Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie
Mgr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
FERTILIZACE A EMBRYOGENEZE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Program přednášky:
• meióza a gametogeneze
• mechanismy fertilizace
• časná embryogeneze
• hybridi a chiméry
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Způsoby rozmnožování eukaryot
Nepohlavní rozmnožování
• potomstvo geneticky identické s rodičovským
organismem
Pohlavní rozmnožování
• původní kombinace genů zanikají a vznikají
nové → každý organismus je geneticky
jedinečný
• kompetitivní selekční výhoda pro organismy v
nepředvídatelně variabilním prostředí
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
HAPLOIDIEDIPLOIDIE
FÚZE GAMET
MEIÓZA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
MEIÓZA A GAMETOGENEZE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
MEIÓZA
• dvě po sobě jdoucí dělení:
I. meiotické (heterotypické, redukční)
II. meiotické (homeotypické, ekvační)
Genetický význam meiózy:
• redukce počtu chromozomů při tvorbě
pohlavních buněk
• v gametách 2n (223 = 8.388.608) možných
kombinací chromosomů (pak ještě zvýšeno
crossing-overem)
• párování homologických chromosomů, které
umožňuje crossing-over a tím i rekombinaci
genů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Schéma kombinace
chromozomů v gametách
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Stádia meiotického dělení
• Premeiotická interfáze
• Meióza I:
profáze I: leptotene
zygotene
pachytene
diplotene
diakineze
metafáze I, anafáze I, telofáze I
• Meióza II:
profáze II, metafáze II, anafáze II, telofáze II
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Tvorba bivalentů a crossing-over
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Chromatidy v průběhu I.profáze
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
SYCP (synaptonemal complex protein ) 1 - 3
Synaptonemální komplex
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Synaptonemální komplex
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky
a) Nerovnoměrný crossing-over
• v profázi I
• důsledek: delece a duplikace daného
chromozomu v polovině gamet
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky
b) Neoddělení (nondisjunkce)
• sesterské chromatidy v anafázi II
• porucha centromer nebo porucha mitotického
aparátu
• důsledek: aneuploidie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Porovnání
spermatogeneze
a oogeneze
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
GAMETOGENEZE: SPERMATOGENEZE
• primordiální zárodečná buňka (spermatogonie)
(46, soustavně se mitoticky dělí)
• spermatocyt I. řádu
(46, probíhá meióza I.)
• spermatocyt II. řádu
(23, probíhá meióza II.)
• spermatida
(23, dozrává bez dalšího dělení)
• spermie
(23, uvolňují se do lumina semenných kanálků)
1 spermatogonie 
 4 haploidní rovnocenné spermie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Průběh
spermatogeneze
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Morfologie spermie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
GAMETOGENEZE: OOGENEZE
• primordiální zárodečná buňka
(46, mitotické dělení)
• oogonium
(46, mitóza, ve 3.měsíci po oplození vývoj v
oocyty)
počet zárodečných
buněk v ovariu
během života
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
GAMETOGENEZE: OOGENEZE
• oocyt I. řádu
(46, začne meióza I, zastavení v profázi ještě před
narozením............při dozrávání se dělící vřeténko
přesunuje k periferii buňky – nerovnoměrné dělení)
• oocyt II. řádu (+ pólocyt)
(23, vstupuje do meiózy II, zastavení v metafázi II.)
