1
Bi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 Aplikovaná buněčná biologieBi8120 Aplikovaná buněčná biologie
BUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRT
Mgr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Mgr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MU
2
„For every cell,„For every cell,
there is a time to live and a time to die.“there is a time to live and a time to die.“
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
3
P ř d áškP ř d áškProgram přednášky:Program přednášky:
• typy buněčné smrti
• nekróza
• typy buněčné smrti
• nekrózanekróza
• autofagie
• apoptóza
nekróza
• autofagie
• apoptóza• apoptóza
• metodické přístupy ke studiu apoptózy
tó di í ké kt
• apoptóza
• metodické přístupy ke studiu apoptózy
tó di í ké kt• apoptóza a medicínské aspekty• apoptóza a medicínské aspekty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
4
TYPY BUNĚČNÉ SMRTITYPY BUNĚČNÉ SMRTITYPY BUNĚČNÉ SMRTITYPY BUNĚČNÉ SMRTI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
5
Původní dělení způsobů buněčné smrti:Původní dělení způsobů buněčné smrti:
• smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího
faktoru:
• smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího
faktoru:
náhodná (accidental) buněčná smrt
= nekróza
náhodná (accidental) buněčná smrt
= nekróza
• smrt jako indukovaná sebevražda:
programovaná (programmed) buněčná smrt
• smrt jako indukovaná sebevražda:
programovaná (programmed) buněčná smrt
= apoptóza
onkó a
= apoptóza
onkó a• onkóza
• postapoptotická nekróza
• onkóza
• postapoptotická nekróza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
6
Buněčná smrt:Buněčná smrt:
• katastrofická buněčná smrt
 nekróza
• katastrofická buněčná smrt
 nekróza nekróza
• fyziologická buněčná smrt
 apoptóza
 nekróza
• fyziologická buněčná smrt
 apoptóza apoptóza
(programmed cell death type I, PCDI)
•kaspáza dependentní
 apoptóza
(programmed cell death type I, PCDI)
•kaspáza dependentní•kaspáza-dependentní
•kaspáza-independentní
 autofagie
•kaspáza-dependentní
•kaspáza-independentní
 autofagie autofagie
(programmed cell death type II, PCDII)
 autofagie
(programmed cell death type II, PCDII)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
7
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
8
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
9
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
10
KATASTROFICKÁKATASTROFICKÁKATASTROFICKÁ
(NEPROGRAMOVANÁ)
ĚČ Á S
KATASTROFICKÁ
(NEPROGRAMOVANÁ)
ĚČ Á SBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRT
NEKRÓZANEKRÓZA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
11
Indukce nekrózy
a) rozsáhlé poškození při němž už nemohou být
Indukce nekrózy
a) rozsáhlé poškození při němž už nemohou býta) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou být
aktivovány mechanismy apoptózy
b) působení stresových faktorů
a) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou být
aktivovány mechanismy apoptózy
b) působení stresových faktorůb) působení stresových faktorů
• změny koncentrace iontů, pH...
• vyčerpání zdrojů energie
b) působení stresových faktorů
• změny koncentrace iontů, pH...
