Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie Mgr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU BUNĚČNÁ SMRT Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. „For every cell, there is a time to live and a time to die.“ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. • typy buněčné smrti • nekróza • autofagie • apoptóza • metodické přístupy ke studiu apoptózy • apoptóza a medicínské aspekty Program přednášky: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. TYPY BUNĚČNÉ SMRTI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Původní dělení způsobů buněčné smrti: • smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího faktoru: náhodná (accidental) buněčná smrt = nekróza • smrt jako indukovaná sebevražda: programovaná (programmed) buněčná smrt = apoptóza • onkóza • postapoptotická nekróza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Buněčná smrt: • katastrofická buněčná smrt  nekróza • fyziologická buněčná smrt  apoptóza (programmed cell death type I, PCDI) •kaspáza-dependentní •kaspáza-independentní  autofagie (programmed cell death type II, PCDII) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. KATASTROFICKÁ (NEPROGRAMOVANÁ) BUNĚČNÁ SMRT NEKRÓZA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Indukce nekrózy a) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou být aktivovány mechanismy apoptózy b) působení stresových faktorů • změny koncentrace iontů, pH... • vyčerpání zdrojů energie • změny teploty • poškození buňky nebo jejích organel Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Příznaky a průběh nekrózy: • poškození mitochondriální membrány • pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií • zakulacení a prasknutí mitochondrií • ztráta regulace transportu iontů • zakulacení buňky (swelling) • lýze buňky • vznik nekrotického ložiska • invaze makrofágů • zánětlivá reakce Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. nekrotické ložisko ve tkáni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. FYZIOLOGICKÁ (PROGRAMOVANÁ) BUNĚČNÁ SMRT Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT (Programmed Cell Death, PCD) • indukovaný, regulovaný a selektivní proces pro vyřazování určitých buněk Apoptóza (apoptosis, type I PCD) • kaspázy • kalpainy, katepsiny, granzymy Autofagie (autophagy, type II PCD) • autofagozomy/autolysozomy (lysozomální proteázy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. AUTOFAGIE (PCDII) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Průběh autofagie 1. indukce (např. inhibice mTOR signální dráhy) 2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?) 3. vazba a fúze s lysosomem 4. rozpad autolysosomálního veziklu • účast savčích homologů genů Atg (kvasinky) Typy autofagie: • mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou invaginací) • makroautofagie (vznik autofagosomu) • chaperon-mediated autofagie (CMA) - selektivní Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. mitochondrie v autofagosomu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. APOPTÓZA (PCDI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972) 26, 239. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. 2002 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství: za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a programované buněčné smrti Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Caenorhabditis elegans • 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit, z toho 131 podléhá apoptóze • regulace apoptózy - 14 genů Ced: Ced-3, Ced-4 - indukce Ced-9 - represe Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Průběh apoptózy: normální buňka smršťování rozpad (fragmentace) apoptotická tělíska (apo-bodies) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Příčiny apoptózy 1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu: • resorpce ocásku během metamorfózy pulce v žábu • odstranění tkáně mezi prsty během embryogeneze • odstranění nadbytečných neuronů při vytváření synapsí v mozku • uvolňování endometria na počátku menstruace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. syndaktylie (defekt apoptózy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Příčiny apoptózy 2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk, které představují ohrožení integrity organismu • buňky infikované viry • efektorové buňky imunitního systému po odeznění imunitní odpovědi • buňky s poškozením DNA zvýšená produkce proteinu p53 (induktor apoptózy) • nádorově transformované buňky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Indukce apoptózy Odstranění pozitivního signálu • růstové faktory - neurony • Interleukin 2 (IL-2) - lymfocyty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Indukce apoptózy Přijetí negativního signálu • zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce • poškození DNA (volné radikály, UVR, gama záření, chemoterapeutika) • molekuly (death activators), které se napojují na specifické receptory (death receptors) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. 1. zmenšení (smrštění) buňky 2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt-C 3. blebbing plazmatické membrány 4. změny v plazmatické membráně 5. kolaps jádra (degradace chromatinu) 6. zvýšená aktivita transglutaminázy 7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení 8. rozpad buňky na apoptotická tělíska 9. fagocytóza apoptotických tělísek Morfologické a biochemické příznaky apoptózy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Metodické aspekty studia apoptózy • morfologické příznaky (1972) blebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolaps jádra, vznik apo-bodies • fragmentace DNA (1987) fragmenty: ladder, zlomy v řetězcích: TUNEL • aktivace proteolytické kaskády (1995) produkty proteolytického štěpení • změny plazmatické membrány (1997) externalizace fosfatidylserinu: annexin-V • změny mitochondrií (1998) změny permeability mitochondriální membrány, detekce Cytochomu C a AIF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Blebbing plazmatické membrány • degradace kortikálního cytoskeletu (fodrin, aktin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Změny v plazmatické membráně • externalizace fosfatidylserinu („eat me“ signal) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Změny v plazmatické membráně • detekce fosfatidylserinu – Annexinem V Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Změny v plazmatické membráně • detekce fosfatidylserinu – Annexinem V • flow cytometrie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Kolaps jádra (degradace chromatinu) • kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra • internukleosomální štěpení DNA - žebříček (ladder) • fragmentace jádra CAD – kaspázou aktivovaná Dnáza ICAD – inhibitor CAD Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Detekce štěpení DNA: TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling TUNEL DAPI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Aktivace proteolytického štěpení Kaspázy • cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině kyseliny asparagové • caspases = cysteinyl-aspartic-acid-proteases • 14 druhů kaspáz (u člověka): iniciační (apikální - 8, 9, 10 a 12) efektorové (exekuční - 3, 6 a 7) pro-inflamatorní Katepsiny, kalpainy, granzymy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Aktivace proteolytického štěpení Substráty kaspáz • „cell death“ proteiny (Bcl-2,Bcl-XL, prokaspázy..) • regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..) • cytoskelet (aktin, fodrin, keratiny, laminy..) • DNA metabolismus (ICAD, PARP..) • RNA metabolismus • signální dráhy • TF • proteiny spojené s neurodegenerativními chorobami Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Aktivace kaspáz, proteolytické štěpení prokaspáza kaspáza aktivní kaspáza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. a-tubulin / DAPI aktivovaná kaspáza 3 Aktivace kaspáz – fluorescenční mikroskopie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Aktivace kaspáz – detekce (WB) Lamin A Poly (ADP-ribose) polymerase Kaspáza-3 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Rozpad buňky na apoptotická tělíska • účast nově formované aktinové 3D struktury a nesvalového myosinu • apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra, organely a části cytoplazmy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Fagocytóza apoptotických tělísek • pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami (makrofágy, dendritické buňky) • fagocytující buňky vylučují cytokiny, které zabraňují zánětu ve tkáni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza vyvolaná vnitřními signály: • zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií protein Bcl-2, vázaný k Apaf-1 • při vnitřním poškození buňky protein Bcl-2: • uvolní Apaf-1 • přestane zadržovat cytochrom c v mitochondriích • vzniká apoptosom: Apaf-1 Cytochrom C (Apaf-2) prokaspáza 9 (dATP) • vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje další kaspázy (efektorové) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Změny mitochondrií změna permeability mitochondriální membrány detekce cytochomu C Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza vyvolaná vnějšími signály: • aktivační molekuly (death activators) se napojují na specifické receptory v plazmatické membráně (death receptors): Tumor necrosis factor a (TNF-a) - TNF receptor Lymphotoxin (TNF-b) - TNF receptor Fas-ligand (FasL) - Fas receptor (CD95) • přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu 8 (iniciační), • aktivovaná kaspáza 8 štěpením dalších prokaspáz spouští proteolytickou kaskádu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. DISC death-inducing signaling complex • ligand • receptor • adaptorové proteiny • prokaspáza-8 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a nádory Chemo- a radio- terapií indukovaná buněčná smrt strategie: • zabránit neregulovanému buněčnému dělení nádorových buněk • ovlivnění buněčného cyklu a DNA syntézy u rychle se dělících buněk - antimetabolity - genotoxické látky způsobují apoptózu - mitotické inhibitory • defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Chemo- a radio- terapií indukovaná buněčná smrt - signalizace • indukce poškození DNA – (DNA damage signal) • přenos z DNA vazebných proteinů na kinázy PI3K rodiny (ATM, ATR) - funkce v kontrolních uzlech • fosforylují efektorové kinázy (Chk1, Chk2 a c-Abl) • fosforylace TF - p53, p73, E2F.. • zvýšení exprese genů – skupiny reparace DNA, zástava buněčného cyklu a apoptóza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Vztah p53 a apoptózy •aktivuje mitochondriální apopotickou dráhu upregulace proapoptotických genů (Bax, Bid, Noxa, Puma) downregulace antiapoptotických genů (Bcl-2, Mcl-1) •aktivuje receptorovou apoptotickou dráhu upregulace death receptorů (Fas, DR4, DR5) •nezávisle na transkripci translokace p53 do mitochondrií a vazba na Bcl-2 a Bcl-XL Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a nádory Inhibice apoptózy nádorových buněk bez účasti virů: • narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk -nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) – z důvodu metylace promotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu-8 (neuroblastom, plicní karcinom, Ewingův sarkom, melanomy) - sekrece „decoy“ molekuly, která se váže na FasL a brání její vazbě na FasR (nádory plic a střeva) - sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu cytotoxických lymfocytů • narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk - delece a/nebo metylace genu pro Apaf-1 (melanom) - nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria) - overexprese Bcl-2 z důvodu translokace (leukémie) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a nádory Viry, inhibující apoptózu transformovaných buněk: tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých úrovních • receptorová apoptóza • mitochondriální apoptóza • p53 • podpora proliferačních signálních drah • Human papilloma virus (HPV): exprese proteinu E6 - inaktivátor proteinu p53 • Epstein-Barrové virus (EBV): produkuje protein, podobný proteinu Bcl-2 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. When Cells Die II: R. A. Lockshin, Z. Zakeri Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a imunitní systém • nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů • produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické Regulace apoptózy • omezení růstových faktorů (IL-2) - protiháč Bcl-2 pro T buňky reagující na vnější a přechodné antigeny • pomocí „death“ molekul (Fas ligand) pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigeny Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a imunitní systém defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby • neschopnost navození apoptózy a přežívání auto-reaktivních lymfocytů - mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas ligandu –> lymfadenopatie (zvětšení uzlin), akumulace lymfocytů • účast „death“ receptorů a ligandů v poškození tkáně Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby systémový lupus erythematodes, lupenka, revmatoidní artritida, Hashimotovo struma… Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a imunitní systém Autoimunitní choroby: systémový lupus erythematodes Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a imunitní systém AIDS: pokles CD4+ T-lymfocytů • pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou • infikované buňky produkují virové proteiny (Tat, gp120, Nef, Vpu), • Blokují Bcl-2, aktivují pro-kaspázu 8 • změny v expresi cytokinů (↑ IL-4, IL-10; ↓ IL-12, INF-γ) • viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivují apoptózu v okolních lymfocytech Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3. Apoptóza a degenerativní onemocnění Alzheimerova choroba Parkinsonova choroba Huntingtonova choroba nejasné mechanismy indukce apoptózy: • volné radikály • nedostatečná hladina nervových růstových faktorů • vysoká hladina neurotransmiterů • vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.