• ovum (+ pólocyt)
(23, meióza dokončena v případě oplození)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Průběh oogeneze
1 oogonium  1 zralé
vajíčko + 2-3 pólocyty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Stádia folikulu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
REGULACE OOGENEZE
1. regulační bod = diplotene meiózy I
• dlouhodobé zablokování buněčného cyklu (u člověka až
50 let); u některých živočišných druhů až do fertilizace
• dekondenzace chromosomů, transkripční aktivita
(akumulace materiálu pro časnou embryogenezi)
• hormonální stimulace (LH) → Cdk1/cyklin B (MPF) →
kondenzace chromosomů, rozpad jaderné membrány,
formování spindlu
• anaphase-promoting complex
→ spouští anafázi
• pouze částečná deaktivace Cdk1
přetrvávající M-fáze (kondenzovaný
chromatin, bez jaderné membrány)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
REGULACE OOGENEZE
2. regulační bod = metafáze meiózy II
• u většiny obratlovců až do fertilizace
• po cytokinezi I.meiózy - zvýšení aktivity MPF
• anaphase-promoting komplex syntetizován až po
fertilizaci
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
MECHANISMY FERTILIZACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Kontakt spermie a oocytu
• 300 miliónů spermií v ejakulátu → 200 spermií v místě
fertilizace ve vejcovodu
• chemoatraktanty uvolňované folikulárními buňkami
Kapacitace
• 5-6 hodin (člověk)
• změny lipidů a glykoproteinů plazmatické membrány
(ztráta cholesterou ->zvýšení fluidity)
• HCO3
- → aktivace adenylátcyklázy → syntéza cAMP →
indukce změn podmiňujících kapacitaci
• zvýšení metabolismu a pohyblivosti spermie
• vzrůst membránového potenciálu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Zona pellucida
• extracelulární matrix oocytu (specifické složení)
• 3 typy glykoproteinů (ZP2+ZP3, ZP1)
• bariéra mezidruhové fertilizace
• ZP3 - receptor druhově specifické vazby
Akrosomální reakce
• obsah akrosomu uvolněn exocytózou
• indukce zvýšením koncentrace Ca2+ v cytoplazmě
spermií - vazba na ZP3
• hydrolytické enzymy → průchod zonou pellucidou
• vazba membránových proteinů spermie na ZP2
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
změna
konc. Ca2+
Průběh
fertilizace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Mechanismy blokující polyspermii
• primární blok:
depolarizace plazmatické membrány oocytu po fúzi s
první spermií
• sekundární blok - kortikální reakce oocytu:
uvolnění obsahu kortikálních granulí → enzymy měnící
vlastnosti zony pellucidy (štěpení ZP2, hydrolýza
cukerných zbytků na ZP3)
• intracelulární zvýšení koncentrace Ca2+
(vede k dokončení II. dělění)
Důsledky polyspermie:
více centriolů → multipolární spindl → porucha
segregace chromosomů → nondisjunkce →
aneuploidie → zástava vývoje
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Mechanismus fúze spermie a oocytu
• u většiny druhů nejasný
Fertilin
• transmembránový protein spermií (myš)
• vazebné domény pro integriny oocytu, fúzogenní
oblast
Fúze prvojader
• u nižších živočichů ihned po fúzi
gamet
• u savců pouze prostorové přiblížení
prvojader
• syntéza DNA odděleně
• přiblížení prvojader pomocí MT
z centriolu spermie
• rozpad jaderných membrán až
při prvním mitotickém dělení zygoty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
ČASNÁ EMBRYOGENEZE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Časná embryogeneze u obojživelníků:
• velmi krátký buněčný cyklus (30 min)
• zmenšování objemu dceřinných buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Časná embryogeneze u obojživelníků:
• velmi krátký buněčný cyklus (30 min)
• zmenšování objemu dceřinných buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Časná embryogeneze u savců:
• zygota
• morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
• blastocysta (trofoektoderm, inner cell mass =
ICM, blastocoel, zona pelucida)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Průběh časné embryogeneze u myši
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Průběh časné embryogeneze u člověka
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Tvorba a umístění
zárodečných listů
u lidského embrya
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Inaktivace chromozomu X
• v časné blastocystě inaktivace paternálního X
• zůstává inaktivován v extraembryonálních tkáních
• v ICM se inaktivace ztrácí - později náhodná inaktivace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
TVORBA HYBRIDŮ A CHIMÉR
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
HYBRID
• z genetického pohledu
potomek vzniklý pohlavním rozmnožováním dvou
odlišných homozygotů stejného druhu =>heterozygot
• z taxonomického pohledu
potomek vzniklý z křížení mezi 2 jedinci odlišného taxonu
 v rámci druhu (poddruhy)-tygr bengálský x sibiřský
 mezi druhy - tygr x lev
 mezi rody - ovce x koza
 mezi čeleděmi - výjimečně
 mezi řády - u živočichů není známo
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
MEZIDRUHOVÝ HYBRID
• křížení v rámci rodu
• potomek fenotypově podobný rodičům
• často infertilní (různý počet chromosomů)
• odlišnosti v námluvních rituálech, páření a chování
• jiná sezóna páření
• antigenní reakce na spermie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
mul, mezek (63 chr.)