• vyčerpání zdrojů energie• vyčerpání zdrojů energie
• změny teploty
• poškození buňky nebo jejích organel
• vyčerpání zdrojů energie
• změny teploty
• poškození buňky nebo jejích organel• poškození buňky nebo jejích organel• poškození buňky nebo jejích organel
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
12
Příznaky a průběh nekrózy:Příznaky a průběh nekrózy:Příznaky a průběh nekrózy:
• poškození mitochondriální membrány
iká í i tů C 2+ d it h d ií
Příznaky a průběh nekrózy:
• poškození mitochondriální membrány
iká í i tů C 2+ d it h d ií• pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií
• zakulacení a prasknutí mitochondrií
• ztráta regulace transportu iontů
• pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií
• zakulacení a prasknutí mitochondrií
• ztráta regulace transportu iontů• ztráta regulace transportu iontů
• zakulacení buňky (swelling)
• lýze buňky
• ztráta regulace transportu iontů
• zakulacení buňky (swelling)
• lýze buňky• lýze buňky
• vznik nekrotického ložiska
• invaze makrofágů
• lýze buňky
• vznik nekrotického ložiska
• invaze makrofágů• invaze makrofágů
• zánětlivá reakce
• invaze makrofágů
• zánětlivá reakce
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
13
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
14
nekrotické ložisko ve tkáninekrotické ložisko ve tkáni
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
15
FYZIOLOGICKÁ
(PROGRAMOVANÁ)
FYZIOLOGICKÁ
(PROGRAMOVANÁ)(PROGRAMOVANÁ)
BUNĚČNÁ SMRT
(PROGRAMOVANÁ)
BUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRT
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
16
PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT
(P d C ll D th PCD)
PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT
(P d C ll D th PCD)(Programmed Cell Death, PCD)
• indukovaný regulovaný a selektivní
(Programmed Cell Death, PCD)
• indukovaný regulovaný a selektivní• indukovaný, regulovaný a selektivní
proces pro vyřazování určitých buněk
• indukovaný, regulovaný a selektivní
proces pro vyřazování určitých buněk
Apoptóza (apoptosis, type I PCD)
• kaspázy
Apoptóza (apoptosis, type I PCD)
• kaspázy
• kalpainy, katepsiny, granzymy
Autofagie (autophagy type II PCD)
• kalpainy, katepsiny, granzymy
Autofagie (autophagy type II PCD)Autofagie (autophagy, type II PCD)
• autofagozomy/autolysozomy
(lysozomální proteázy)
Autofagie (autophagy, type II PCD)
• autofagozomy/autolysozomy
(lysozomální proteázy)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
(lysozomální proteázy)(lysozomální proteázy)
17
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
18
AUTOFAGIE (PCDII)AUTOFAGIE (PCDII)AUTOFAGIE (PCDII)AUTOFAGIE (PCDII)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
19
Průběh autofagie
1 indukce (např inhibice mTOR signální dráhy)
Průběh autofagie
1 indukce (např inhibice mTOR signální dráhy)1. indukce (např. inhibice mTOR signální dráhy)
2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?)
3. vazba a fúze s lysosomem
1. indukce (např. inhibice mTOR signální dráhy)
2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?)
3. vazba a fúze s lysosomemy
4. rozpad autolysosomálního veziklu
• účast savčích homologů genů Atg (kvasinky)
y
4. rozpad autolysosomálního veziklu
• účast savčích homologů genů Atg (kvasinky)účast savčích homologů genů Atg (kvasinky)
Typy autofagie:
účast savčích homologů genů Atg (kvasinky)
Typy autofagie:
• mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou
invaginací)
k t f i ( ik t f )
• mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou
invaginací)
k t f i ( ik t f )• makroautofagie (vznik autofagosomu)
• chaperon-mediated autofagie (CMA) - selektivní
• makroautofagie (vznik autofagosomu)
• chaperon-mediated autofagie (CMA) - selektivní
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
20
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
21
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
22
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
23
mitochondrie v autofagosomumitochondrie v autofagosomu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
mitochondrie v autofagosomumitochondrie v autofagosomu
24
APOPTÓZA (PCDI)APOPTÓZA (PCDI)APOPTÓZA (PCDI)APOPTÓZA (PCDI)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
25
Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R.
Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide
Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R.
Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide
ranging implications in tissue kinetics.
British Journal of Cancer (1972) 26, 239.
ranging implications in tissue kinetics.
