BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie FERTILIZACE A EMBRYOGENEZE Mgr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU i Program přednášky: • meióza a gametogeneze • mechanismy fertilizace • časná embryogeneze • hybridi a chiméry BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 -05 / 23.3. 2 Způsoby rozmnožování eukarvot Nepohlavní rozmnožování •potomstvo geneticky identické s rodičovským organismem Pohlavní rozmnožování • původní kombinace genů zanikají a vznikají nové — každý organismus je geneticky jedinečný • kompetitivní selekční výhoda pro organismy v nepředvídatelně variabilním prostředí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 3 meióza =j\ diploidie haploide fúze gamet Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 4 MEIÓZA A GAMETOGENEZE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 5 MEIOZA • dvě po sobě jdoucí dělení: I. meiotické íheterotypické, redukční) II. meiotické íhomeotypické, ekvační) Genetický význam meiózy: •redukce počtu chromozomů při tvorbě pohlavních buněk • v gametách 2n (223 = 8.388.608) možných kombinací chromosomů (pak ještě zvýšeno crossing-overem) •párování homologických chromosomů, které umožňuje crossing-over a tím i rekombinaci genů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 6 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 7 tři páry homologních chromosomů Schéma kombinace s--S^— chromozomů v gametách / i on ocaDCa-A \N 1 Q=>1 Ccj mcmj- otcovské duplikace a nezávislé uspořádání mateřských a otcovských homologů během meiozy možné gamety Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 8 Stádia meiotického dělení • Premeiotická interfáze • Meióza I: profáze I: leptotene zygotene pachytene diplotene diakineze metafáze I, anafáze I, telofáze I • Meióza II: profáze II, metafáze II, anafáze II, telofáze II Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 10 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 11 Tvorba bivalentů a crossing-over BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 12 ChromaŤidv v průběhu Lprofáze BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 13 SvnapŤonemální komplex SYCP (svnapŤonemal complex proŤein ) 1 - 3 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 14 SvnapŤonemální komplex BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 15 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 16 Poruchy meiózv a jejich genetické důsledky a) Nerovnoměrný crossing-over • v profázi I •důsledek: delece a duplikace daného chromozomu v polovině gamet NONDISJUNCTION AT FIRST DIVISION F ir$l division StCOfld division - Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 17 Poruchy meiózv a jejich genetické důsledky b) Neoddělení (nondisjunkce) • sesterské chromatidy v anafázi II • porucha centromer nebo porucha mitotického aparátu • důsledek: aneuploidie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 18 Porovnání spermatogeneze a oogeneze Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 19 GAMETOGENEZE: SPERMATOGENEZE • primordiální zárodečná buňka (spermatogonie) (46, soustavně se mitoticky dělí) • spermatocyt I. řádu (46, probíhá meióza I.) • spermatocyt II. řádu (23, probíhá meióza II.) • spermatida (23, dozrává bez dalšího dělení) • spermie (23, uvolňují se do lumina semenných kanálků) 1 spermatogonie — — 4 haploidní rovnocenné spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 -05 /23.3. 20 Průběh spermatogeneze Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 21 Morfologie spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 22 GAMETOGENEZE: OOGENEZE • primordiální zárodečná buňka (46, mitotické dělení) • oogonium (46, mitóza, ve 3.měsíci po oplození vývoj v oocyty) 7 [ počet zárodečných i buněk v ovariu , , během života Months before Years after birth conception Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 23 GAMETOGENEZE: OOGENEZE • oocyt I. řádu (46, začne meióza I, zastavení v profázi ještě před narozením............při dozrávání se dělící vřeténko přesunuje k periferii buňky - nerovnoměrné dělení) • oocyt II. řádu (+ pólocyt) (23, vstupuje do meiózy II, zastavení v metafázi II.) •ovum (+ pólocyt) (23, meióza dokončena v případě oplození) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 24 Průběh oogeneze Oogenesis (Figuře 42.14) Primordial germ cells Oogonium ifi\\ Oogoniu viv (diploid) Primary oocyle Resting state -—■-/■--- Secondary f^'k t\-\ llU'iftii division oocyte 1 ( \ I First polar body Second meiotic division Second polar body Ootid {haploid} Ovum (haploid) Corpus luteum Frimury oocyte Ruptured follicle Secondary oocyte Mature follicle Ovule Hon (b) 1 oogonium — 1 zralé vajíčko + 2-3 pólocyty -Primary