \ mutant AD d PCR -2 insertions ths nseríion can be / or-ger than the overlap ý 0V9r|ap extension CD \ product AD with insertion 5' end of 'c' matches here,,-' ax f 1 PCR #1* deletions ^ \ / d /PCR #2 Deletovaná sekvence (extenze jsou komplementární k sekvenci vedle místa delece) CD y overlap extension Amplifikace „produktivních" spojení pomocí primerů a a d \ inner segment deleted Náhrada části genu sekvencí z příbuzného genu Gen A Polymerase plus ligase + original vector ást genu B je nahrazena ástí genu A Konstrukce genu pro chimerickou protilátku Light chain lgG Y2b heavy chain V/ I CH2 domain Expression vector for Y1 heavy chain ^^1CH2 domain Make uracil-containing single-stranded DNA lgG Y1 Does not activate complement Sticky foot- Gene for heavy chain (Y2b isotype) Polymerase chain reaction ^ 400 bp — PCR primers Antibody with chimeric heavy chain Activates complement 1 Transform ung+ E. coli Isolate mutant DNA Coexpress in mammalian cells with light chain Těžký řetězec typu y2b zodpovídá za lyzu buněk závislou na komplementu Protilátka s t žkým řetězcem y1 tuto lyzu nenavozuje. Která oblast y2b za tuto vlastnost zodpovídá? Doména CH2 y2b Doména CH2 odpovídá za aktivaci komplementu pro lyzu bun k Chimerický těžký řetězec Inzerce abnormálních aminokyselin do proteinu supresí amber mutace in vitro s využitím chemicky modifikovaných tRNA Mutagenesis -> Vytvoření amber kodonu Transkripce in vitro TransIace in vitro Mutantní forma proteinu (lysozym aktivovaný světlem) Table 4.4 Nonsense Suppressors Employed to Generate Altered Proteins Suppressor A. přirozené Codons recognized Amino acid inserted Efficiency (%) References Sul (supD) UAG Serine 6-54 a, b Su2 isupE) UAG Glutamine 0.8-20 a, b SU2-S9 IsupE)- UAG Glutamine 32-60 c, h Su3 IsupF) UAG Tyrosine 11-100 a, b SuS (supG) UAA, UAG Lysine 0.2-2 6-30* a, b, h h Su6 {supP} UAG Leucine 30-100 a, e Su9 UGA Tryptophan 0.1-30 a,f B. Uměle připravené tRNA cuA UAG Phenylalanine 48-100 g UAG 83% Glutamic acid 8-100 h,i 15% Glutamine UAG Cysteine 17-51 g UAG Histidine 16-100 h,i tRNA qlvT UAG Proline 9-60 h,i tRNA&fA UAG Lysine 9-29 h,i tRNA UAG Alanine 8-S3 h,i tRNA cuA UAG Glycine 39-67 h, i FTORI 26 UAG Arginine 4-28 4-47* i h Příklad: 160 variant genu pro lysozym s amber mutacemi na různých místech poskytlo v supresorových kmenech 2 000 variant lysozymu Vytváření mutací in vitro přímo na plazmidech (QuickChange) E. coli dam+ PCR Smíchání plazmidu s primery nesoucími mutaci, syntéza komplementárních řetězců I Štěpení I * DpnI r i Přenos do E. coli jako templát je využita dsDNA plazmidu po proběhnutí PCR se vytvoří dva komplementární řetězce nesoucí mutaci ve stejném místě, které jsou schopny se párovat za vzniku kružnice s posunutými zlomy po proběhnutí PCR jsou produkty štěpeny DpnI, která je schopná štěpit jen metylovanou DNA rodičovské molekuly DNA jsou metylovány, neboť plazmidy byly izolovány z dam+ kmenů E. coli - proto jsou DpnI rozštěpeny (odstranění rodičovského templátu bez mutace). nově syntetizované molekuly nejsou metylovány a tudíž nejsou štěpeny po transformaci do E. coli dojde k reparaci zlomů a nově nasyntetizované plazmidy obsahující mutaci se replikují