British Journal of Cancer (1972) 26, 239.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
26
2002 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství:2002 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství:
J h E S l tJ h E S l tSydney BrennerSydney Brenner John E. SulstonJohn E. Sulston
H. Robert HorvitzH. Robert Horvitz
za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a
programované buněčné smrti
za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a
programované buněčné smrti
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
programované buněčné smrtiprogramované buněčné smrti
27
Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans
• 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit,
z toho 131 podléhá apoptóze
l tó 14 ů C d
• 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit,
z toho 131 podléhá apoptóze
l tó 14 ů C d• regulace apoptózy - 14 genů Ced:
Ced-3, Ced-4 - indukce
Ced-9 - represe
• regulace apoptózy - 14 genů Ced:
Ced-3, Ced-4 - indukce
Ced-9 - represe
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
pp
28
P ůběh o tóP ůběh o tóPrůběh apoptózy:Průběh apoptózy:
normální
buňka
normální
buňka
smršťovánísmršťování rozpad
(fragmentace)
rozpad
(fragmentace)
apoptotická
tělíska
apoptotická
tělískabuňkabuňka (fragmentace)(fragmentace) tělíska
(apo-bodies)
tělíska
(apo-bodies)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
29
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
30
Příčiny apoptózyPříčiny apoptózyPříčiny apoptózy
1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu:
Příčiny apoptózy
1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu:p p j y p ý ý j g
• resorpce ocásku během metamorfózy pulce v
žábu
p p j y p ý ý j g
• resorpce ocásku během metamorfózy pulce v
žábu
• odstranění tkáně mezi prsty během
embryogeneze
odst anění nadb tečných ne onů při t áření
• odstranění tkáně mezi prsty během
embryogeneze
odst anění nadb tečných ne onů při t áření• odstranění nadbytečných neuronů při vytváření
synapsí v mozku
• uvolňování endometria na počátku
• odstranění nadbytečných neuronů při vytváření
synapsí v mozku
• uvolňování endometria na počátkuuvolňování endometria na počátku
menstruace
uvolňování endometria na počátku
menstruace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
31
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
32
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
33
syndaktylie (defekt apoptózy)syndaktylie (defekt apoptózy)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
y y ( p p y)y y ( p p y)
34
Příčiny apoptózyPříčiny apoptózy
2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk,
které představují ohrožení integrity organismu
2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk,
které představují ohrožení integrity organismukteré představují ohrožení integrity organismu
• buňky infikované viry
• efektorové buňky imunitního systému po
které představují ohrožení integrity organismu
• buňky infikované viry
• efektorové buňky imunitního systému po• efektorové buňky imunitního systému po
odeznění imunitní odpovědi
• buňky s poškozením DNA
• efektorové buňky imunitního systému po
odeznění imunitní odpovědi
• buňky s poškozením DNAy p
zvýšená produkce proteinu p53
(induktor apoptózy)
y p
zvýšená produkce proteinu p53
(induktor apoptózy)( p p y)
• nádorově transformované buňky
( p p y)
• nádorově transformované buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
35
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
36
Indukce apoptózyIndukce apoptózy
Odstranění pozitivního signálu
• růstové faktory neurony
Odstranění pozitivního signálu
• růstové faktory neurony• růstové faktory - neurony
• Interleukin 2 (IL-2) - lymfocyty
• růstové faktory - neurony
• Interleukin 2 (IL-2) - lymfocyty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
37
Indukce apoptózyIndukce apoptózy
Přijetí negativního signáluPřijetí negativního signáluPřijetí negativního signálu
• zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce
Přijetí negativního signálu
• zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce
• poškození DNA (volné radikály, UVR, gama
záření, chemoterapeutika)
• poškození DNA (volné radikály, UVR, gama
záření, chemoterapeutika)
• molekuly (death activators), které se napojují
na specifické receptory (death receptors)
• molekuly (death activators), které se napojují
na specifické receptory (death receptors)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
38
Morfologické a biochemické příznaky apoptózyMorfologické a biochemické příznaky apoptózy
1. zmenšení (smrštění) buňky
2 poruchy mitochondrií a uvolnění cyt-C
1. zmenšení (smrštění) buňky
2 poruchy mitochondrií a uvolnění cyt-C2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt C
3. blebbing plazmatické membrány
4 změny v plazmatické membráně
2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt C
3. blebbing plazmatické membrány
4 změny v plazmatické membráně4. změny v plazmatické membráně
5. kolaps jádra (degradace chromatinu)
6 zvýšená aktivita transglutaminázy
4. změny v plazmatické membráně
5. kolaps jádra (degradace chromatinu)
6 zvýšená aktivita transglutaminázy6. zvýšená aktivita transglutaminázy
7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení
8 d b ňk t ti ká tělí k
6. zvýšená aktivita transglutaminázy
7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení
8 d b ňk t ti ká tělí k8. rozpad buňky na apoptotická tělíska