follicle Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 25 Stádia folikulu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 26 REGULACE OOGENEZE 1. regulační bod = diplotene meiózy I • dlouhodobé zablokování buněčného cyklu (u člověka až 50 let); u některých živočišných druhů až do fertilizace • dekondenzace chromosomů, transkripční aktivita (akumulace materiálu pro časnou embryogenezi) • hormonální stimulace (LH) — Cdkl/cyklin B (MPF) — kondenzace chromosomů, rozpad jaderné membrány, formování spindlu • anaphase-promoting complex - spouští anafázi •pouze částečná deaktivace Cdk1 přetrvávající M-fáze (kondenzovaný chromatin, bez jaderné membrány) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 27 REGULACE OOGENEZE 2. regulační bod = metafáze meiózy II • u většiny obratlovců až do fertilizace • po cytokinezi I.meiózy - zvýšení aktivity MPF • anaphase-promoting komplex syntetizován až po fertilizaci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 28 MECHANISMY FERTILIZACE BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 29 Kontakt spermie a oocytu • 300 miliónů spermií v ejakulátu — 200 spermií v místě fertilizace ve vejcovodu • chemoatraktanty uvolňované folikulárními buňkami Kapacitace •5-6 hodin (člověk) •změny lipidů a glykoproteinů plazmatické membrány (ztráta cholesterou ->zvýšení fluidity) •HCO3- — aktivace adenylátcyklázy — syntéza cAMP indukce změn podmiňujících kapacitaci • zvýšení metabolismu a pohyblivosti spermie •vzrůst membránového potenciálu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 -05 /23.3. 31 Zona pellucida • extracelulární matrix oocytu (specifické složení) • 3 typy glykoproteinů (ZP2+ZP3, ZP1) • bariéra mezidruhové fertilizace • ZP3 - receptor druhově specifické vazby Akrosomální reakce • obsah akrosomu uvolněn exocytózou • indukce zvýšením koncentrace Ca2+ v cytoplazmě spermií - vazba na ZP3 • hydrolytické enzymy — průchod zonou pellucidou • vazba membránových proteinů spermie na ZP2 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 32 Průběh fertilizace změna konc. Ca2 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 33 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 34 Mechanismy blokující polyspermii •primární blok: depolarizace plazmatické membrány oocytu po fúzi s první spermií • sekundární blok - kortikální reakce oocytu: uvolnění obsahu kortikálních granulí — enzymy měnící vlastnosti zony pellucidy (štěpení ZP2, hydrolýza cukerných zbytků na ZP3) • intracelulární zvýšení koncentrace Ca2+ (vede k dokončení II. dělění) Důsledky polyspermie: více centriolů — multipolární spindl — porucha segregace chromosomů — nondisjunkce aneuploidie — zástava vývoje —> Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 35 Mechanismus fúze spermie a oocytu •u většiny druhů nejasný Fertilin • transmembránový protein spermií (myš) • vazebné domény pro integriny oocytu, fúzogenní oblast Fúze prvoiader • u nižších živočichů ihned po fúzi gamet •u savců pouze prostorové přiblížení prvojader • syntéza DNA odděleně • přiblížení prvojader pomocí MT z centriolu spermie zona'peiiucida • rozpad jaderných membrán až při prvním mitotickém dělení zygoty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 -05 /23.3. 36 ČASNÁ EMBRYOGENEZE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 37 Časná embryogeneze u obojživelníků: • velmi krátký buněčný cyklus (30 min) • zmenšování objemu dceřinných buněk Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 38 Časná embryogeneze u obojživelníků: • velmi krátký buněčný cyklus (30 min) • zmenšování objemu dceřinných buněk Unfertilized egg Fertilized egg Midhleatuli Earřy gastrula Lata g w tru 11 44jDEK> ccifs, 7 hours) iaO/fjcw culls. 3 houish 112 hours] Animal Pigmented Sfwnm Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 39 Časná embrvoaeneze u savců: •zygotg •morula (8, resp. 16 buněk = blastomerv) • blastocvsta (trofoektoderm, inner cell mass = ICM, blastocoel, zona pelucida) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 40 Průběh časné embryogeneze u myši E0.5 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 41 Průběh časné embryogeneze u člověka day 2 F ^^/»*** &gjtfCůnS5cf*heterozygot • z taxonomického pohledu potomek vzniklý z křížení mezi 2 jedinci odlišného taxonu ■ ■ ■ ■ ■ v rámci druhu (poddruhy)-tygr bengálsky x sibiřský mezi druhy - tygr x lev mezi rody - ovce x koza mezi čeleděmi - výjimečně mezi řády - u živočichů není známo Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 46 MEZIDRUHOVY HYBRID • křížení v rámci rodu • potomek fenotypově podobný rodičům • často infertilní (různý počet chromosomů) • odlišnosti v námluvních rituálech, páření a chování ^ jiná sezóna páření • antigenní reakce na spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 47 mul, mezek (63 chr.) osel (62 chr.) x kůň (64 chr.) klisna x osel oslice x hřebec Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 48 zeedonk, zonkey osel (62 chr.) x zebra (32- 46 chr.) 49 liger, tigon lev (38 chr.) x tygr (38 chr.