osel (62 chr.) x kůň (64 chr.)
klisna x osel oslice x hřebec
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
zeedonk, zonkey
osel (62 chr.) x zebra (32- 46 chr.)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
liger, tigon
lev (38 chr.) x tygr (38 chr.)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
MEZIRODOVÝ HYBRID
• křížení odlišných rodů
• přirozeně výjimečný výskyt (Toast of Botswana)
• možnost (nutnost) asistované inseminace (cama)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
„Toast of Botswana“ (57 chr.) r.2000
ovce (54 chr.) x koza (60 chr.)
odliš Geep = chiméra
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
cama
velbloud (74 chr.) x lama (74 chr.)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
CHIMÉRA
řecky Χίμαιρα (Chímaira); latinsky Chimaera
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
CHIMÉRA
organismus obsahující alespoň 2 geneticky odlišné
buněčné populace původem z odlišných zygot
Vznik:
• ze 4 buněk- dvě zygoty (tetragametická ch.)
• ze 3 buněk – (partenogenetická ch.)
• transplantací kostní dřeně (přenos kmenových buněk)
• spojením cévních oběhů (anastomózy) u
dvojvaječných dvojčat
• z časného embrya a diploidních buněk (fůzí, injekcí)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Tetragametický chimerismus
• vrozený chimerismus - u lidí výjimečně (běžné u primátů)
• spojením dvou zygot (časných embryí)
• riziko i při asistované reprodukci
• organismus obsahuje dvě odlišné sady chomozomů
• orgány a tkáně mají jiný původ
• viditelné rozdíly: barva očí, vlasů, „Hitchhiker's thumb„
(AR), Blaschkovy linie, pohlaví může být hermafroditní
(46,XX/46,XY), 2 populace krvinek (imunologická
tolerance obou skupin)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Hitchhiker's thumb Blaschkovy linie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Tetragametický chimerismus
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Partenogenetický chimerismus
• oocyt podléhá partenogenezi a rozdělí se
• vznik 2 haploidních buněk
• oplozeny 2 spermiemi
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Androgenetický chimerismus
• standardní fertilizace oocytu spermií (23,X)
• vznik sekundárního polárního tělíska
• endoreplikace parentálního prvojádra
• vznik 1 diploidní buňky (46,XX) a 1haploidní (23,X)
• haploidní buňka podléhá endoreplikaci
->androgenetická linie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
VYUŽITÍ CHIMÉR VE VÝZKUMU
• studium vývoje savčího embryogeneze
• ověření podílu kmenových buněk na vývoji embrya
• tvorba „nových druhů“
• medicínský význam
• příprava
agregačně
injikačně
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
D6
D9,5
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
počet: cca 0,02% BM MNC
definice: Sca-1+ (stem cell antigen-marker HSC)
lin- (lineage-negative)
CD45- (Leukocyte Common Antigen)
exprimují: SSEA-1, Oct-4, Nanog, Rex-1
velikost: 2-4 um
schopnost diferenciace do různých linií 3 zárodečných vrstev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
KARDIOMYOCYTY NEURONY
OLIGODENDROCYTY PANKREATICKÉ BUŇKY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Schéma experimentu
VSEL (GFP+)
8-cell embryo
24 h
3-4 dny
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Chiméry: tvorba „nových druhů“
geep (kovce?) chiméra kozy a ovce (ne hybrid)
poprvé v roce 1978 Austrálie, Dr R.S. White
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Chiméry: medicínský význam
Výzkum krvetvorby a krevních chorob:
• hematopoetické kmenové b. z lidských fetálních jater
• intraperitoneální injekce do fetu ovce
• lymfoidní prekurzory přetrvávaly až 3,5 roku po transplantaci
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Náhrada orgánů
• prekurzorové ledvinové b. z lidské fetální tkáně
• transplantace do myšího embrya
• diferenciace ve funkční nefrony a podpůrné tkáně
• tvorba miniaturního funkčního orgánu - produkce moči
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
Výzkum neurodegenerativních chorob:
• hESCs implantovány do myšího fetálního mozku
• diferenciace ve funkční linie neurálních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3.
2 dny po injekci D 8,5