9. fagocytóza apoptotických tělísek
8. rozpad buňky na apoptotická tělíska
9. fagocytóza apoptotických tělísek
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
39
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
40
Metodické aspekty studia apoptózyMetodické aspekty studia apoptózy
•• morfologické pmorfologické přříznakyíznaky (1972)(1972)
blebbingblebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolapsmembrány, kondenzace chromatinu, kolaps
jád ikjád ik b dib di
•• morfologické pmorfologické přříznakyíznaky (1972)(1972)
blebbingblebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolapsmembrány, kondenzace chromatinu, kolaps
jád ikjád ik b dib dijádra, vznikjádra, vznik apoapo--bodiesbodies
•• fragmentace DNAfragmentace DNA (1987)(1987)
fragmenty:fragmenty: ladderladder zlomy vzlomy v řřetetěězcích: TUNELzcích: TUNEL
jádra, vznikjádra, vznik apoapo--bodiesbodies
•• fragmentace DNAfragmentace DNA (1987)(1987)
fragmenty:fragmenty: ladderladder zlomy vzlomy v řřetetěězcích: TUNELzcích: TUNELfragmenty:fragmenty: ladderladder, zlomy v, zlomy v řřetetěězcích: TUNELzcích: TUNEL
•• aktivace proteolytické kaskádyaktivace proteolytické kaskády (1995)(1995)
produkty proteolytického štprodukty proteolytického štěěpenípení
fragmenty:fragmenty: ladderladder, zlomy v, zlomy v řřetetěězcích: TUNELzcích: TUNEL
•• aktivace proteolytické kaskádyaktivace proteolytické kaskády (1995)(1995)
produkty proteolytického štprodukty proteolytického štěěpenípeníprodukty proteolytického štprodukty proteolytického štěěpenípení
•• zmzměěny plazmatické membrányny plazmatické membrány (1997)(1997)
externalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu:: annexinannexin--VV
produkty proteolytického štprodukty proteolytického štěěpenípení
•• zmzměěny plazmatické membrányny plazmatické membrány (1997)(1997)
externalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu:: annexinannexin--VVexternalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu:: annexinannexin--VV
•• zmzměěny mitochondriíny mitochondrií (1998)(1998)
zmzměěny permeability mitochondriálníny permeability mitochondriální
áá
externalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu:: annexinannexin--VV
•• zmzměěny mitochondriíny mitochondrií (1998)(1998)
zmzměěny permeability mitochondriálníny permeability mitochondriální
áá
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
membrány, detekcemembrány, detekce CytochomuCytochomu C a AIFC a AIFmembrány, detekcemembrány, detekce CytochomuCytochomu C a AIFC a AIF
41
Blebbing plazmatické membrány
• degradace kortikálního cytoskeletu
Blebbing plazmatické membrány
• degradace kortikálního cytoskeletu• degradace kortikálního cytoskeletu
(fodrin, aktin)
• degradace kortikálního cytoskeletu
(fodrin, aktin)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
42
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
43
Změny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráně
• externalizace fosfatidylserinu
( eat me“ signal)
Změny v plazmatické membráně
• externalizace fosfatidylserinu
( eat me“ signal)(„eat me signal)(„eat me signal)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
44
Změny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráně
• detekce fosfatidylserinu – Annexinem V
Změny v plazmatické membráně
• detekce fosfatidylserinu – Annexinem V
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
45
Změny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráně
• detekce fosfatidylserinu – Annexinem V
• flow cytometrie
• detekce fosfatidylserinu – Annexinem V
• flow cytometrie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
46
Kolaps jádra (degradace chromatinu)Kolaps jádra (degradace chromatinu)
• kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra
• internukleosomální štěpení DNA - žebříček (ladder)
• fragmentace jádra
• kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra
• internukleosomální štěpení DNA - žebříček (ladder)
• fragmentace jádrafragmentace jádrafragmentace jádra
CAD – kaspázou aktivovaná Dnáza
ICAD – inhibitor CAD
CAD – kaspázou aktivovaná Dnáza
ICAD – inhibitor CAD
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
47
Detekce štěpení DNA:Detekce štěpení DNA:
TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase
dUTP nick end labeling
TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase
dUTP nick end labeling
TUNELTUNEL
DAPIDAPIDAPIDAPI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
48
é š íé š íAktivace proteolytického štěpení
K á
Aktivace proteolytického štěpení
K áKaspázy
• cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině
kyseliny asparagové
Kaspázy
• cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině
kyseliny asparagovékyseliny asparagové
• caspases = cysteinyl-aspartic-acid-proteases
• 14 druhů kaspáz (u člověka):
kyseliny asparagové
• caspases = cysteinyl-aspartic-acid-proteases
• 14 druhů kaspáz (u člověka):14 druhů kaspáz (u člověka):
iniciační (apikální - 8, 9, 10 a 12)
efektorové (exekuční - 3, 6 a 7)
14 druhů kaspáz (u člověka):
iniciační (apikální - 8, 9, 10 a 12)
efektorové (exekuční - 3, 6 a 7)( )
pro-inflamatorní
Katepsiny, kalpainy, granzymy
( )
pro-inflamatorní
Katepsiny, kalpainy, granzymy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
49
Aktivace proteolytického štěpeníAktivace proteolytického štěpeníp y p
Substráty kaspáz
p y p
Substráty kaspáz
• „cell death“ proteiny (Bcl-2,Bcl-XL, prokaspázy..)
• regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..)
t k l t ( kti f d i k ti l i )
• „cell death“ proteiny (Bcl-2,Bcl-XL, prokaspázy..)
• regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..)
t k l t ( kti f d i k ti l i )• cytoskelet (aktin, fodrin, keratiny, laminy..)
• DNA metabolismus (ICAD, PARP..)
• RNA metabolismus
• cytoskelet (aktin, fodrin, keratiny, laminy..)
• DNA metabolismus (ICAD, PARP..)
• RNA metabolismus• RNA metabolismus
• signální dráhy
• TF
• RNA metabolismus
• signální dráhy
• TFTF
• proteiny spojené s neurodegenerativními
chorobami
TF
• proteiny spojené s neurodegenerativními
chorobami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
50
Aktivace kaspáz, proteolytické štěpeníAktivace kaspáz, proteolytické štěpení
prokaspázaprokaspáza
kaspázakaspázakaspázakaspáza
aktivníaktivní
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
kaspázakaspáza
51
Aktivace kaspáz – fluorescenční mikroskopieAktivace kaspáz – fluorescenční mikroskopie
a-tubulin / DAPIa-tubulin / DAPI aktivovaná kaspáza 3aktivovaná kaspáza 3
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
pp
52
Aktivace kaspáz – detekce (WB)Aktivace kaspáz – detekce (WB)
Kaspáza-3
Lamin A Poly (ADP-ribose) polymeraseLamin A Poly (ADP-ribose) polymerase
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
53
Rozpad buňky na apoptotická tělískaRozpad buňky na apoptotická tělíska
úč é éúč é é• účast nově formované aktinové 3D
struktury a nesvalového myosinu
• apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra
• účast nově formované aktinové 3D
struktury a nesvalového myosinu
• apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra• apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra,
organely a části cytoplazmy
• apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra,
organely a části cytoplazmy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
54
Fagocytóza apoptotických tělísek
hl í t ti ký h tělí k k l í i
Fagocytóza apoptotických tělísek
hl í t ti ký h tělí k k l í i• pohlcení apoptotických tělísek okolními
buňkami
(makrofágy dendritické buňky)
• pohlcení apoptotických tělísek okolními
buňkami
(makrofágy dendritické buňky)(makrofágy, dendritické buňky)
• fagocytující buňky vylučují cytokiny, které
zabraňují zánětu ve tkáni
(makrofágy, dendritické buňky)
• fagocytující buňky vylučují cytokiny, které
zabraňují zánětu ve tkánizabraňují zánětu ve tkánizabraňují zánětu ve tkáni
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
55
Apoptóza vyvolaná vnitřními signály:Apoptóza vyvolaná vnitřními signály:
• zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií
protein Bcl-2, vázaný k Apaf-1
• při vnitřním poškození buňky protein Bcl-2:
• zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií
protein Bcl-2, vázaný k Apaf-1
• při vnitřním poškození buňky protein Bcl-2:• při vnitřním poškození buňky protein Bcl-2:
• uvolní Apaf-1
• přestane zadržovat cytochrom c v mitochondriích
• při vnitřním poškození buňky protein Bcl-2:
• uvolní Apaf-1
• přestane zadržovat cytochrom c v mitochondriíchp y
• vzniká apoptosom:
Apaf-1
p y
• vzniká apoptosom:
Apaf-1
Cytochrom C (Apaf-2)
prokaspáza 9
Cytochrom C (Apaf-2)
prokaspáza 9
(dATP)
• vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje
další kaspázy (efektorové)
(dATP)
• vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje
další kaspázy (efektorové)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
další kaspázy (efektorové)další kaspázy (efektorové)
56
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
57
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
58
ZmZměěny mitochondriíny mitochondrií
zmzměěna permeabilityna permeability
mitochondriálnímitochondriální
membránymembránymembránymembrány
detekcedetekce cytochomucytochomu CC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
59
Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:
• aktivační molekuly (death activators) se napojují na
specifické receptory v plazmatické membráně (death
Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:
• aktivační molekuly (death activators) se napojují na
specifické receptory v plazmatické membráně (deathspecifické receptory v plazmatické membráně (death
receptors):
Tumor necrosis factor a (TNF a) TNF receptor
specifické receptory v plazmatické membráně (death
receptors):
Tumor necrosis factor a (TNF a) TNF receptorTumor necrosis factor a (TNF-a) - TNF receptor
Lymphotoxin (TNF-b) - TNF receptor