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 50 MEZIRODOVÝ HYBRID ■ -vr v r ■■■v r ■ |o křížení odlišných rodů Vi V f mm V f f m m Mmmm m f ■ ^ přirozeně výjimečný výskyt (Toast of Botswana) možnost (nutnost) asistované inseminace (cama) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 51 „Toast of Botswana" (57 chr.) r.2000 ovce (54 chr.) x koza (60 chr.) odliš Geep = chiméra cama velbloud (74 chr.) x lama (74 chr.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 -05 /23.3. 53 CHIMÉRA řecky Xíuaipa (Chímaira); latinsky Chimaera Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 -05 /23.3. 54 CHIMÉRA organismus obsahující alespoň 2 geneticky odlišné buněčné populace původem z odlišných zygot Vznik: •ze 4 buněk- dvě zygoty (tetragametická ch.) •ze 3 buněk - (partenogenetická ch.) • transplantací kostní dřeně (přenos kmenových buněk) •spojením cévních oběhů (anastomózy) u dvojvaječných dvojčat • z časného embrya a diploidních buněk (fůzí, injekcí) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 55 Tetragametický chimerismus • vrozený chimerismus - u lidí výjimečně (běžné u primátů) • spojením dvou zygot (časných embryí) • riziko i při asistované reprodukci • organismus obsahuje dvě odlišné sady chomozomů • orgány a tkáně mají jiný původ • viditelné rozdíly: barva očí, vlasů, „Hitchhiker's thumb„ (AR), Blaschkovy linie, pohlaví může být hermafroditní (46,XX/46,XY), 2 populace krvinek (imunologická tolerance obou skupin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 56 Hitchhiker's thumb Blaschkovy linie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 57 Tetragametický chimerismus / \ AlpY J í AlmXlm i n=23 n=23 _j / 46,XlmY \ AlpAlm Spz Oocytes y 46,X2mXp / \ A2p Xp j f A2m X2m J ''. A2pA2m / n=23 n=23^^—^ Zygote 2n=46 Bi8l20 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 58 Partenogenetický chimerismus • oocyt podléhá partenogenezi a rozdělí se • vznik 2 haploidních buněk • oplozeny 2 spermiemi Zygote 2n=46 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 59 Androgenetický chimerismus •standardní fertilizace oocytu spermií (23,X) • vznik sekundárního polárního tělíska • endoreplikace parentálního prvojádra • vznik 1 diploidní buňky (46,XX) a lhaploidní (23,X) • haploidní buňka podléhá endoreplikaci ->androgenetická linie Diploidization of the paternal genome and mitotic division of the biparentaJ cell Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 60 VYUŽITÍ CHIMÉR VE VÝZKUMU • studium vývoje savčího embryogeneze • overení podílu kmenových buněk na vývoji embryc • tvorba „nových druhů" • medicínský význam • příprava agregačně injikačně Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 61 D9,5 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 62 Original Article Leukemia (2006) 20, 357-369, doi: 10.1033/sj,leu.2404171; published online 23 February 2006 A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4+SSEA-l+Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow M Kucia-, R RGca=j F R Campbalh., E Zuba-Surma-j M Majka-, J Ratajczak- and M Z Ratajczak- *Stem Cell Biology Program at James Graham Brown Cancer Center, University of Louisville, Louisville, KYj USA '. :-i i 6 ? pendente : Professor MZ Ratajczak, Stem Cell Biology Program, James Graham Brown Cancer Center, University of Louisville, Louisville, KY 40202, USA, E-mail: mzrataOllJSlouisville. edu Pecetved 2? January 2006; Accepted 10 February 2006; Published online 23 February 2006, počet: cca 0,02% BM MNC definice: Sca-1 + (stem cell antigen-marker HSC) lin- (lineage-negative) CD45- (Leukocyte Common Antigen) exprimují: SSEA-1, Oct-4, Nanog, Rex-1 velikost: 2-4 um schopnost diferenciace do různých linií 3 zárodečných vrstev Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 63 Schéma experimentu VSEL (GFP+) 65 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 67 Chiméry: tvorba „nových druhů" geep (kovce?) chiméra kozy a ovce (ne hybrid) poprvé v roce 1978 Austrálie, Dr R.S. White Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 68 Chiméry: medicínský význam Výzkum krvetvorby a krevních chorob: • hematopoetické kmenové b. z lidských fetálních jater • intraperitoneální injekce do fetu ovce • lymfoidní prekurzory přetrvávaly až 3,5 roku po transplantaci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 69 Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep Graca Almeida-Porad a, Christopher D. Porada, Jason Chamberlain, AliTorabi, and Esmail D. Zanjani We took advantage of the proliferative and permissive environment of the developing preimmune fetus to develop a noninjury large animal model in sheep, in wh i ch th e tra n spl antatio n of def i ne d po p u -lat ions of human hematopoietic stem cells resulted in the establishment of human hematopoiesis and led to the formation of significant numbers of long-lasting, functional human liver cells, with some animals exhibiting levels as high as 20% of donor (human) hepatocytes 11 months after transplantation, A direct correlation was found between hepatocyte activity and phenotype of transplanted cells, cell dose administered, source of cells used on a cell-per-cell basis (bone marrow, cord blood, mobilized peripheral blood), and time after transplantation. Human hepatocytes generated in this model retained functional properties of normal hepatocytes, constituted hepatic functional units with the presence of human endothelial and biliary duct cells, and secreted human albumin that was detected in circulation. Transplanting popu- lations of hematopoietic stem cells can efficiently generate significant numbers of functional hepatic cells in this noninjury large animal model and thus could be a means of ameliorating or curing genetic diseases in which a deficiency of liver cells or their products threatens the life of the fetus or newborn. (Blood. 20D4;irj4: 2582-2590) g 2004 by The America n Soci ety of Hematology Figure 1. Adult human HSCs generate significant numbers of hepatocytes in a noninjury fetal model. (A) Control sheep iver section (nontransplantedi stained witti an antibody antihunian hepatocyte (clone QCH1E5) as described in 'Materials and methods." (B-C) Livei sections obtained at 3 weeks {B) and 4 mon1ti3 (C) after transplantation from sieep that received transplanted hunian BM CDM^Lin" cells, stained with the same antibody showing a higher number of human hepatocytes in the latter {C}. (D) Liver section obtained at 11 months after transplantation from sheep that received transplanted CB-derived CD34"Lin" cells, stained with antihunian hepatocyte antibody. Human hepatocytes in all sections can be identified by the dark brown coloration. BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 70 Nature Medicine 9, 53 - 60 (2002) Published online: 23 December 2002; | doi: 10.1038/nmS12 Huinmi and porcine early kidney precursors as a new source for transplantation Benjamin Dekel1, Tatyana Burakova1, Fabian D. Arditti1, Shlornit Reich-Zeliger1, Oren Milstein1, Sarit Aviel-Ronen3, Gideon Rechavi3' 4, Nir Friedman5, Naftali Kaminski3, Justen H, Passwell^ 8t Yair Reisner"*" k ■ ' I I r o Náhrada orgánů • prekurzorové ledvinové b. z lidské fetální tkáně • transplantace do myšího embrya • diferenciace ve funkční nefrony a podpůrné tkáně • tvorba miniaturního funkčního orgánu - produkce moči Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 71 Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues Takashi Yokoo*+*, Toya Ohashi+&, Jii Song Sh*n+, Ken Sakurai^, Yokhi Miyazaki**, Yasunori Utiunomiya*, Masanori Takahashi11, Yoihio Terada, Yoshikstiu Eto+^ Tetsuya Kawamura *, Noriko Osuinii11, and Tatsuo Hoioya Departments of -Internal Medicine and Gene Therapy and ^pediatrics, tlnstltute of DNA Medicine, Jlkel University School of Medicine, 3-iS-e, Nlshl-shlmbashl, Mlnato-ku, Toky:- 1C'5-C461, Japan: 'division of Developmental Neunosclence, Tohoku University Graduate School of Medicine, 2-1, Selryo-macrU Aoba-ku, Sendal 9Ei-6575, Japan: and Department of Homeostasis. Medicine and Nephrology Tokyo Medical and Dental University, 5-45 Yushlma 1-chorne, Bunkyo-ku, Tokyo 113-6519, Japan Edited by Erkkl Ruoslahtl, The Bum ha rn Institute, La Jolla, CA, and approved January 4, 2005 (received for review September 16,2004) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 72 Development of functional human embryonic stem cell-derived neurons in mouse brain Alyiion FL Muotri*+r Kinkhi Nalushlrru*4* Nkolas Toni\ Vladislav M, Sandler *r and Fred H.Gage*5 'Laboratory of Genetics, The Salk 1 nstrtute for Biological Studies, 10010 North Torrey Pines Road, La Jolla, ca 92037; and laboratory of Molecular Neurosclence, Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of Science a nd Tec hnology. 6916-5 Takayama, I korna 630-0101, Japan Contributed by Fred H. Gage, October 27,2005 IMĚÍffiaFP ' Cortex _ d ií IIBGFP Thalamus — Výzkum neurodegenerativních chorob: • hESCs implantovány do myšího fetálního mozku • diferenciace ve funkční linie neurálních buněk Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 73 2 dny po injekci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 05 / 23.3. 74