Fas-ligand (FasL) - Fas receptor (CD95)
Tumor necrosis factor a (TNF-a) - TNF receptor
Lymphotoxin (TNF-b) - TNF receptor
Fas-ligand (FasL) - Fas receptor (CD95)g ( ) ( )
• přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu 8
(iniciační),
g ( ) ( )
• přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu 8
(iniciační),
• aktivovaná kaspáza 8 štěpením dalších prokaspáz
spouští proteolytickou kaskádu
• aktivovaná kaspáza 8 štěpením dalších prokaspáz
spouští proteolytickou kaskádu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
60
DISC
death-inducing
signaling complex
• ligand
• receptorreceptor
• adaptorové proteiny
• prokaspáza-8
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
61
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
62
Apoptóza a nádory
Chemo- a radio- terapií indukovaná buněčná smrt
strategie:
• zabránit neregulovanému buněčnému dělenízabránit neregulovanému buněčnému dělení
nádorových buněk
• ovlivnění buněčného cyklu a DNA syntézy u rychle se
dělících buněkdělících buněk
- antimetabolity
- genotoxické látky způsobují apoptózu
- mitotické inhibitory
• defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu
63
Chemo- a radio- terapií
i d k á b ěč á t i liindukovaná buněčná smrt - signalizace
i d k šk í DNA (DNA d i l)• indukce poškození DNA – (DNA damage signal)
• přenos z DNA vazebných proteinů na kinázy PI3K rodiny
(ATM, ATR) - funkce v kontrolních uzlech
• fosforylují efektorové kinázy (Chk1, Chk2 a c-Abl)
• fosforylace TF - p53, p73, E2F..
• zvýšení exprese genů – skupiny reparace DNA, zástavazvýšení exprese genů skupiny reparace DNA, zástava
buněčného cyklu a apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
64
Vztah p53 a apoptózyVztah p53 a apoptózy
•aktivuje mitochondriální apopotickou dráhu
ý ůupregulace proapoptotických genů (Bax, Bid,
Noxa, Puma)
downregulace antiapoptotických genůg p p ý g
(Bcl-2, Mcl-1)
•aktivuje receptorovou apoptotickou dráhu•aktivuje receptorovou apoptotickou dráhu
upregulace death receptorů (Fas, DR4, DR5)
á i l t k i i•nezávisle na transkripci
translokace p53 do mitochondrií a vazba na Bcl-2
a Bcl-XL
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
65
Apoptóza a nádoryApoptóza a nádory
Inhibice apoptózy nádorových buněk
bez účasti virů:
Inhibice apoptózy nádorových buněk
bez účasti virů:
• narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk
-nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) – z důvodu metylace
promotoru delece nebo mutace genu pro kaspázu-8
• narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk
-nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) – z důvodu metylace
promotoru delece nebo mutace genu pro kaspázu-8promotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu 8
(neuroblastom, plicní karcinom, Ewingův sarkom, melanomy)
- sekrece „decoy“ molekuly, která se váže na FasL a brání její
vazbě na FasR (nádory plic a střeva)
promotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu 8
(neuroblastom, plicní karcinom, Ewingův sarkom, melanomy)
- sekrece „decoy“ molekuly, která se váže na FasL a brání její
vazbě na FasR (nádory plic a střeva)( y p )
- sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu
cytotoxických lymfocytů
( y p )
- sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu
cytotoxických lymfocytů
• narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk
- delece a/nebo metylace genu pro Apaf-1 (melanom)
- nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria)
B l 2 dů d t l k (l ké i )
• narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk
- delece a/nebo metylace genu pro Apaf-1 (melanom)
- nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria)
B l 2 dů d t l k (l ké i )
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
- overexprese Bcl-2 z důvodu translokace (leukémie)- overexprese Bcl-2 z důvodu translokace (leukémie)
66
Apoptóza a nádoryApoptóza a nádory
Viry, inhibující apoptózu transformovaných buněk:Viry, inhibující apoptózu transformovaných buněk:
tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých
úrovních
tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých
úrovních
• receptorová apoptóza
• mitochondriální apoptóza
• p53
• receptorová apoptóza
• mitochondriální apoptóza
• p53p
• podpora proliferačních signálních drah
• Human papilloma virus (HPV):
p
• podpora proliferačních signálních drah
• Human papilloma virus (HPV):• Human papilloma virus (HPV):
exprese proteinu E6 - inaktivátor proteinu p53
• Epstein-Barrové virus (EBV):
produkuje protein, podobný proteinu Bcl-2
• Human papilloma virus (HPV):
exprese proteinu E6 - inaktivátor proteinu p53
• Epstein-Barrové virus (EBV):
produkuje protein, podobný proteinu Bcl-2
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
67
When Cells Die II:
R. A. Lockshin, Z. Zakeri
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
68
Apoptóza a imunitní systémApoptóza a imunitní systém
• nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů
• produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické
• nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů
• produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxicképrodukují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické
Regulace apoptózy
produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické
Regulace apoptózyg p p y
• omezení růstových faktorů (IL-2) - protiháč Bcl-2
pro T buňky reagující na vnější a přechodné
g p p y
• omezení růstových faktorů (IL-2) - protiháč Bcl-2
pro T buňky reagující na vnější a přechodnépro T buňky reagující na vnější a přechodné
antigeny
• pomocí „death“ molekul (Fas ligand)
pro T buňky reagující na vnější a přechodné
antigeny
• pomocí „death“ molekul (Fas ligand)pomocí „death molekul (Fas ligand)
pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigeny
pomocí „death molekul (Fas ligand)
pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigeny
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
69
Apoptóza a imunitní systémApoptóza a imunitní systém
defekty v indukci apoptózy a autoimunitní chorobydefekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby
• neschopnost navození apoptózy a přežívání
auto-reaktivních lymfocytů
• neschopnost navození apoptózy a přežívání
auto-reaktivních lymfocytů
- mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas
ligandu –> lymfadenopatie (zvětšení uzlin),
- mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas
ligandu –> lymfadenopatie (zvětšení uzlin),
akumulace lymfocytů
účast death“ receptorů a ligandů v poškození
akumulace lymfocytů
účast death“ receptorů a ligandů v poškození• účast „death“ receptorů a ligandů v poškození
tkáně
• účast „death“ receptorů a ligandů v poškození
tkáně
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
70
Defekty v indukci apoptózy a autoimunitní
choroby
Defekty v indukci apoptózy a autoimunitní
chorobychoroby
systémový lupus erythematodes,
lupenka,
choroby
systémový lupus erythematodes,
lupenka,lupenka,
revmatoidní artritida,
Hashimotovo struma…
lupenka,
revmatoidní artritida,
Hashimotovo struma…
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
71
Apoptóza a imunitní systémApoptóza a imunitní systém
Autoimunitní
choroby:
Autoimunitní
choroby:
systémový lupus
erythematodes
systémový lupus
erythematodesyy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
72
Apoptóza a imunitní systémApoptóza a imunitní systém
AIDS:
pokles CD4+ T-lymfocytů
AIDS:
pokles CD4+ T-lymfocytů
• pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou
• infikované buňky produkují virové proteiny
• pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou
• infikované buňky produkují virové proteiny
(Tat, gp120, Nef, Vpu),
• Blokují Bcl-2, aktivují pro-kaspázu 8
(Tat, gp120, Nef, Vpu),
• Blokují Bcl-2, aktivují pro-kaspázu 8
• změny v expresi cytokinů (↑ IL-4, IL-10; ↓ IL-12, INF-γ)
• viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivují
• změny v expresi cytokinů (↑ IL-4, IL-10; ↓ IL-12, INF-γ)
• viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivujíy j j p y p j
apoptózu v okolních lymfocytech
y j j p y p j
apoptózu v okolních lymfocytech
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
73
Apoptóza a degenerativní onemocněníApoptóza a degenerativní onemocnění
Alzheimerova choroba
Parkinsonova choroba
Alzheimerova choroba
Parkinsonova choroba
Huntingtonova chorobaHuntingtonova choroba
nejasné mechanismy indukce apoptózy:
• volné radikály
nejasné mechanismy indukce apoptózy:
• volné radikályvolné radikály
• nedostatečná hladina nervových růstových
faktorů
volné radikály
• nedostatečná hladina nervových růstových
faktorů
• vysoká hladina neurotransmiterů
• vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů
• vysoká hladina neurotransmiterů
• vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.
74
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 02 / 2.3.